專利名稱：：一種能夠維護(hù)酶標(biāo)記物溶液高穩(wěn)定性的稀釋液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新型酶標(biāo)記物的稀釋液，用該稀釋液配制酶標(biāo)記物溶液，能有效的維護(hù)酶標(biāo)記物在儲(chǔ)存和使用中的穩(wěn)定性，充分滿足體外診斷試劑盒的質(zhì)量要求。同時(shí)還涉及該酶標(biāo)記物的稀釋液的制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
：利用標(biāo)記抗原或抗體的免疫分析技術(shù)，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的一個(gè)體外超微量分析技術(shù)，可準(zhǔn)確地測出10-9—10-15g的微量物質(zhì)，從而解決了其他方法無法解決的問題，極大的推動(dòng)了生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的各項(xiàng)研究工作和臨床檢驗(yàn)的快速發(fā)展，為人類的科學(xué)進(jìn)步和健康事業(yè)作出了非凡的貢獻(xiàn)。這類分析方法自1959年yalow等人發(fā)明放射免疫分析(Radioimmunoassay，RIA)并在全世界范圍內(nèi)得到廣泛推廣以來(此技術(shù)的發(fā)明使yalow等人獲諾貝爾獎(jiǎng))，現(xiàn)已開發(fā)了多種免疫分析方法，已得到實(shí)際應(yīng)用的有酶聯(lián)免疫分析(Enzymeimmunoassay,EIA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemiluminescencei畫noassay，CLIA)、日寸間分辨熒光免疫分析(Time-resolvedfluoroimraunoassay，TR-FIA)等，應(yīng)用這些方法已開發(fā)出大量商用藥盒(Kit),廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、腫瘤學(xué)、生殖生理學(xué)、血液學(xué)、遺傳學(xué)等醫(yī)學(xué)和生物學(xué)各科的臨床和科研工作中，而且在飲食業(yè)，環(huán)保和刑事偵破中也發(fā)揮出十分重要的鑒定作用，其用途幾乎涉及到人類生存和發(fā)展的各個(gè)重大領(lǐng)域。體外診斷試劑盒得以普及應(yīng)用有賴于它的高質(zhì)量，而穩(wěn)定性則是重要的質(zhì)量指標(biāo)之一，它保證了試劑盒在規(guī)定的有效期內(nèi)測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。有效期長則有利于推廣應(yīng)用。試劑盒是由檢測所需要的各種試劑組成的，主要的有下面幾種(1)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)某種血清超微量物質(zhì)進(jìn)行定性測定，需要有標(biāo)準(zhǔn)參照物；進(jìn)4行定量測定，還要有系列已知量的參照物作為標(biāo)準(zhǔn)。(2)HRP標(biāo)記的標(biāo)記物該物既參與免疫反應(yīng)，又是促使化學(xué)發(fā)光物產(chǎn)生光信號(hào)的物質(zhì)，是檢測靈敏度的關(guān)鍵試劑之一。(3)固相試劑既參與免疫反應(yīng)，又是反應(yīng)后的分離劑。(4)化學(xué)發(fā)光底物溶液當(dāng)免疫反應(yīng)完成并分離后，加入此溶液，將產(chǎn)生可測光信號(hào)。(5)緩沖液免疫反應(yīng)中調(diào)節(jié)溶液的pH值，并作為稀釋液用。(6)洗液分離后用于洗去殘留的未結(jié)合的標(biāo)記物，以減小非特異光信號(hào)。由于試劑盒由多種試劑組成，其影響穩(wěn)定性的因素很多，總的來說有環(huán)境因素和試劑本身的因素。本發(fā)明只涉及酶標(biāo)記物溶液的穩(wěn)定性，這里的穩(wěn)定性主要是指酶標(biāo)記物在儲(chǔ)存期間活性的保存。這里的酶標(biāo)記物是指辣根過氧化物酶(HRP)和抗體(Ab)的偶聯(lián)物，它包含兩部分，因而在免疫分析中起著兩種作用，抗體與相應(yīng)的抗原發(fā)生免疫結(jié)合，而酶則催化底物(過氧化氫)，稀釋液的穩(wěn)定作用就是保存抗體的免疫反應(yīng)活性和酶的催化活性。辣根過氧化物酶是從辣根植物中提取的，其分子由主酶糖蛋白和輔酶正鐵血紅素K兩部分組成，催化活性位點(diǎn)在輔酶上，而與抗體的偶聯(lián)發(fā)生在主酶，故偶聯(lián)不影響酶的催化活性。要保持催化活性穩(wěn)定就要使輔酶不受損害。同時(shí)，主酶與抗體偶聯(lián)，也需保證酶分子的完整性；輔酶對(duì)光尤其是紫外線敏感，要使在儲(chǔ)存和免疫分析中避免光線的破壞。抗體是球蛋白，十分嬌氣，很多物理因素和化學(xué)因素都可引起蛋白質(zhì)變性，在稀溶液狀態(tài)下也易失去活性。目前不少體外診斷試劑盒產(chǎn)品常使用濃縮冷藏的酶標(biāo)記物，濃縮的酶標(biāo)記物相當(dāng)穩(wěn)定，常加入3040%甘油于-l(TC下保存，但這需要用戶通過復(fù)溶或稀釋的辦法自行自備工作液，這不僅增加了用戶的工作量，而且可能也會(huì)造成新的操作誤差；同時(shí)通過簡單的稀釋后的酶標(biāo)記物也只能現(xiàn)配現(xiàn)用，保存期限較短，給研究工作帶來很大不便；由于在使用和保存過程中不可避免的需要將濃縮的酶標(biāo)記物反復(fù)凍融，因此為了解決酶標(biāo)記物穩(wěn)定性問題，提高體外診斷試劑盒的質(zhì)量，進(jìn)行高穩(wěn)定性的酶標(biāo)記物溶液稀釋液的研究很有必要。目前的酶標(biāo)記物溶液稀釋液大都包括緩沖液系統(tǒng)(如PBS磷酸鹽緩沖液)和BSA(牛血清白蛋白)，或PBS-tween20等，這些稀釋液只是基礎(chǔ)的稀釋液，還存在稀釋后需要在12小時(shí)內(nèi)馬上用完的問題，對(duì)酶標(biāo)記物并不能起到最大限度的保護(hù)作用，不方便實(shí)驗(yàn)的開展；同時(shí)還有部分體外診斷試劑盒中直接有酶標(biāo)記物稀釋液，但出于商業(yè)原因等并未給出其具體組成成分，給體外診斷試劑盒的廣泛應(yīng)用帶來了不便。基于以上原因，本發(fā)明對(duì)能夠維護(hù)酶標(biāo)記物溶液高穩(wěn)定性的稀釋液進(jìn)行了一系列探索研究，以期為試劑盒商品化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)，同時(shí)為其它試劑盒的研制提供方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能夠維護(hù)酶標(biāo)記物溶液高穩(wěn)定性的稀釋液，這里的穩(wěn)定性是指酶標(biāo)記物在儲(chǔ)存期間活性的保存。本發(fā)明的目的還在于提供一種能夠維護(hù)酶標(biāo)記物溶液高穩(wěn)定性的稀釋液的制備方法及其用途。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的-一種能夠維護(hù)酶標(biāo)記物溶液高穩(wěn)定性的稀釋液，其特征在于該稀釋液由緩沖液、蛋白基質(zhì)溶液、氨基酸溶液、糖溶液、特效添加劑和防腐劑組成，其中緩沖液選用磷酸鹽緩沖液、Tris-Hcl緩沖液、巴比妥緩沖液或硼酸鹽緩沖液；蛋白基質(zhì)溶液選用牛血清、羊血清或兔血清，或用牛血清白蛋白、酪蛋白、水解明膠、魚皮膠、可溶性植物蛋白配制；氨基酸溶液選用復(fù)合氨基酸，由0.050.3M的甘氨酸、0.050.3M的賴氨酸和O.050.3M的精氨酸組成；糖溶液由質(zhì)量百分比為0.12%的木糖、0.12%的葡糖胺和0.12%的蔗糖組成；特效添加劑由質(zhì)量百分比為0.12%植物提取液、0.110%鼠血清、0.12%葡萄糖酸鉀、0.050.1%辛酸鈉和0.050.1%吐溫-20組成；防腐劑PROCLIN300診斷試劑防腐劑或慶大霉素。本發(fā)明的目的還可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)所述的植物提取液為蘆薈提取液。所述的稀釋液為酶標(biāo)記單克隆抗體的稀釋液，其中緩沖液選用0.010.1MPH7.2PBS磷酸鹽生理鹽水緩沖液；蛋白基質(zhì)溶液選用質(zhì)量百分比為550%小牛血清；氨基酸溶液選用復(fù)合氨基酸，由0.050.3M的甘氨酸、0.050.3M的賴氨酸和0.050.3M的精氨酸組成；糖溶液由質(zhì)量百分比為0.12%的木糖、0.12%的葡糖胺和0.12%的蔗糖組成；特效添加劑由質(zhì)量百分比為0.12%植物提取液、0.110%鼠血清、0.12%葡萄糖酸鉀、0.050.1%辛酸鈉和0.050.1%吐溫-20組成；防腐劑質(zhì)量百分比為0.050.1%PR0CLIN300診斷試劑防腐劑。本發(fā)明能夠維護(hù)酶標(biāo)記物溶液高穩(wěn)定性的稀釋液的制備方法為首先在0.05Mra7.2PBS磷酸鹽生理鹽水緩沖液中加入0.05%PROCLIN300診斷試劑防腐劑和1%的木糖、葡糖胺和蔗糖及0.1M的甘氨酸、賴氨酸和精氨酸，溶解后混勻；再加入1%蘆薈提取液、5%鼠血清、1%葡萄糖酸鉀、0.05%辛酸鈉和0.05%吐溫-20;最后加進(jìn)20%小牛血清，混勻即可。此外，本發(fā)明能夠維護(hù)酶標(biāo)記物溶液高穩(wěn)定性的稀釋液具體用途為在乙肝'兩對(duì)半，的檢測中，用作酶標(biāo)記物Anti-HBs-HRP、Anti-HBe-服P及Anti-HBc-HRP的稀釋液，用以檢測乙型肝炎病毒表面抗原、乙型肝炎病毒e抗原、乙型肝炎病毒e抗體、乙型肝炎病毒核心抗體中的應(yīng)用。本發(fā)明的能夠維護(hù)酶標(biāo)記物溶液高穩(wěn)定性的稀釋液，是根據(jù)抗體蛋白和酶蛋白的特點(diǎn)而研究出的一種新型酶標(biāo)記物的稀釋液，用該稀釋液配制酶標(biāo)記物溶液，能有效的維護(hù)酶標(biāo)記物在儲(chǔ)存和使用中的穩(wěn)定性，充分滿足體外診斷試劑盒的質(zhì)量要求。它7通過在現(xiàn)有技術(shù)的酶標(biāo)記物稀釋液中增加了新的有效成分，提高了保護(hù)酶標(biāo)記物的能力，經(jīng)試驗(yàn)本發(fā)明酶標(biāo)記物稀釋液，能使酶標(biāo)記物更加穩(wěn)定，在37"C下可保存一周以上。它可以直接用于制備體外診斷試劑盒，滿足日益增大的體外診斷試劑盒的市場需求。具體實(shí)施例方式本發(fā)明能夠維護(hù)酶標(biāo)記物溶液高穩(wěn)定性的稀釋液是由多種物質(zhì)組成的透明溶液，組方中的主要內(nèi)容是緩沖液系統(tǒng)，可用磷酸鹽緩沖液、Tris-Hcl緩沖液、巴比妥緩沖液、硼酸鹽緩沖液等；蛋白基質(zhì)溶液，可用適量濃度的牛血清、羊血清、兔血清等，也可用牛血清白蛋白、酪蛋白、水解明膠、魚皮膠、可溶性植物蛋白等配制；氨基酸及糖溶液，用必要的氨基酸和糖配制；特效添加劑，含光敏抑制劑、標(biāo)記物分子保護(hù)劑、環(huán)境維護(hù)劑等；防腐劑PR0CLIN300診斷試劑防腐劑、慶大霉素等。稀釋液中采用的原料均為市售。實(shí)施例1酶標(biāo)記單克隆抗體的稀釋液緩沖液系統(tǒng)采用0.010.1MPH7.2PBS(磷酸鹽生理鹽水緩沖液)；蛋白基質(zhì)溶液550%小牛血清；氨基酸及糖溶液復(fù)合氨基酸，主要是0.050.3M的甘氨酸、賴氨酸、精氨酸；0.12%的木糖、葡糖胺、蔗糖；特效添加劑0.12%植物提取液，0.110%鼠血清，0.12%葡萄糖酸鉀，0.050.ly。辛酸鈉；0.050.1%吐溫-20;防腐劑0.050.1%PROCLIN300診斷試劑防腐劑；稀釋液制備方法如下在0.05MPH7.2PBS中加入0.05%PR0CLIN300診斷試劑防腐劑和1%的木糖、1%的葡糖胺和1%的蔗糖及0.1M的甘氨酸、0.1M的賴氨酸和0.1M的精氨酸，溶解后混勻，再加1%蘆薈提取液，5%鼠血清，1%葡萄糖酸鉀，0.05%辛酸鈉和0.05%吐溫-20;最后加進(jìn)20%小牛血清，混勻即可。其中蘆薈提取液可以由市購的蘆薈素結(jié)晶配制，鼠血清也可以市購。該稀釋液在乙肝'兩對(duì)半，的檢測中，可用作酶標(biāo)記物Anti-HBs-HRP、Anti-HBe-HRP及Anti-HBc-HRP的稀釋液，用以檢測乙型肝炎病毒表面抗原、乙型肝炎病毒e抗原、乙型肝炎病毒e抗體、乙型肝炎病毒核心抗體。把稀釋液配方中的鼠血清變換一下可用作酶標(biāo)記物HBsAg-朋P的稀釋液，用以檢測乙型肝炎病毒表面抗體。該稀釋液原則上也可直接用于其它單克隆抗體的酶標(biāo)記物，稍作變換也可用作其它酶標(biāo)記物的稀釋液。此外，體外診斷試劑社會(huì)需要量大，僅國內(nèi)一年就有幾十億的市場，而本發(fā)明的酶標(biāo)記物稀釋液可直接用于制備體外診斷試劑盒，具有較大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明的酶標(biāo)記物的稀釋液中，增加了新的有效成分，提高了保護(hù)酶標(biāo)記物活性的能力；能使酶標(biāo)記物更加穩(wěn)定，經(jīng)試驗(yàn)在37'C下可保存一周以上。以Anti-HBs-服P為例，用緩沖液加BSA等的稀釋液(1)和本發(fā)明的稀釋液(2)配制，其穩(wěn)定性相差顯著，見下表。不同稀釋液的標(biāo)記物的穩(wěn)定性比較<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>說明根據(jù)《中國生物制品檢定規(guī)程》(2000年版)的規(guī)定，采用加速破壞試驗(yàn)來考核穩(wěn)定性，即將其在37。C下放置3天，相當(dāng)于28'C下儲(chǔ)存6個(gè)月。檢驗(yàn)時(shí)，將兩種稀釋液配制的標(biāo)記物封好，放入37。C恒溫培養(yǎng)箱中，連續(xù)保溫7天，從第3天起每天檢測其活性。表中所列為RLU(相對(duì)發(fā)光值)，與保溫前相比，此值下降的越多，說明穩(wěn)定性越差。權(quán)利要求1、一種能夠維護(hù)酶標(biāo)記物溶液高穩(wěn)定性的稀釋液，其特征在于該稀釋液由緩沖液、蛋白基質(zhì)溶液、氨基酸溶液、糖溶液、特效添加劑和防腐劑組成，其中緩沖液選用磷酸鹽緩沖液、Tris-Hcl緩沖液、巴比妥緩沖液或硼酸鹽緩沖液；蛋白基質(zhì)溶液選用牛血清、羊血清或兔血清，或用牛血清白蛋白、酪蛋白、水解明膠、魚皮膠、可溶性植物蛋白配制；氨基酸溶液選用復(fù)合氨基酸，由0.05～0.3M的甘氨酸、0.05～0.3M的賴氨酸和0.05～0.3M的精氨酸組成；糖溶液由質(zhì)量百分比為0.1～2％的木糖、0.1～2％的葡糖胺和0.1～2％的蔗糖組成；特效添加劑由質(zhì)量百分比為0.1～2％植物提取液、0.1～10％鼠血清、0.1～2％葡萄糖酸鉀、0.05～0.1％辛酸鈉和0.05～0.1％吐溫-20組成；防腐劑PROCLIN300診斷試劑防腐劑或慶大霉素。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述能夠維護(hù)酶標(biāo)記物溶液高穩(wěn)定性的稀釋液，其特征在于.-所述的植物提取液為蘆薈提取液。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述能夠維護(hù)酶標(biāo)記物溶液高穩(wěn)定性的稀釋液，其特征在于所述的稀釋液為酶標(biāo)記單克隆抗體的稀釋液，其中.-緩沖液選用0.010.1MPH7.2PBS磷酸鹽生理鹽水緩沖液；蛋白基質(zhì)溶液選用質(zhì)量百分比為550%小牛血清；氨基酸溶液選用復(fù)合氨基酸，由0.050.3M的甘氨酸、0.050.3M的賴氨酸和0.050.3M的精氨酸組成；糖溶液由質(zhì)量百分比為0.12%的木糖、0.12%的葡糖胺和0.12%的蔗糖組成；特效添加劑由質(zhì)量百分比為0.12%植物提取液、0.110%鼠血清、0.12%葡萄糖酸鉀、0.050.1%辛酸鈉和0.050.1%吐溫-20組成；防腐劑質(zhì)量百分比為0.050.1%PR0CLIN300診斷試劑防腐劑。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述能夠維護(hù)酶標(biāo)記物溶液高穩(wěn)定性的稀釋液，其特征在于所述的植物提取液為蘆薈提取液。5、根據(jù)權(quán)利要求3或4所述能夠維護(hù)酶標(biāo)記物溶液高穩(wěn)定性的稀釋液，其特征在于其中緩沖液選用0.05MPH7.2PBS磷酸鹽生理鹽水緩沖液；蛋白基質(zhì)溶液選用質(zhì)量百分比為20%小牛血清；氨基酸溶液選用復(fù)合氨基酸，由0.1M的甘氨酸、0.1M的賴氨酸和0.1M的精氨酸組成；糖溶液由質(zhì)量百分比為1%的木糖、1%的葡糖胺和1%的蔗糖組成；特效添加劑由質(zhì)量百分比為1%蘆薈提取液、5%鼠血清、1%葡萄糖酸鉀、0.05%辛酸鈉和0.05°/。吐溫-20組成；防腐劑質(zhì)量百分比為0.05%PR0CLIN300診斷試劑防腐劑。6、權(quán)利要求5所述的能夠維護(hù)酶標(biāo)記物溶液高穩(wěn)定性的稀釋液的制備方法，其特征在于首先在0.05MPH7.2PBS磷酸鹽生理鹽水緩沖液中加入0.05%PR0CLIN300診斷試劑防腐劑和1%的木糖、葡糖胺和蔗糖及0.1M的甘氨酸、賴氨酸和精氨酸，溶解后混勻；再加入1%產(chǎn)薈提取液、5%鼠血清、1%葡萄糖酸鉀、0.05%辛酸鈉和0.05%吐溫-20;最后加進(jìn)20。/。小牛血清，混勻即可。7、權(quán)利要求5所述的能夠維護(hù)酶標(biāo)記物溶液高穩(wěn)定性的稀釋液在乙肝'兩對(duì)半，的檢測中，用作酶標(biāo)記物Anti-HBs-服P、Anti-HBe-HRP及Anti-HBc-HRP的稀釋液，用以檢測乙型肝炎病毒表面抗原、乙型肝炎病毒e抗原、乙型肝炎病毒e抗體、乙型肝炎病毒核心抗體中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種能夠維護(hù)酶標(biāo)記物溶液高穩(wěn)定性的稀釋液，同時(shí)還涉及該稀釋液的制備方法及其用途。該稀釋液由緩沖液、蛋白基質(zhì)溶液、氨基酸溶液、糖溶液、特效添加劑和防腐劑組成。本發(fā)明是根據(jù)抗體蛋白和酶蛋白的特點(diǎn)而研究出的一種新型酶標(biāo)記物的稀釋液，用該稀釋液配制酶標(biāo)記物溶液，能有效的維護(hù)酶標(biāo)記物在儲(chǔ)存和使用中的穩(wěn)定性，經(jīng)試驗(yàn)本發(fā)明酶標(biāo)記物稀釋液，在37℃下可保存一周以上，可充分滿足體外診斷試劑盒的質(zhì)量要求。它可以直接用于制備體外診斷試劑盒，滿足日益增大的體外診斷試劑盒的市場需求。文檔編號(hào)G01N33/576GK101561432SQ20091014363公開日2009年10月21日申請(qǐng)日期2009年5月27日優(yōu)先權(quán)日2009年5月27日發(fā)明者高淑舫申請(qǐng)人:福建省洪誠生物藥業(yè)有限公司