熱穩(wěn)定酶及其產(chǎn)生和使用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于增強(qiáng)酶活性、半衰期和/或熱穩(wěn)定性的組合物和方法。本發(fā)明還提供了包括增強(qiáng)的酶的組合物和方法。本發(fā)明還提供了與改良的諸如果膠酸裂合酶的果膠分解酶相關(guān)的方法和組合物，所述改良的果膠分解酶表現(xiàn)出增強(qiáng)的活性、熱穩(wěn)定性和/或較長的半衰期。
【專利說明】熱穩(wěn)定酶及其產(chǎn)生和使用方法
[0001]背景
[0002]用于食品加工的商業(yè)酶制劑一般包含果膠酸裂合酶成分，該組分催化導(dǎo)致食品的品質(zhì)改良的化學(xué)反應(yīng)。因?yàn)槊钢苿┛赡馨ㄔ醋杂糜诋a(chǎn)生該酶的微生物的組分，在食品加工過程中尤其要考慮無菌性。
[0003]通常，高溫可提供滅菌作用。然而，提供滅菌作用的高溫可能導(dǎo)致酶變性。結(jié)果酶的活性可能降低或喪失
[0004]概述
[0005]本文提供了與具有增強(qiáng)的活性、半衰期和/或熱穩(wěn)定性相關(guān)的酶的組合物和方法。
[0006]在一些方面，提供了酶組合物。在一些實(shí)施方案中，酶組合物包括至少一種包含磷灰石部分的納米顆粒，和至少一種酶，所述酶與納米顆?；蛄谆沂糠只蛞陨隙呦嘟佑|。在一些實(shí)施方案中，磷灰石部分包括羥磷灰石。在一些實(shí)施方案中，納米顆粒包括具有約50nm至約200nm的直徑的磷灰石部分。
[0007]在一些實(shí)施方案中，酶包括果膠分解酶。在一些實(shí)施方案中，果膠分解酶包括以下中的一種或多種:果膠酸裂合酶、果膠裂合酶、聚半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸裂解酶、果膠酯酶、果膠酶和內(nèi)切型果膠酸裂合酶。在一些實(shí)施方案中，酶是果膠酸裂合酶、果膠裂合酶、聚半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸裂解酶、果膠酯酶、果膠酶、內(nèi)切型果膠酸裂合酶，或其組合。
[0008]在一些實(shí)施方案中，酶來源于微生物，比如細(xì)菌或真菌。例如，在一些實(shí)施方案中，酶從以下中的一種或多種中來純化:芽孢桿菌屬物種(Bacillus sp.)、曲霉菌屬物種(Aspergillus sp.)、青霉菌屬物種(Penicillium sp.)、核盤菌屬物種(Sclerotiniasp.)、韌革菌屬物種(Stereum sp.)、歐文氏菌屬物種(Erwinia sp.)、無枝酸菌屬物種(Amycolata sp.)、耶爾森氏菌屬物種(Yersinia sp.)、鐮刀菌屬物種(Fusarium sp.)、假單胞菌屬物種(Pseudomonas sp.)、鏈霉菌屬物種(Streptomyces sp.)、念珠菌屬物種(Candida sp.)、紅酵母屬物種(Rhodotorula sp.)、和短梗霉屬物種(Aureobasidiumsp.) ο在一些實(shí)施方案中，酶是由重組得到的。在一些實(shí)施方案中，酶包括重組的酶。
[0009]在一些實(shí)施方案中，組合物包括一種或多種陽離子。例如，在一些實(shí)施方案中，組合物包括至少一種二價陽離子。在一些實(shí)施方案中，二價陽離子包括鈣。
[0010] 在一些實(shí)施方案中，與不與納米顆?；蛄谆沂糠只蛞陨隙呦嘟佑|的相同的酶相比較，組合物中的酶表現(xiàn)出增高的活性。另外地或可選地，在一些實(shí)施方案中，與不與納米顆粒或磷灰石部分或以上二者相接觸的相同的酶相比較，組合物中的酶是更熱穩(wěn)定的。另外地或可選地，在一些實(shí)施方案中，與不與納米顆?；蛄谆沂糠只蛞陨隙呦嘟佑|的相同的酶相比較，在較高的溫度下，組合物中的酶具有增高的活性。在一些實(shí)施方案中，與不與納米顆?；蛄谆沂糠只蛞陨隙呦嘟佑|的相同的酶相比較，在較高的溫度下組合物中的酶具有增高的活性且是更熱穩(wěn)定的。在一些實(shí)施方案中，與不與納米顆粒或磷灰石部分或以上二者相接觸的相同的酶相比較，組合物中的酶具有更長的半衰期。在一些實(shí)施方案中，酶包括果膠分解酶。在一些實(shí)施方案中，酶是果膠分解酶。在一些實(shí)施方案中，酶包括果膠酸裂合酶。在一些實(shí)施方案中，酶是果膠酸裂合酶。
[0011]在一些方面,提供了產(chǎn)生熱穩(wěn)定酶組合物的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括:將以下組合以形成混合物:1)多個納米顆粒，其中所述納米顆粒的至少一些包括磷灰石部分；和ii)至少一種酶；所述組合在酶與納米顆粒或磷灰石部分或以上二者相接觸的條件下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，磷灰石包括羥磷灰石。在一些實(shí)施方案中，酶包括果膠分解酶。在一些實(shí)施方案中，酶包括果膠酸裂合酶。在一些實(shí)施方案中，方法包括將一種或多種二價陽離子組合到混合物中。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種二價陽離子包括Ca2+、Mg2+、Mn2+、Co2+和Cd2+中的一種或多種。
[0012]在本方法的一些實(shí)施方案中，將混合物孵育。例如在一些實(shí)施方案中，將混合物在約55°C下孵育。另外地或可選地，在一些實(shí)施方案中，將混合物持續(xù)孵育約2小時至約5小時。在一些實(shí)施方案中，孵育在約8.5的pH下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，在組合前將酶純化。
[0013]在一些方面，本文提供了處理含果膠物質(zhì)的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括將所述物質(zhì)與包括以下的組合物相接觸:1)至少一種納米顆粒，包括磷灰石部分；和ii)果膠分解酶，所述果膠分解酶與納米顆?；蛄谆沂糠只蛞陨隙呓佑|；與所述組合物的接觸持續(xù)一定時間且在其中物質(zhì)中的果膠的至少一些被酶裂解的條件下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，含果膠物質(zhì)包括紡織物、植物、清潔劑、生物復(fù)合物、廢水、紙、油、動物飼料、食物、飲料或其組合。在一些實(shí)施方案中，接觸在大于或等于約55°C的溫度下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，含果膠物質(zhì)包括食物，且其中所述接觸在大于或等于約90°C的溫度下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，所述組合物還包括至少一種二價陽離子。在一些實(shí)施方案中，所述納米顆粒、磷灰石部分或以上二者經(jīng)由至少一種二價陽離子與果膠分解酶相接觸。
[0014]在一些方面，提供了試劑盒。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括i)果膠分解酶；ii)包括磷灰石部分的多個納米顆粒；和iii)用于將所述酶與所述納米顆粒組合以形成酶組合物的說明書。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括用于將所述酶組合物應(yīng)用于含果膠物質(zhì)的說明書。另外地或可選地，在一些實(shí)施方案中，磷灰石部分包括羥磷灰石。在一些實(shí)施方案中，果膠分解酶包括果膠酸裂合酶。
[0015]以上的概述僅為示例性的，且并不意在以任何方式進(jìn)行限制。除以上所描述的示例性的方面、實(shí)施方案和特征之外，另外的方面、實(shí)施方案和特征將通過參照以下的詳細(xì)描述變得明顯。
[0016]附圖簡述
[0017]圖1顯示了通過硫代巴比妥酸(TBA)測定，在具有和沒有羥磷灰石納米顆粒的情況下，孵育5小時后作為時間的函數(shù)的果膠酸裂合酶活性測定的比較研究的結(jié)果。
[0018]圖2A和2B示出了在漸增的溫度下(55°C -90°C )通過TBA測定，在存在或不存在任何Ca離子的情況下，在具有和沒有羥磷灰石納米顆粒的情況下，果膠酸裂合酶活性測定的比較研究的結(jié)果。圖2A:無納米顆?；駽a2+ ;圖2B:無納米顆?；駽a2+。
[0019]圖3顯示了羥磷灰石(“ΗΡΑ”)納米顆粒處理的果膠酸裂合酶的熱激活的阿倫紐斯(Arrhenius)曲線。
[0020]圖4顯示了未處理的果膠酸裂合酶的熱激活的阿倫紐斯曲線。
[0021]圖5 (a) -5 (b)顯示了 HPA納米顆粒未處理的(5Α)和HPA納米顆粒處理的(5Β)果膠酸裂合酶的熱失活的阿倫紐斯曲線。
[0022]圖6 (a) -6 (b)分別示出了果膠酸裂合酶的溫度和pH相關(guān)性。
[0023]圖7是顯示在不同的陽離子存在下果膠酸裂合酶的相對活性的圖。
[0024]圖8是顯示在不同濃度的羥磷灰石納米顆粒存在時酶活性的圖。
[0025]圖9顯示了在不同濃度的鈣存在下的相對酶活性。
[0026]詳述
[0027]以下的詳述參照了作為說明書的部分的附圖。除非文中另外指明，在附圖中，相似的符號通常代表相似的成分。在詳述、附圖和權(quán)利要求中描述的示例性實(shí)施方案并不意在進(jìn)行限制。可使用其他實(shí)施方案，和作出其他改變，而不會脫離本發(fā)明主題的精神或范圍。
[0028]本文所公開的是與熱穩(wěn)定酶的生產(chǎn)和使用相關(guān)的組合物和方法。在一些實(shí)施方案中，本文所公開的酶組合物和方法包括(I) 一種或多種酶，比如果膠分解酶；和(2)至少一種納米顆粒，其包括磷灰石部分。通常，磷灰石部分、納米顆粒或以上二者與所述酶相接觸。
[0029]1.納米顆粒
[0030]在本文所描述的一些示例性實(shí)施方案中所提供的納米顆粒是指最大尺寸在納米米范圍中的任何顆粒，和/或其中組合物包含多個納米顆粒的情況，本文所描述的尺寸可指多個納米顆粒的各自的尺寸的平均值。例如，在一些實(shí)施方案中，納米顆粒具有小于100nm 的最大尺寸，例如，約 999nm,約 900nm,約 800nm,約 700nm,約 600nm,約 500nm,約400nm,約300nm,約200nm或約lOOnm。另外地或可選地，在一些實(shí)施方案中，納米顆粒的最大尺寸為，例如，約10nm,例如，約90nm,約80nm,約70nm,約60nm,約50nm,約25nm,約20nm,約1nm,約5nm,約3nm,約2nm或約Inm或更小。
[0031]如以上所述，尺寸可指，例如，顆粒的最大尺寸。另外地或可選地，尺寸可指顆粒的最小尺寸。顆粒可具有任何形狀。例如，在一些實(shí)施方案中，納米顆粒可指至少基本上球形的顆粒。另外地或可選地，納米顆?？删哂袡E圓形、立方形、圓柱形或不規(guī)則的形狀的形狀。根據(jù)形狀的不同，本文所描述的尺寸可指任何直徑、半徑、寬度、長度、高度、對角線和類似的尺寸。同樣，在其中組合物包含多個納米顆粒的情況中，本文所描述的尺寸可指多個納米顆粒的各自的尺寸的平均值。例如，在一些實(shí)施方案中，多個納米顆粒的各自的尺寸的平均值為約 100nm,約 999nm,約 900nm,約 800nm,約 700nm,約 600nm,約 500nm,約 400nm,約300nm,約200nm或約lOOnm。另外地或可選地,在一些實(shí)施方案中，多個納米顆粒的各自的尺寸的平均值是，例如，約10nm,例如，約90nm,約80nm,約70nm,約60nm,約50nm,約25nm,約 20nm,約 1nm,約 5nm,約 3nm,約 2nm 或約 lnm。
[0032]在一些實(shí)施方案中，納米顆粒具有基本上球形的形狀和約2nm至約500nm的直徑，例如，約1nm至約400nm,約25nm至約300nm,約50nm至約200nm,約80nm至約lOOnm。
[0033]在一些實(shí)施方案中，納米顆粒包括磷灰石。在一些實(shí)施方案中，納米顆粒包括羥磷灰石。
[0034]I1.磷灰石部分
[0035]如本文所用的，術(shù)語磷灰石部分(或簡稱“磷灰石”)指磷酸鹽礦物的組，包括在晶體中分別包含0H-、F_、Cr或Br—離子的羥磷灰石、氟磷灰石、氯磷灰石和溴磷灰石。在一些實(shí)施方案中，這些端元的摻和物的化學(xué)式寫作Caltl (PO4) 6 (0H, F，Cl，Br) 2，和這些單獨(dú)的礦物的晶體的晶胞式寫作 Ca10 (PO4)6 (OH)2, Ca10 (PO4)6 (F)2、Ca10 (PO4)6(Cl)2 和 Ca10 (PO4)6(Br)20
[0036]磷灰石是由生物微環(huán)境系統(tǒng)所產(chǎn)生和使用的一些礦物其中之一。磷灰石是邊界清楚的礦物，莫氏硬度5。羥磷灰石，又稱作羥基磷灰石，是牙釉質(zhì)和骨無機(jī)質(zhì)的主要成分。在本文提供的一些實(shí)施方案中，磷灰石部分指羥磷灰石。羥磷灰石具有式Ca5(PO4)3(OH)，但通常寫作Caltl(PO4)6(OH)2以表示晶體晶胞包括兩個實(shí)體。在一些實(shí)施方案中，羥磷灰石是納米顆粒的形式。
[0037]羥磷灰石(HPA)被認(rèn)為是生物材料，且用作，例如，食品添加劑和營養(yǎng)添加物。HPA納米顆粒(例如，納米顆粒形式的HPA)顯示無毒性反應(yīng)且是生物相容的。因此，HPA可用于食品。
[0038]II1.酶
[0039]在本文提供的一些實(shí)施方案中，至少一種酶與納米顆粒、磷灰石部分或以上二者相接觸。根據(jù)應(yīng)用的不同，酶或酶組合物可包括任何適宜的酶。在一些實(shí)施方案中，酶或酶組合物包括果膠分解酶。如本文所用的，果膠分解酶(有時稱作“果膠酶”)指水解果膠的酶。
[0040]在一些實(shí)施方案中，果膠分解酶包括果膠酸裂合酶。果膠酸裂合酶還被同義地稱作內(nèi)切型果膠酸裂合酶(或反式消除酶)、果膠酸裂合酶、多聚半乳糖醛酸裂解酶、內(nèi)切型半乳糖醛酸反式消除酶、內(nèi)切-α-1，4-聚半乳糖醛酸裂解酶、聚半乳糖醛酸裂解酶和a -1,4-D-內(nèi)切聚半乳糖醛酸裂解酶。
[0041]例如，但非限制性地，果膠酶可見于水果和紡織物工業(yè)的應(yīng)用中。這些酶將植物組織的復(fù)雜的多糖降解為較簡單的分子，如半乳糖醛酸。這種果膠酶可以是酸性的或堿性的。酸性的果膠酶，例如，可用于降低飲料諸如果汁和/或蔬菜汁的濁度和苦味。堿性的果膠酶可用于紡織物工業(yè)以用于纖維作物、紙的生產(chǎn)、咖啡和茶的發(fā)酵、油提取和果膠廢水(例如，來自果汁工業(yè))處理的浸解和脫膠。
[0042]在一些實(shí)施方案中，果膠分解酶包括以下中的一種或多種:果膠酸裂合酶、果膠裂解酶、聚半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸裂解酶、果膠酯酶、果膠裂解酶酶、果膠酶和內(nèi)切型果膠酸裂合酶。在一些實(shí)施方案中，果膠分解酶是以下中的一種或多種:果膠酸裂合酶、果膠裂解酶、聚半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸裂解酶、果膠酯酶、果膠裂解酶、果膠酶和內(nèi)切型果膠酸裂合酶。在一些實(shí)施方案中，果膠分解酶包括果膠酸裂合酶。
[0043]酶可來源于多種細(xì)菌、真菌或重組來源。在一些實(shí)施方案中，酶是細(xì)菌來源的。另外地或可選地,在一些實(shí)施方案中，酶是重組來源的,例如,通過本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行重組。酶可從不同的來源獲得，包括真菌和/或細(xì)菌。例如，酶可從以下中的一種或多種中獲得或純化:芽孢桿菌屬物種、曲霉菌屬物種、青霉菌屬物種、核盤菌屬物種、韌革菌屬物種、歐文氏菌屬物種、無枝酸菌屬物種、耶爾森氏菌屬物種、鐮刀菌屬物種、假單胞菌屬物種、鏈霉菌屬物種、念珠菌屬物種、紅酵母屬物種和短梗霉屬物種。
[0044]在一些實(shí)施方案中，酶包括聚半乳糖醛酸酶。聚半乳糖醛酸酶可從真菌和/或細(xì)菌中獲得或純化。例如，聚半乳糖醛酸酶可從以下中的至少一種中獲得:日本曲霉(Aspergillus japonicus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、常現(xiàn)青霉(Penicilliumfrequentans)、地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)、核盤菌(SclerotiniascIerot1rum)和紫韌革菌(Stereum purpureum)。另外地或可選地,聚半乳糖醒酸酶可通過本領(lǐng)域中已知的重組方法來獲得。
[0045]在一些實(shí)施方案中，酶包括多聚半乳糖醛酸裂解酶。多聚半乳糖醛酸裂解酶可從真菌和/或細(xì)菌中獲得或純化。例如，聚半乳糖醛酸酶可從以下中的至少一種中獲得:胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)、浸麻芽孢桿菌(Bacillus macerans)、無枝酸菌屬物種(Amycolata sp.)、芽孢桿菌屬物種(Bacillus sp.)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)、芽抱桿菌 TS44 (Bacillus sp.TS44)、串珠鍵刀菌(Fusariummonoliforme)、短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)、邊緣假單胞菌(Pseudomonasmarginal is)、熱普通鏈霉菌(Streptomyces thermovulgaris)和博伊丁念珠菌 S2 (Candidaboidinii S2)。另外地或可選地，多聚半乳糖醛酸裂解酶可通過本領(lǐng)域中已知的重組方法來獲得。
[0046]在一些實(shí)施方案中，酶包括果膠酯酶。果膠酯酶可從真菌和/或細(xì)菌中獲得或純化。例如，聚半乳糖醒酸酶可從紅酵母屬物種、菊歐文氏菌(Erwinia chrysanthemi B341)、黑曲霉和日本曲霉中的至少一種中獲得。另外地或可選地，果膠酯酶可從本領(lǐng)域中已知的重組方法中獲得。
[0047]在一些實(shí)施方案中，酶包括果膠裂解酶。果膠裂解酶可從真菌和/或細(xì)菌中獲得或純化。例如，果膠裂解酶可從黑曲霉NCM548、黑曲霉A138、意大利青霉(Penicilliumitalicum CECT2294)、灰玫瑰青霉(Penicillium griseoroseum CCT6421)和出芽短梗霉(Aureobasidium pullalans LV10)。另外地或可選地,果膠裂解酶可通過本領(lǐng)域中已知的重組方法來獲得。
[0048]在一些實(shí)施方案中，酶包括果膠酶。果膠酶可從真菌和/或細(xì)菌中獲得或純化。例如，果膠酶可從芽孢桿菌DT-7、芽孢桿菌TS47、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophiIus)、丁香假單胞菌大豆致病變種(P.syringae pv.Glycinea)和意大利青霉(Penicillium italicum)中的至少一種中獲得。另外地或可選地，果膠酶可通過本領(lǐng)域中已知的重組方法來獲得。
[0049]酶可以是天然形式的(例如，天然的酶)或合成形式的(比如重組酶)酶。重組酶可以是，例如，商業(yè)上可獲得的重組酶。
[0050]IV.陽離子
[0051]在一些實(shí)施方案中，本文所描述的組合物包括至少一種陽離子。如本文所用的，陽離子指攜帶至少一個正電荷的離子，所述至少一個正電荷例如，一個電荷(即，單價的)、兩個電荷(即，二價的)、三個電荷(即，三價的)等。在一些實(shí)施方案中，本文所描述的組合物具有至少一個二價陽離子。在一些實(shí)施方案中，陽離子是金屬離子，比如堿金屬離子、堿土離子、過渡金屬離子和類似的陽離子。在一些實(shí)施方案中，陽離子是單價陽離子，包括Li+、Na+、K+等。另外地或可選地^日離子是二價陽離子’包括此2+^#+^#』!.2+』？+、!^2+、Mn2+、Co2+和Cd2+等。例如，在一些實(shí)施方案中，二價陽離子選自由Ca、Mg、Mn、Co和Cd組成的組。
[0052]在一些實(shí)施方案中，將陽離子添加到組合物中，例如，包括諸如果膠分解酶的酶和包括至少一種磷灰石部分的納米顆粒的組合物。另外地或可選地，在一些實(shí)施方案中，陽離子作為至少一個分子的部分存在于組合物中。例如，陽離子可以是磷灰石部分的鈣離子。另外地或可選地，陽離子可以是另外添加到磷灰石部分的鈣離子。
[0053]V.利用包括磷灰石部分的納米顆粒處理酶
[0054]本文提供的是利用納米顆粒處理諸如果膠分解酶的酶的方法。在一些實(shí)施方案中，處理方法包括將以下組合而形成混合物:1)多個納米顆粒，其中所述納米顆粒中的至少一些包括磷灰石部分；和ii)至少一種酶；所述組合在其中所述酶與納米顆粒、磷灰石部分或以上二者相接觸的條件下進(jìn)行。
[0055]酶、納米顆粒和磷灰石部分可以如以上所描述。在一些實(shí)施方案中，處理可進(jìn)一步包括(除可能存在于磷灰石部分的二價陽離子之外的)將(外部的)二價陽離子添加到混合物中?？赏ㄟ^任何適宜的孵育技術(shù)孵育混合物，且條件可根據(jù)被孵育的物質(zhì)而不同。例如，在一個實(shí)施方案中，在至少約55°C——例如，約60 V、約65°C、約70 V、約75°C、約80 V、約85°C或約90°C下孵育混合物。在另一個實(shí)施方案中，孵育可進(jìn)行持續(xù)約10分鐘至約10小時——例如，約1分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、I小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時的時間，或持續(xù)從約2小時至約5小時、約3小時至約4小時的時間。在一些實(shí)施方案中，孵育可在微堿性條件下進(jìn)行。例如，孵育可在至少約6的pH下進(jìn)行——例如，pH約6.5，約7，約1.5，約8，約8.5，約9，約9.5或約10。在一些實(shí)施方案中，酶包括果膠分解酶。在一些實(shí)施方案中，酶包括果膠酸裂合酶。在一些實(shí)施方案中，納米顆粒包括羥磷灰石。
[0056]根據(jù)所用的酶不同，處理可進(jìn)一步包括在將其組合到混合物中之前純化酶(例如，從細(xì)菌來源或真菌來源)?？蛇x地，純化的酶可易于與其他物質(zhì)組合以形成混合物。
[0057]在一些實(shí)施方案中，利用包括磷灰石部分的納米顆粒對酶的處理可改變酶的性質(zhì)。如本文所用的“經(jīng)處理的”酶指與包括磷灰石部分的納米顆粒接觸的或已經(jīng)接觸過的酶。在一些實(shí)施方案中，酶是與至少一種納米顆粒的至少一部分接觸的酶。另外地或可選地，在一些實(shí)施方案中，酶是與納米顆粒、磷灰石部分或以上二者接觸的酶。接觸可通過多種機(jī)制進(jìn)行，比如氫鍵合、范德華力等。在一些實(shí)施方案中，納米顆粒包括羥磷灰石。
[0058]在一些實(shí)施方案中，利用包括磷灰石部分(例如，羥磷灰石)納米顆粒進(jìn)行的處理可導(dǎo)致改變的或改良的耐熱性、穩(wěn)定性和/或活性。根據(jù)環(huán)境和特定的性質(zhì)的不同，本文所描述的改良可指性質(zhì)程度的增高或降低。
[0059]例如，在一些實(shí)施方案中，與未與納米顆粒、磷灰石部分或以上二者接觸的相同的酶相比較，利用包括磷灰石的納米顆粒處理的酶具有增高的活性。在一些實(shí)施方案中，增高可以為大于未接觸納米顆粒、磷灰石部分或以上二者的酶活性的至少約10%、至少約15%,至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55% at least aboutGO1^、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約100%、至少約200%、至少約400%、至少約600%、至少約800%或至少約1000%。在一些實(shí)施方案中，增高可以為高于未接觸納米顆粒、磷灰石部分或以上二者的酶活性的至少一個數(shù)量級，比如10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更高倍?；钚钥赏ㄟ^任何易于獲得的技術(shù)來測量。例如，在一些實(shí)施方案中，利用在550nm處激發(fā)樣品之后來測量酶活性。在另外的實(shí)施方案中，如下文所描述，活性可通過動力學(xué)參數(shù)來表征，包括km、Vmax和活化能。例如，但非限制性地，在一個實(shí)施方案中，酶包括果膠酸裂合酶，且酶-底物復(fù)合物(例如，果膠酸裂合酶+PGA)和TBA導(dǎo)致了有顏色的化合物，其在550nm處被激發(fā)。
[0060]另外地或可選地，在一些實(shí)施方案中，與未用包括磷灰石部分的納米顆粒處理的相同的酶相比較，經(jīng)處理的酶表現(xiàn)出更多的熱穩(wěn)定性。例如，在一些實(shí)施方案中，利用包括磷灰石部分的納米顆粒進(jìn)行的處理可增高熱穩(wěn)定性。熱穩(wěn)定性可通過一些度量方法來測量和描述。例如，熱穩(wěn)定性的增高可指在將酶暴露于增高的溫度持續(xù)一段時間后酶保留其活性。例如，在一些實(shí)施方案中，在本文的一些實(shí)施方案中提供的經(jīng)處理的酶在被暴露于增高的溫度持續(xù)至少2小時后保留活性，所述至少2小時例如，至少3小時、至少4小時、至少5小時、至少6小時、至少8小時、至少10小時。在一些實(shí)施方案中，增高的溫度指高于室溫的溫度——例如，至少30°C，至少37°C，至少40°C，至少45°C，至少50°C，至少55°C，至少60°C，至少65°C，至少70°C，至少75°C，至少80°C，至少85°C，至少90°C，至少95°C，至少100°C，至少105°C，至少110°C，至少115°C，至少120°C或更高。在一些實(shí)施方案中，酶包括果膠分解酶。在一些實(shí)施方案中，酶包括果膠酸裂合酶。
[0061]另外地或可選地，在一些實(shí)施方案中，與未用包括磷灰石部分的納米顆粒處理的相同的酶相比較，利用包括磷灰石部分的納米顆粒處理的酶較高的(或增高的)溫度下可具有增高的活性。例如，在一些實(shí)施方案中，增高可以是大于未與納米顆粒、磷灰石部分或以上二者接觸的酶的活性的至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約100%、至少約200%、至少約400%、至少約600 %、至少約800 %或至少約1000 %。在一些實(shí)施方案中，增高可以是高于未與納米顆粒、磷灰石部分或以上二者接觸的酶的至少一個數(shù)量級，比如10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更高的倍數(shù)?；钚钥赏ㄟ^任何易于獲得的技術(shù)來測量。例如，在一些實(shí)施方案中，利用在550nm處激發(fā)樣品之后的吸光度來測量酶活性。在一些實(shí)施方案中，增高的溫度指高于室溫的溫度——例如，至少30°C，至少37°C，至少40°C，至少45°C，至少50°C，至少55°C，至少60°C，至少65°C，至少70°C，至少75°C，至少80°C，至少85°C，至少90°C，至少95°C，至少100°C，至少105°C，至少110°C，至少115°C，至少120°C或更高。在一些實(shí)施方案中，酶包括果膠分解酶。在一些實(shí)施方案中，酶包括果膠酸裂合酶。在一些實(shí)施方案中，，納米顆粒包括羥磷灰石。
[0062]在一些實(shí)施方案中，與未用納米顆粒處理的相同的酶相比較，利用包括磷灰石部分的納米顆粒處理的酶可具有較長的半衰期。在一些實(shí)施方案中，與未用包括磷灰石部分的納米顆粒處理的相同的酶相比較，半衰期的增加為比其長至少約10%、至少約15%、至少約20 %、至少約25 %、至少約30 %、至少約35 %、至少約40 %、至少約45 %、至少約50 %、至少約55 %、至少約60 %、至少約70 %、至少約80 %、至少約90 %、至少100 %、至少200 %、至少400 %、至少600 %、至少800 %、至少1000 %。在一些實(shí)施方案中，增加可以是高至少一個數(shù)量級，比如高10倍、20倍、30倍、40倍、50倍。在一些實(shí)施方案中，酶包括果膠分解酶。在一些實(shí)施方案中，酶包括果膠酸裂合酶。在一些實(shí)施方案中，納米顆粒包括羥磷灰石。
[0063]V.利用酶組合物對底物物質(zhì)的處理
[0064]以上所描述的酶組合物可應(yīng)用于處理含果膠物質(zhì)(例如，底物)。例如，在一些實(shí)施方案中，方法包括:將含果膠物質(zhì)與包括以下的組合物相接觸:1)至少一種納米顆粒，其包括磷灰石部分；和ii)與納米顆粒、磷灰石部分或以上二者接觸的果膠分解酶；所述與組合物的接觸持續(xù)一定時間并在其中物質(zhì)中的果膠的至少一些被酶裂解的條件下進(jìn)行。
[0065] 酶、納米顆粒和磷灰石部分可以為如以上所描述。在一些實(shí)施方案中，含果膠物質(zhì)包括紡織物、植物、清潔劑、生物復(fù)合物、廢水、紙、油、動物飼料、食物、飲料或其組合。
[0066]在一些實(shí)施方案中，其中將物質(zhì)與酶組合物相接觸的條件類似于以上所描述的孵育條件。例如，在一些實(shí)施方案中，接觸在高于或等于約55°C的溫度下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，其中所述含果膠物質(zhì)包括食物或飲料，且所述接觸可在較高的溫度下進(jìn)行，例如，以對食物進(jìn)行滅菌。例如，在一些實(shí)施方案中，接觸在高于60°C、65°C、70°C、75°C、80°C、85°C的溫度或高于或等于90°C或95°C的溫度下進(jìn)行。
[0067]在一些實(shí)施方案中，本文所提供的組合物可提供用于以下的穩(wěn)健的催化劑替代物:用于在工業(yè)處理溫度下降解含果膠物質(zhì)；用于果汁和酒的提取和凈化；用于含果膠物質(zhì)的工業(yè)廢水的處理；用于天然韌皮纖維(例如，麻類植物和亞麻織物)、棉織物和其組合的浸解或生物凈化。
[0068]在一些實(shí)施方案中， 由于本文所描述的組合物所提供的酶活性和/或熱穩(wěn)定性的增強(qiáng)可以是某些數(shù)量級的，可采用的高溫確保了高度的食物安全性。因此，本文所公開的組合物和方法可用于多種食品工業(yè)應(yīng)用中(例如，果醬加工、果汁凈化)。
[0069]并且，本文所公開的組合物和方法可用于天然纖維的脫膠，和用來產(chǎn)生用于治療用途的果膠片段。提高酶熱穩(wěn)定性同時保持在高溫下的高活性的納米啟動的程序的應(yīng)用不僅限于該領(lǐng)域，且可用于多種其他相關(guān)的工業(yè)酶學(xué)和農(nóng)業(yè)相關(guān)的領(lǐng)域。例如，本文所提供的組合物和方法可用于處理果膠廢水、日本紙的產(chǎn)生、造紙、油萃取、咖啡和茶發(fā)酵或其組合。
[0070]V1.示例件的用涂
[0071 ] A.用于凈化的酶組合物的用途
[0072]在工業(yè)規(guī)模中，化學(xué)凈化是常見的，其通過從許多天然纖維中去除非纖維素物質(zhì)提高了紡織物的水吸收能力和白度?；瘜W(xué)凈化過程中所用的烈性、危險性化學(xué)品如蘇打灰、草酸、苛性鈉導(dǎo)致了一些環(huán)境污染和纖維強(qiáng)度變?nèi)酢?br> [0073]雖然對用于生物精煉程序的酶方法是感興趣的，目前所用的許多酶缺少精煉效率。缺少精煉效率可由于酶的熱不穩(wěn)定性和低活性而導(dǎo)致。熱不穩(wěn)定性導(dǎo)致了隨時間推移活性的降低，這是由于熱誘導(dǎo)的酶構(gòu)象的改變所導(dǎo)致。較高的溫度加速了活性的降低。低活性限制了可發(fā)生精煉的速率。精煉效率可通過利用包括果膠分解酶的組合物來提高，所述果膠分解酶具有如本文所描述的增高的熱穩(wěn)定性和酶活性。
[0074]B.纖維作物的浸解和脫膠
[0075]果膠分解酶常用于黃麻纖維、亞麻纖維、大麻纖維、芒麻纖維、南非槿麻(Hibiscussativa)和來自椰殼的椰皮纖維的浸解和脫膠。浸解是發(fā)酵過程，其中某些細(xì)菌(例如，梭狀芽孢桿菌(Clostridium)、芽孢桿菌)和某些真菌(例如，曲霉菌、青霉菌)分解樹皮的果膠并釋放纖維。商業(yè)上，浸解通過兩種基本形式中之一來進(jìn)行，且如本文所公開的熱穩(wěn)定酶組合物在該過程中將是有用的。
[0076]例如，苧麻纖維是優(yōu)異的天然紡織物，但去皮的苧麻纖維包含20+-35%苧麻膠，所述苧麻膠主要由果膠和半纖維素組成；因此需要對纖維進(jìn)行脫膠以符合紡織物的需要。本文所公開的熱穩(wěn)定酶組合物將有用于浸解該纖維。
[0077]C.果膠廢水的處理
[0078]來自柑橘加工工業(yè)的廢水包含含果膠物質(zhì)，所述含果膠物質(zhì)在活化的漿處理過程中幾乎不會被微生物所分解。已開發(fā)了利用嗜堿性微生物的新型廢水處理程序。已證明利用該細(xì)菌菌株進(jìn)行的處理在從廢水中取出果膠物質(zhì)中是有用的。另外地或可選地，可利用本文所公開的熱穩(wěn)定酶組合物處理廢水以去除果膠物質(zhì)。利用本文公開的酶組合物將具有如下優(yōu)點(diǎn):消除污染的風(fēng)險且無需與使用細(xì)菌系統(tǒng)常相關(guān)的另外的工作(例如，去除微生物的過程)。
[0079]D.日本紙的產(chǎn)牛
[0080]由芽孢桿菌屬物種和胡蘿卜軟腐歐文氏菌產(chǎn)生的堿性果膠酶由于其強(qiáng)浸化活性已用于三級皮韌皮纖維的浸解。已將這些經(jīng)浸解的韌皮纖維用于日本紙的制備。來自細(xì)菌浸解的紙漿的強(qiáng)度與通過常規(guī)的蘇打灰熬煉方法獲得的紙漿強(qiáng)度一樣高。由該紙漿制備的紙張極為平滑且觸感柔軟。因此，本文所公開的熱穩(wěn)定果膠分解酶在制備和生產(chǎn)日本紙的方法中將是有用的。
[0081]E.誥紙
[0082]造紙工業(yè)正在開始使用酶來解決其生產(chǎn)過程中面臨的問題。造紙是基本上連續(xù)的過濾過程，其中纖維、纖維片段(細(xì)屑)和無機(jī)填料粒子，比如粘土的稀懸浮液被過濾。在整個過程中，多糖類是非常棘手的物質(zhì)。在這些多糖中重要的是果膠或聚半乳糖醛酸。聚半乳糖醛酸復(fù)合陽離子聚合物的能力(陽離子需求量)較大程度上取決于其多聚化的程度，半乳糖醛酸的單體、二聚體和三體不會產(chǎn)生可測量的陽離子需求量，但六聚體和長鏈具有高的陽離子需求量。果膠酶可解聚半乳糖醛酸的聚合物，并隨之降低果膠溶液和來自過氧化物漂白的濾出液的陽離子需求量。因此，本文所公開的熱穩(wěn)定性果膠分解酶組合物在制備和生產(chǎn)紙漿和紙張的方法中將是有用的。
[0083]例如，酶組合物可與液體紙漿混合物相組合。根據(jù)所用的紙漿過程(例如，化學(xué)制漿對比機(jī)械制漿)、所用的紙漿物質(zhì)的類型和需要的最終產(chǎn)物的不同，本領(lǐng)域技術(shù)人員將在過程的適當(dāng)?shù)狞c(diǎn)添加酶混合物，且本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，或可憑經(jīng)驗(yàn)容易地確定添加多少量的酶混合物，以及將酶混合物與紙漿一起孵育多長時間。
[0084]F.油提取
[0085]來自菜籽(加拿大油菜)、椰子種子、向日葵種子、棕櫚、種仁和橄欖的油通常通過利用有機(jī)溶劑來萃取。最常用的溶劑是己烷，其是潛在的致癌物質(zhì)。細(xì)胞壁降解酶，包括果膠酶，可用于在含水過程中通過液化含油作物的結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁成分來萃取植物油。因此，本文所公開的熱穩(wěn)定果膠分解酶組合物在從多種植物來源中提取油的方法中將是有用的。
[0086]G.咖啡和荼發(fā)酵
[0087]在咖啡和茶發(fā)酵中果膠酶起重要的作用。利用果膠分解微生物對咖啡進(jìn)行發(fā)酵以從咖啡豆中去除粘液皮。有時添加果膠酶以去除占果膠物質(zhì)的四分之三的豆的果肉層。
[0088]真菌果膠酶也用于茶的生產(chǎn)。盡管通常對酶劑量進(jìn)行嚴(yán)格調(diào)整以避免損害茶葉，酶處理仍加速了茶發(fā)酵。果膠酶的添加也改良了由破壞茶果膠得到的茶粉的泡沫形成性質(zhì)。
[0089]因此，本文所公開的熱穩(wěn)定果膠分解酶組合物在發(fā)酵咖啡和茶的方法中將是有用的。
[0090]VI1.試劑盒
[0091]本文所提供的組合物和處理方法可用于多種應(yīng)用。例如，在一個實(shí)施方案中，組合物可以在試劑盒中提供。所述試劑盒包括，例如，i)果膠分解酶；ii)包括磷灰石部分的多個納米顆粒；和iii)用于將所述酶與所述納米顆粒組合以形成酶組合物的說明書。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒可進(jìn)一步包括用于將所述酶組合物應(yīng)用于含果膠物質(zhì)的說明書。在一些實(shí)施方案中，果膠分解酶包括果膠酸裂合酶。在一些實(shí)施方案中，磷灰石部分包括輕磷灰石。
實(shí)施例
[0092]本發(fā)明的實(shí)施例描述了從芽孢桿菌中純化示例性的果膠分解酶、果膠酸裂合酶，納米顆粒物質(zhì)羥磷灰石的形成和增強(qiáng)的果膠酸裂合酶組合物的生產(chǎn)。實(shí)施例還提供了增強(qiáng)的酶組合物的表征，包括，酶熱穩(wěn)定性、半衰期和活性的評估。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，雖然以下示出了果膠酸裂合酶，其他具有相當(dāng)作用的果膠分解酶也是可用的。
[0093]實(shí)施例1.從短小芽孢桿菌中純化果膠酸裂合酶
[0094]通過三個連續(xù)的過程從短小芽孢桿菌中純化細(xì)菌果膠酸裂合酶:(I)硫酸銨分級分離(0-30% ；30 % -80 % ) (2)離子交換層析(CM Sepharose);和(3)凝膠過濾層析(Sephadex G-75) (Basu,等人,(2008)Technology99:8088_8094)。簡言之，將分離的果膠分解細(xì)菌菌株的過夜培養(yǎng)物接種到含于100ml錐形培養(yǎng)瓶的200ml YP培養(yǎng)基中(NaCl0.5%，酵母提取物1.0%和果膠0.75% ;ρΗ7.0)。在30°C下在旋轉(zhuǎn)震蕩器(150rpm)上孵育培養(yǎng)瓶24小時。
[0095]從200ml YP培養(yǎng)肉湯(生長條件如以上所述)中純化果膠酸裂合酶。利用硫酸銨(0-30^^30-80%)分級分離無細(xì)胞的上清液，并將含有活性的級分用于以后的研究。將沉淀物溶于最低量的Tris-HCl緩沖液(25mM，pH8.5)并針對相同的緩沖液進(jìn)行透析。然后，將5ml的透析過的樣品上樣到CM-Sepharose柱上(5ml柱床體積)，利用Tris-HCl緩沖液(25mM，pH8.5)平衡。利用含(O-1M)NaCl濃度的Tris-HCl緩沖液洗滌柱以洗脫蛋白。將收集物用于Iml級分。通過Lowry等人，(1951) J.B1l.Chem.193,265-275的方法測量每個級分的蛋白含量，通過以下所描述的方法測定果膠酸裂合酶活性。利用MacroseplOK單元濃縮顯示果膠酸裂合酶活性的級分，并將所述級分上樣到填有S^hadex G-75的玻璃柱上(柱床體積30ml)并如以上所述利用Tris-HCl緩沖液來平衡。利用Tris-HCl緩沖液(25mM，pH8.5)進(jìn)行蛋白的洗脫。如以上所描述進(jìn)行級分的收集和蛋白與酶活性的測定。利用B1-Rad電泳裝置通過Laemmli，等人，(1970)Nature227，680-685的方法進(jìn)行12% SDS-PAGE。通過銀染色法對蛋白標(biāo)志物和蛋白條帶染色(Swain等人，(1994)Electrophoresisl6,948-951.)。
[0096]實(shí)施例2.果膠酸裂合酶的活性測定
[0097]通過硫代巴比妥酸(TBA)測定確定果膠酸裂合酶活性，該測定測量550nm處的吸光度(Roberts等人，(1986) J.Bacterial.167,279-284)。將上清液的適宜稀釋物(Iml)添加到5ml的PGA(聚半乳糖醛酸，鈉鹽)溶液(0.75%,w/v)。利用含ImM CaCl2的Tris-HCl緩沖液(25mM，pH8.5)使測定體積達(dá)到10.0ml，并在55°C下孵育2小時。然后添加約0.6ml的硫酸鋅(9.0%,w/v)和0.6ml氫氧化鈉(0.5M)。將樣品離心(3000g，10分鐘)并將5.0ml的澄清上清液添加到硫代巴比妥酸(3.0ml，0.04M)和HCl (1.5ml，0.1M)的混合物中。在沸水浴中加熱混合物30分鐘，在550nm處測量有顏色的溶液的吸光度，與含有與實(shí)驗(yàn)比色皿所含的試劑相同的試劑的對照比色皿相比較，其中對于所述對照比色皿，在添加酶和底物之前添加硫酸鋅和氫氧化鈉。一單位的活性定義為在測定的條件下導(dǎo)致吸光度改變0.01的酶的量。
[0098]實(shí)施例3.羥磷灰石納米顆粒的合成
[0099]根據(jù)Mir等人，(2010) J.Mater.Sc1.21:2365-2369.中描述的方法制備羥磷灰石(HPA)納米顆粒。簡言之，使用聚(乙烯)醇穩(wěn)定的含水鐵磁流體(PVA-ff)作為鈣羥磷灰石(HPA)的結(jié)晶的納米模板。對于HPA的相同起始組分利用20、40、60和80ml的PVA-ff合成四組PVA-ff-HPA納米復(fù)合物。
[0100]a.材料
[0101]所用的所有化學(xué)品均是分析級的。氯化鐵(FeCl3.6H20)、氯化亞鐵購自Rankem,聚(乙烯)醇(摩爾重量44，000) (PVA)來自Qualigenes，磷酸氫二銨和氨溶液(30% )來自 Merck,和硝酸鈣 Ca (NO3) 2.4H20 來自 Himedia0
[0102]b.實(shí)駘稈序
[0103]為制備PVA-ff-HAp納米復(fù)合物，使用了如下的濕法共沉淀方法:
[0104]1Ca (NO3) 24H20+6 (NH4) 2HP04+8NH40H — Ca10 (PO4) 6 (OH) 2+46H20+20NH4N03
[0105]制備了含0.5% PVA的堿性硝酸鈣溶液，向其添加不同體積的含水PVA-ff (分別為20、40、60、80ml)。孵育24小時后，添加堿性磷酸氫二銨以沉淀ΗΡΑ。使?jié){液的pH維持在10.5。然后將樣品進(jìn)行醇化，持續(xù)7天的時間，之后洗滌漿液直至pH7并用烘爐干燥。隨后獲得的粉末在結(jié)構(gòu)上和磁性上與Mir等人，2010中所描述的相似。
[0106]利用透射電鏡(TEM) (CM200CXPhilips在160kV下)確定顆粒的大小和形態(tài)。納米顆粒(HPA晶體)具有約20nm的平均尺寸。
[0107]實(shí)施例4.未處理的果膠酸裂合酶的表征
[0108]a.未處理的果膠裂解酶的最佳溫度和pH
[0109]為在一個測驗(yàn)條件下測量果膠酸裂合酶的最佳溫度，將酶在范圍從30°C到100°C的不同溫度下保持10分鐘。10分鐘之后，如先前所描述的通過TBA測定確定酶活性。
[0110]為確定最佳pH，將酶的樣品置于具有范圍從3-10的pH的緩沖液中。確定酶活性以測量最佳pH。
[0111]發(fā)現(xiàn)果膠酸裂合酶在75°C時具有最佳溫度。發(fā)現(xiàn)該酶最佳pH為8.5。酶活性的溫度和pH依賴性示于圖6 (A) -6 (B)中。
[0112]b.二價離子對果膠酸裂合酶活性的影響
[0113]將作為氯化物鹽的金屬離子(Ca2+、Mn2+、Mg2+、Co2+、Cd2+、Ni2+和Zn2+)添加到底物-緩沖液混合物(PGA0.75% ；25mM Tris-HCl，pH8.5)以得到ImM的終濃度，如先前所描述的測量果膠酸裂合酶的活性。在金屬離子抑制研究中每個測定系統(tǒng)包含93U的果膠酸裂合酶活性。
[0114]果膠酸裂合酶的活性被鈣和鎂所誘導(dǎo)，且被鋅、鎳和EDTA所抑制，圖7。
[0115]實(shí)施例5.經(jīng)處理的果膠酸裂合酶的表征
[0116]將從短小芽孢桿菌中純化的果膠酸裂合酶(0.16mg/ml)與25mM TrisCl緩沖液中的聚半乳糖醛酸(PH8.5)在55°C下孵育2小時。在以下四種條件下(用于不同組的測驗(yàn)樣品)孵育單獨(dú)的樣品:
[0117](I)在不同濃度的HPA納米顆粒存在下；
[0118](2)在不同濃度的Ca2+存在下；
[0119](3)在 HPA 納米顆粒(8.8 μ g/ml)和 Ca2+ (40 μ g/ml)存在下；
[0120](4) HPA納米顆?；駽a2+均不存在。
[0121]隨后，通過利用以上所描述的硫代巴比妥酸(TBA)方法測量每組的果膠酸裂合酶活性。為評估溫度和時間依賴性，孵育溫度和時間各不相同。
[0122]a.HPA納米顆粒和Ca2"補(bǔ)充增強(qiáng)了果膠酸裂合酶的活性
[0123]在存在或不存在Ca2+的情況下，在將純化的果膠酸裂合酶和其底物以及不同濃度的羥磷灰石納米顆粒孵育之后，利用先前描述的TBA方法測量果膠酸裂合酶活性(550nm處的吸光度；酶-底物復(fù)合物果膠酸裂合酶+PGA和TBA產(chǎn)生顏色)。納米顆粒處理的果膠酸裂合酶(甚至在緩沖液中不存在Ca2+離子時)顯示了比僅補(bǔ)充Ca2+(無納米顆粒)的酶顯著更高的活性。并且，僅納米顆粒處理過的酶顯示出比補(bǔ)充Ca2+(在緩沖液中)的酶和納米顆粒處理過的酶更高的活性?；钚躁P(guān)系可表示為:
[0124]僅HPA > HPA+Ca2+ (I)
[0125]僅HPA > Ca2+ (2)
[0126]圖8 顯不了五種不同濃度的(2.2 μ g/ml, 4.4 μ g/ml, 6.6 μ g/ml, 8.8 μ g/ml 和llμg/ml)HPA 納米顆粒對果膠酸裂合酶活性的影響。發(fā)現(xiàn)在50°C至90°C的溫度范圍中，納米顆粒的最佳濃度為8.8 μ g/ml。圖9顯示了 8種不同濃度的鈣對未處理的果膠酸裂合酶的影響(0.1mM, 0.25mM, 0.5mM, 0.75mM, ImM, 2mM, 5mM 和 1mM)。
[0127]b.納米顆粒補(bǔ)充物促進(jìn)了果膠酸裂合酶活性的保持
[0128]通過時間動力學(xué)檢查了在存在納米顆粒(8.8μg/ml)或不存在納米顆粒的情況下，酶活性隨時間的改變(若有的話)。在55°C下與底物孵育兩小時之后，通過TBA方法測量果膠酸裂合酶(0.16mg/ml)活性，以I小時為間隔，持續(xù)5小時。
[0129]據(jù)觀察，無納米顆粒處理的酶在2小時處顯示出最佳活性，其后活性隨時間降低。然而，納米顆粒處理的酶保持活性持續(xù)5小時(研究終止時間)。并且，發(fā)現(xiàn)活性隨時間而增高(圖1)。
[0130]此處可注意的是實(shí)驗(yàn)條件是相同的(除NP的存在和不存在之外)。還應(yīng)進(jìn)一步注意的是Ca2+在每種樣品中均不存在；在測定系統(tǒng)中使用了新鮮的milliQ水而不添加任何額外的鈣鹽補(bǔ)充。
[0131]c.納米顆粒補(bǔ)充改良了果膠酸裂合酶的溫度耐受性并增強(qiáng)了酶的活性
[0132]在存在和不存在羥磷灰石納米顆粒的情況下評價了果膠酸裂合酶的溫度依賴性。在測量酶活性之前，在不同的溫度下孵育樣品2小時。使用了 0.16mg/ml的酶和8.8 μ g/ml的HPA納米顆粒。
[0133]發(fā)現(xiàn)在90°C下納米顆粒處理的酶表現(xiàn)出的活性超過未處理的酶活性的四倍。
[0134]還發(fā)現(xiàn)該增強(qiáng)不僅是短暫效應(yīng)。在90°C下孵育2小時的納米顆粒處理的酶保留了高于在55°C下孵育2小時的未處理的酶的活性(圖2)。
[0135]d.處理的和未處理的果膠酸裂合酶的底物特異性
[0136]果膠酸裂合酶可催化果膠的降解。聚半乳糖醛酸酶(PG) —般水解果膠酸，而果膠酸裂合酶(PL)對于甲基酯化的底物是特異性的，其通過對果膠物質(zhì)的β_消除裂解a-D-(1,4)糖苷鍵。果膠酸裂合酶相似地作用于合成的底物聚半乳糖醛酸(PGA)。
[0137]為測量酶活性(利用PGA作為底物)在高溫下的保持，將處理的果膠酸裂合酶(0.16mg/ml酶和8.8 μ g/ml HPA納米顆粒)在90°C下孵育1_5小時。孵育之后，如以上所描述的確定酶活性。相對于進(jìn)行相似的孵育的未處理的酶的值來表示結(jié)果。利用0.015%蘋果果膠(Sigma-Aldrich)作為底物進(jìn)行相同的組的實(shí)驗(yàn)。
[0138]當(dāng)利用果膠作為底物時，在2小時孵育后，經(jīng)處理的果膠裂合酶的活性比未處理的果膠裂合酶的活性高5倍。而在4小時孵育后經(jīng)處理的果膠酸裂合酶活性比未處理的果膠酸裂合酶高11倍。(表1)。5小時后，與4小時后的活性相比較，處理的果膠酸裂合酶活性降低了 3倍。這顯示利用合成底物和天然底物時，在高溫下處理的果膠酸裂合酶顯示了增強(qiáng)的活性。
[0139]表1:經(jīng)處理的果膠酸裂合酶(NP-PL)和未處理的果膠酸裂合酶(PL)(底物果膠)在90°C時對活性的保持
[0140]
【權(quán)利要求】
1.一種組合物，包括: 至少一種納米顆粒，所述納米顆粒包括磷灰石部分；和 至少一種與所述納米顆粒、所述磷灰石部分、或以上二者相接觸的酶，其中所述酶包括果膠分解酶。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述磷灰石包括羥磷灰石。
3.如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的組合物,其中所述納米顆粒具有約50nm至約200nm的直徑。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述酶包括果膠酸裂合酶、果膠裂解酶、聚半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸裂解酶、果膠酯酶、果膠酶、內(nèi)切型果膠酸裂合酶，或其組合。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述酶是果膠酸裂合酶、果膠裂解酶、聚半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸裂解酶、果膠酯酶、果膠酶、內(nèi)切型果膠酸裂合酶，或其組口 ο
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述酶從以下中的一種或多種中純化的:芽孢桿菌屬物種(Bacillus sp.)、曲霉菌屬物種(Aspergillus sp.)、青霉菌屬物種(Penicillium sp.)、核盤菌屬物種(Sclerotinia sp.)、韌革菌屬物種(Stereumsp.)、歐文氏菌屬物種(Erwinia sp.)、無枝酸菌屬物種(Amycolata sp.)、耶爾森氏菌屬物種(Yersinia sp.)、鐮刀菌屬物種(Fusarium sp.)、假單胞菌屬物種(Pseudomonassp.)、鏈霉菌屬物種(Streptomyces sp.)、念珠菌屬物種(Candida sp.)、紅酵母屬物種(Rhodotorula sp.)、和短梗霉屬物種(Aureobasidium sp.)。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述酶包括重組的酶。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的組合物，還包括至少一種二價陽離子。
9.如權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述二價陽離子包括鈣。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，與未與所述納米顆粒、所述磷灰石部分、或以上二者相接觸的相同的果膠分解酶相比較，所述組合物中的所述酶具有增高的活性。
11.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，與未與所述納米顆粒、所述磷灰石部分、或以上二者相接觸的相同的果膠分解酶相比較，所述組合物中的所述酶是更熱穩(wěn)定的。
12.如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，與未與所述納米顆粒、所述磷灰石部分、或以上二者相接觸的相同的果膠分解酶相比較，所述組合物中的所述酶在較高溫度下具有增高的活性。
13.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，與未與所述納米顆粒、所述磷灰石部分、或以上二者相接觸的相同的果膠分解酶相比較，所述組合物中的所述酶在較高溫度下具有增高的活性且是更熱穩(wěn)定的。
14.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，與未與所述納米顆粒、所述磷灰石部分、或以上二者相接觸的相同的果膠分解酶相比較，所述組合物中的所述酶具有較長的半衰期。
15.—種制備熱穩(wěn)定酶組合物的方法,所述方法包括:將以下組合以形成混合物: (a)多個納米顆粒，其中所述納米顆粒中的至少一些包括磷灰石部分；和 (b)至少一種酶； 所述組合在酶與納米顆粒、磷灰石部分、或以上二者相接觸的條件下進(jìn)行。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述磷灰石包括羥磷灰石。
17.如權(quán)利要求15-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述酶是果膠酸裂合酶。
18.如權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)所述的方法，還包括將一種或多種二價陽離子組合到所述混合物中。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述一種或多種二價陽離子選自由Ca2+、Mg2+、Mn2+、Co2+和Cd2+組成的組。
20.如權(quán)利要求15-19中任一項(xiàng)所述的方法，還包括孵育所述混合物。
21.如權(quán)利要求15-20中任一項(xiàng)所述的方法，其中在約55°C的溫度下孵育所述混合物。
22.如權(quán)利要求15-21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述孵育的進(jìn)行持續(xù)約2小時至約5小時的時間。
23.如權(quán)利要求1 5-22中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述孵育在約8.5的pH下進(jìn)行。
24.如權(quán)利要求15-23中任一項(xiàng)所述的方法，還包括在所述組合前純化所述酶。
25.—種處理含果膠物質(zhì)的方法,所述方法包括: 將所述物質(zhì)與包括以下的組合物相接觸: (a)至少一種納米顆粒，所述納米顆粒包括磷灰石部分；和 (b)果膠分解酶，所述果膠分解酶與所述納米顆粒、所述磷灰石部分、或以上二者相接觸， 所述與組合物的接觸持續(xù)一定時間且在物質(zhì)中的果膠的至少一些被酶裂解的條件下進(jìn)行。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述含果膠物質(zhì)包括紡織物、植物、清潔劑、生物復(fù)合物、廢水、紙、油、動物飼料、食物、飲料或其組合。
27.如權(quán)利要求25-26中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述接觸在高于或等于約55°C的溫度下進(jìn)行。
28.如權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述含果膠物質(zhì)包括食物，和其中所述接觸在高于或等于約90°C的溫度下進(jìn)行。
29.如權(quán)利要求25-28中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物還包括至少一種二價陽離子。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述納米顆粒、所述磷灰石部分、或以上二者經(jīng)由至少一種二價陽離子與所述果膠分解酶相接觸。
31.一種試劑盒，包括: (a)果膠分解酶； (b)多個納米顆粒，所述納米顆粒包括磷灰石部分；和 (c)說明書，所述說明書用于將所述酶和所述納米顆粒相組合以形成酶組合物。
32.如權(quán)利要求33所述的試劑盒，還包括用于將所述酶組合物應(yīng)用于含果膠物質(zhì)的說明書。
33.如權(quán)利要求 31-32中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述磷灰石部分包括羥磷灰石。
【文檔編號】C01B25/32GK104080732SQ201280068750
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2012年4月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月31日
【發(fā)明者】A·穆霍帕迪亞, H·K·帕特拉, K·加卡波狄, A·K·達(dá)斯古普塔, D·查托帕達(dá)雅 申請人:加爾各答大學(xué)