水稻核糖核酸酶H大亞基A編碼基因OsRNaseH2 A及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及一種利用圖位克隆技術(shù)克隆水稻OsRNaseH2 A基因，以及利用轉(zhuǎn)基因互補實驗鑒定該基因的功能；同時還涉及利用該基因研究對水稻葉片形態(tài)、衰老調(diào)控及葉綠體發(fā)育的影響，可用于彩色稻觀賞，解決雜交稻育種過程中雜種的剔除問題，調(diào)控水稻葉片的衰老形態(tài)。
【專利說明】
水稻核糖核酸酶Η大亞基A編碼基因0sRNaseH2 A及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明設(shè)及一種利用圖位克隆技術(shù)克 隆水稻OsRNas細2 A基因，W及利用轉(zhuǎn)基因互補實驗鑒定該基因的功能；同時還設(shè)及利用該 基因研究對水稻葉片形態(tài)、衰老調(diào)控及葉綠體發(fā)育的影響，可用于彩色稻觀賞，解決雜交稻 育種過程中雜種的剔除問題，調(diào)控水稻葉片的衰老形態(tài)。
【背景技術(shù)】
[0002] RNase Η能特異的水解RNA/DNA雜合雙鏈或DNA-RNA-DNA/DNA嵌合底物中的RNA，普 遍存在于各種原核生物、真核生物及病毒中。根據(jù)氨基酸序列及空間結(jié)構(gòu)相似性，RNase Η 可被分為1型和2型，1型包括細菌的RNase Η I和真核生物的RNase HI; 2型包括細菌的 RNase Η II和RNase Η III、古細菌的RNase Η II及真核生物的RNase Η 2DRNase Η是一類 嚴格依賴金屬離子才有活性的酶，偏愛Mgh和Μη2+作為輔助因子，其他二價陽離子不能支持 其活性，兩個金屬離子一個在底物的援助下實施親和進攻并負責(zé)產(chǎn)物釋放;另一個參與憐 酸基團的轉(zhuǎn)移反應(yīng)。從目前的研究來看，RNase Η在生物體的功能包括W下幾個方面:復(fù)制 過程中DNA滯后鏈中RNA引物的切除；切除錯誤滲入基因組DNA的單個核糖并維持基因組的 穩(wěn)定性;轉(zhuǎn)錄功能等。2007年化kushima S等研究發(fā)現(xiàn)在枯草芽抱桿菌中RNase Η的缺失會 導(dǎo)致細胞生長速率緩慢，細胞表現(xiàn)出SOS應(yīng)激反應(yīng)及溫敏特性，運可能是由于DNA復(fù)制中滯 后鏈的RNA引物的切除受阻所致。酵母基因敲除實驗證明單獨敲除RNase H35對其生長影響 不大，只是在S期有所堆積，可能是細胞受到復(fù)制壓力的表型，而RNase H35和RAD27(核酸 酶)雙缺失則嚴重影響酵母的存活。Lazzaro F等進一步敲除了酵母中RNase Η的多個亞基， 證明RNase Η與復(fù)制后修復(fù)機制（PRR)相關(guān)，共同保護細胞的DNA免遭核糖核酸滲入，因此 RNase Η的存在對于維持基因組的穩(wěn)定與完整具有重要生理意義。逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase田舌性 對于逆轉(zhuǎn)錄過程是必需的，任何能將RNase Η失活的突變都會抑制逆轉(zhuǎn)錄，目前醫(yī)學(xué)上研究 最多的就是W艾滋病病毒化IV)的逆轉(zhuǎn)錄酶RNase Η為祀點設(shè)計HIV藥物，通過抑制RNase Η 的活性阻斷HIV病毒的復(fù)制。
[0003] 除了在病毒和微生物中的研究外，鑒于RNase Η功能的重要性，近年來哺乳動物中 的生理功能相關(guān)的報道也越來越多。人的RNase Η2發(fā)生突變會導(dǎo)致自身炎癥性遺傳疾病 (AGS)，與自身免疫性疾病"系統(tǒng)性紅斑狼瘡"有免疫相似性，是由于在細胞內(nèi)累積了核酸進 而引發(fā)的免疫系統(tǒng)疾病?？傮w來說RNase Η對于細胞的生長，尤其是DNA的復(fù)制、修復(fù)等有重 要影響，缺失RNase聞尋使哺乳動物致病或死亡，但并不會使單細胞生物死亡。植物中關(guān)于 RNase Η的研究極少，直到2014年才首次在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了RNase H2突變體。RNase H2缺陷 可回補WEE1蛋白激酶缺陷株的表型，提高基因組的同源重組率，但擬南芥的RNase H2突變 體與野生型比較，并沒有肉眼可見的表型，只有通過DNA合成抑制劑的處理才能顯現(xiàn)其影 響。到目前為止RNase Η在生物體內(nèi)確切的生理功能仍不清楚，尤其是當(dāng)生物體內(nèi)同時含有 兩種不同的RNase邸寸，仍有諸多謎團待解，如二者如何分工?是共同合作還是互為替補?是 競爭還是合作？除了參與DNA復(fù)制、修復(fù)外，人們對腳ase H2所執(zhí)行的生物學(xué)功能在植物生 理水平產(chǎn)生何種影響一無所知，其與植物葉片衰老、葉片形態(tài)及葉綠體發(fā)育的關(guān)系從未被 發(fā)現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種與水稻葉片形態(tài)變異相關(guān)的蛋白質(zhì)及其基 因，W及由此獲得的轉(zhuǎn)基因植物細胞，和利用所述基因?qū)λ救~片形態(tài)進行改造的方法。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種水稻核糖核酸酶Η大亞基A編碼基因 0sRNase肥A編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)為SEQIDNo:3所示的氨基酸序列。
[0006] 作為本發(fā)明的水稻核糖核酸酶Η大亞基A編碼基因 OsRNase肥A編碼的蛋白質(zhì)的改 進，氨基酸序列還包括在SEQ ID No:3所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或 多個氨基酸或其他物種的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。
[0007] 本發(fā)明還同時提供了一種編碼上述蛋白質(zhì)的基因，該基因具有SEQ ID No:l、SEQ ID No :2所示的核巧酸序列。
[000引備注說明：SEQ ID N0:1為cDNA全長，SEQ ID ^:2為曲臟全長。
[0009] 作為本發(fā)明的基因的改進:所述核巧酸序列還包括在SEQ ID No:l、2所示的核巧 酸序列中添加、取代，插入或缺失一個或多個核巧酸而生成的突變體、等位基因或衍生物。
[0010] 本發(fā)明還同時提供了含有上述基因的質(zhì)粒。
[0011] 本發(fā)明還同時提供了含有上述基因的植物表達載體。
[0012] 本發(fā)明還同時提供了一種宿主細胞，該宿主細胞含有上述基因序列。細胞例如為 大腸桿菌細胞、農(nóng)桿菌細胞或植物細胞。
[0013] 本發(fā)明還同時提供了上述基因的用途，其特征在于：用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因水稻，所述轉(zhuǎn) 基因水稻的葉片顏色得W改良用于觀賞及高產(chǎn)品種的培育。
[0014] 本發(fā)明還同時提供了一種改良水稻葉片形態(tài)、影響葉綠素含量的方法:包括用具 有SEQ ID No: 1、2所示的核巧酸序列的基因轉(zhuǎn)化水稻細胞，再將轉(zhuǎn)化后的水稻細胞培育成 植株。
[0015] 進一步具體說明：本發(fā)明的目的是提供一種從水稻斑馬葉突變體中克隆的新基因 畑2，具有如56910齡：1和沈910齡：2所示的0魁序列，也包括與沈910齡：1和56910 No:2所示的DNA序列至少有70%同源性的基因序列。本發(fā)明中的SEQ ID No:3所示的蛋白質(zhì) 屬于鐵硫蛋白，其中進行一個或幾個替換，插入或缺失所獲得的功能類似物。另外，也包括 在SEQ ID No:l和SEQ ID No:2中添加、取代、插入或缺失一個或多個核巧酸而生成的突變 體、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能達到本發(fā)明的目的。
[0016] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種用RH2基因進行高效的植物轉(zhuǎn)化的方法，具體地 說，本發(fā)明提供了具有SEQ ID No: 1和SEQ ID No:2所示的序列的基因或基因部分片段的載 體，其中，如圖4所示的PCAMBIA1300-畑2,該載體可W表達有上述核巧酸序列編碼的多膚或 其同源類似物。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種利用植物表達載體轉(zhuǎn)化植物細胞影響水稻葉片形態(tài)的方法。 具體地是利用植物表達載體轉(zhuǎn)化植物細胞W影響水稻葉片形態(tài)的方法。
[0018] 本發(fā)明可用于彩色稻觀賞（突變體具有明顯的斑馬葉表型，大量種植后白綠相間， 有一定的觀賞價值，根據(jù)不同景觀設(shè)計可W產(chǎn)生多種植物景觀），解決雜交稻育種過程中雜 種的剔除問題，調(diào)控水稻葉片的衰老形態(tài)。
[0019] 實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下：
[0020] -、水稻斑馬葉突變體的表型觀察和遺傳分析：
[0021 ] 本發(fā)明的水稻斑馬葉突變體;rh2來自日本晴EMS化thyl Methyl Sulfonate)誘變 產(chǎn)生的突變（圖lA，B)jh2通過與野生型水稻的反交實驗，證明該突變體受隱性單基因控 審IJ。光照強度實驗結(jié)果表明突變體的斑馬表型受高光強誘導(dǎo)（圖1C)。進一步觀察發(fā)現(xiàn)突 變體斑馬性狀主要是由于葉片部分區(qū)段葉片早衰造成葉綠體降解和葉片內(nèi)卷(圖1D，F(xiàn))。二 氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色結(jié)果也表明突變體斑馬區(qū)段的細胞中有大量的過氧化氨積累（圖 1E)，說明突變體目的基因的突變造成細胞中超氧化物的大量積累從而啟動了細胞的衰老。
[0022] 二、圖位克隆控制水稻斑馬葉性狀的RH2基因：
[0023] 1)、畑2基因的初步定位：
[0024] 為了分離RH2基因，本發(fā)明首先組建了一個定位群體，由rh2與釉稻品種TN1 (Indica)雜交組配成F2定位群體，再通過圖位克隆的方法，利用STS、SSR等分子標(biāo)記對RH2 位點進行初步定位，將其初步定位在第11染色體的長臂端，并介于RM286和B11-5兩標(biāo)記之 間，見圖2。
[0025] 2)、畑2基因的精細定位與預(yù)測：
[00%] 通過對RM286和B11-5兩個標(biāo)記之間的BAC序列分析，發(fā)展新的SSR、STS標(biāo)記將RH2 精確定位于BAC 0SJNBb0030I09上ZY12711-20與ZY12711-21標(biāo)記之間60-kb范圍之內(nèi)（圖 3)，通過分析此區(qū)段開放閱讀框(OR巧推測候選基因。
[0027] 3)、畑2基因的鑒定和功能分析：
[00%]為了驗證候選基因功能，構(gòu)建了如圖4所示的互補載體，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將互補 載體轉(zhuǎn)入到突變體rh2中，結(jié)果表明本發(fā)明獲得了使突變體恢復(fù)正常表型的轉(zhuǎn)基因水稻(圖 5)，證明本發(fā)明正確克隆了 RH2基因，氨基酸序列分析表明RH2編碼核糖核酸酶Η大亞基A (0sRNaseH2 A)。此外，由于該基因被預(yù)測與DNA合成相關(guān)，我們還構(gòu)建了如圖6所示亞細胞 定位載體，通過水稻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)證明0sRNaseH2 A蛋白在細胞中定位于細胞核。
[0029] 本發(fā)明利用水稻斑馬葉突變體rh2,通過圖位克隆技術(shù)首次在水稻中克隆到了 0sRNaseH2 A基因，該基因編碼核糖核酸酶Η大亞基A，在水稻中影響葉片形態(tài)、葉綠體的降 解及光合效率。通過對OsR化seH2 A基因的功能解讀，不僅豐富了葉片形態(tài)、葉綠體發(fā)育及 光合效率的分子調(diào)控機制，對于闡明DNA復(fù)制與葉片形態(tài)、葉綠體發(fā)育的作用關(guān)系也具有重 要理論意義。
[0030] 葉綠體是植物進行光合作用的重要場所，廣泛分布在葉片綠色組織細胞中。斑馬 葉突變典型特征是葉綠體發(fā)育異常，大部分斑馬葉突變體白色部分缺乏葉綠素，植物斑馬 葉突變產(chǎn)生機制非常復(fù)雜，設(shè)及光合電子傳遞、核-質(zhì)基因組互作、質(zhì)體基因及基因與環(huán)境 的互作等過程，目前對斑馬葉的分子機理研究還僅停留在葉綠素代謝的層面，更為復(fù)雜的 調(diào)控模式還不清楚。本發(fā)明獲得的斑馬葉突變體，是眾多斑馬葉突變體中較為特殊的一類， 其相關(guān)基因編碼蛋白可能是通過影響高光強引起的DNA損傷修復(fù)，進而對葉片形態(tài)、葉綠體 的降解和光合效率產(chǎn)生影響。通過圖位克隆技術(shù)本發(fā)明首次在水稻中克隆了相關(guān)基因 0sRNaseH2 A，該基因編碼核糖核酸酶Η大亞基A，在水稻中影響葉片形態(tài)、葉綠體的降解及 光合效率。通過對0sRNaseH2 A基因的功能解讀，將為深入研究葉片形態(tài)調(diào)控、葉綠體發(fā)育 機制，闡明植物高光強引起的DM損傷修復(fù)與葉片形態(tài)調(diào)控、葉綠體降解的關(guān)系，進而為水 稻高光合育種奠定基礎(chǔ)。
[0031] 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：
[0032] 光合色素載體一一葉綠體是進行光合作用的重要場所，廣泛分布在葉片綠色組織 細胞中，與此同時所有體內(nèi)、體外逆境對植物造成的傷害都會首先對葉綠體的發(fā)育造成影 響，最快速、直接的反應(yīng)植物的生理狀態(tài)。本發(fā)明利用水稻斑馬葉突變體zb3,通過圖位克隆 技術(shù)首次在水稻中克隆到了0sRNaseH2 A基因，該基因編碼核糖核酸酶Η大亞基A，在水稻中 影響葉片形態(tài)及葉綠體的降解。通過對0sRNaseH2 A基因的功能解讀，進一步明確了 0sRNaseH2 A對水稻葉片形態(tài)、葉綠體降解及光合效率的影響，同時為深入掲示高光強引起 的DNA損傷修復(fù)與葉片形態(tài)及葉綠體降解的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0033] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0034] 圖1為水稻斑馬葉突變體與野生型WT苗期、分葉期表型及DAB染色結(jié)果；
[0035] A:水稻斑馬葉突變體與野生型WT苗期表型；
[0036] B:水稻斑馬葉突變體與野生型WT分葉期表型；
[0037] C:不同光照強度條件下野生型WT與突變體的表型；
[0038] D:水稻斑馬葉突變體與野生型WT葉片特寫；
[0039] E:突變體斑馬部位及野生型WT葉片二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色；
[0040] F:突變體斑馬部位及野生型WT葉片縱切面。
[0041 ]圖2為OsRNase肥A基因（畑2基因）在水稻第11染色體上的初步定位圖。
[0042] 圖3為OsRNase肥A基因（R肥基因）的精細定位及突變位點示意圖；
[0043] (A)代表OsRNase肥A基因在水稻第11染色體上的精細定位圖；
[0044] (B)代表OsRNase肥A基因定位區(qū)間候選基因預(yù)測圖；
[0045] (C)代表0sRNaseH2 A基因定位區(qū)間目的基因結(jié)構(gòu)分析及突變位點測序；
[0046] (D)代表0sRNaseH2 A基因序列及蛋白編碼序列在突變體和野生型間的差異比較。
[0047] 圖4為互補載體PCAMBIA1300-R肥圖譜。
[0048] 圖5為功能互補實驗TO轉(zhuǎn)基因水稻植株表型及測序驗證；
[0049] A:從左到右依次為野生型(WT)、突變體、及轉(zhuǎn)互補載體的突變體轉(zhuǎn)基因回復(fù)單 株；
[0050] 野生型(WT)、突變體、及轉(zhuǎn)互補載體的突變體轉(zhuǎn)基因回復(fù)單株葉片的特寫；
[0051] B:轉(zhuǎn)互補載體的rh2突變體轉(zhuǎn)基因回復(fù)單株測序驗證，箭頭所指為突變位點。
[0052] 圖6為0sRNaseH2 A亞細胞定位載體的構(gòu)建及原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化結(jié)果；
[0化3] A:OsRNase肥A與GFP融合表達載體示意圖；
[0054] B:巧光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)化OsR化seH2 A亞細胞定位載體的水稻原生質(zhì)體，結(jié) 果表明OsRNase肥A定位于細胞核中。
[0055] 圖7為突變體不同表型部位與對照日本晴光合色素含量測定。
[0056] 圖8為透射電鏡分析突變體RNaseH2 A(rh2)與對照日本晴葉綠體形態(tài)的變化；
[0057] 上圖為野生型不同放大倍數(shù)條件下葉肉細胞中葉綠體形態(tài)；
[0058] 中圖為突變體綠色部分不同放大倍數(shù)條件下葉肉細胞中葉綠體形態(tài)；
[0059] 下圖為突變體白色部分不同放大倍數(shù)條件下葉肉細胞中葉綠體形態(tài)。
【具體實施方式】
[0060] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此。
[0061] 實施例1、
[0062] 1、水稻材料：
[0063] 水稻(0巧za sativa L.)突變體原始野生材料為梗稻品種"日本晴"。
[0064] 水稻斑馬葉突變體來自日本晴EMS化thyl Methyl Sulfonate)誘變產(chǎn)生的突 變(如圖1所示），該突變體是在中國浙江省境內(nèi)獲得。
[00化]光強實驗：
[0066] 挑選飽滿的野生型和突變體種子各50粒，30°C避光浸種48小時，漸干水分30°C避 光催芽48小時，挑選發(fā)芽整齊，胚芽健壯的種子播種在鋪有營養(yǎng)±的容器中，把已發(fā)芽的突 變體和日本晴的種子分為兩組，分別種植在光強為25化mol photons m-2s-l和90化mol photons m-2s-l的光照培養(yǎng)箱中（Snijders，MD1400)，溫度均為晝/夜28°C/24°C，光照時長 1地，觀察并記錄葉片表型，用于鑒定突變體的光強敏感性。
[0067] DAB染色：
[006引染色液配方為：Img/ml的二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzine ,DAB,Sigma)水溶液，pH 調(diào)節(jié)至3.8。
[0069] 具體染色步驟為：將野生型和rh2苗期葉片輕輕加入染色液中，25°C光照下染色 她;除去染色液，加入95 %的乙醇，脫色12h-24h;水懸浮，鏡檢，拍照。
[0070] rh2通過與野生型品種（即，釉稻品種TN1)的反交實驗，證明該突變體受隱性單基 因控制。實驗的結(jié)果為：在M2代群體中隨機選擇85個單株進行遺傳分析，66株為野生型表 型，19株為突變型表型，卡平方檢測結(jié)果U2 = 0.29分2 0.05 = 3.84)，分離比符合3:1，說明 該突變表型由單隱性核基因控制。W釉稻品種TN1為父本，rh2為母本進行反交所得的F1代 植株全部表現(xiàn)為正常表型，F(xiàn)2代種子播種四周后，隨機選380個單株其中281株表現(xiàn)為野生 型表型，99株表現(xiàn)為突變型表型?？ㄆ椒綑z測結(jié)果U2 = 0.22分2 0.05 = 3.84)，正常植株表 型和突變體植株表型分離比符合3:1;進一步證明該突變表型受隱性單隱性核基因控制。
[0071] 2、分析和定位群體：
[0072] 純合的rh2突變體和野生型品種釉稻品種TN1進行雜交，F(xiàn)i代自交，得到F2群體。并 從中選出1273株斑馬葉rh2突變個體作為定位群體。在Ξ葉期期每株取1克左右的嫩葉，用 來提取總DNA。
[0073] 3、SSR和STS標(biāo)記定位OsRNase肥A基因
[0074] 采用水稻微量DNA的快速提取方法從水稻葉片中提取用于基因定位的基因組DNA。 取大約0.2g水稻葉片，經(jīng)液氮冷凍，在直徑5cm的小研鉢中磨成粉狀，轉(zhuǎn)移到1.5ml離屯、管里 提取DNA，獲得的DNA沉淀溶解于15化1超純水中。每一個PCR反應(yīng)用化1 DNA樣品。
[00巧]OsR化seH2 A基因的初步定位：在RNaseH2 A與TN1組合的F2群體中選取30個隱性 個體，根據(jù)公布的梗稻和釉稻創(chuàng)建的分子遺傳圖譜，選取近似均勻分布于各條染色體上的 SSR引物，根據(jù)已知的反應(yīng)條件進行PCR擴增，經(jīng)5%瓊脂糖凝膠電泳分離和漠化乙晚化B)染 色，檢測PCR產(chǎn)物的多態(tài)性，將OsRNase肥A初步定位在第3號染色體長臂端RM286和B11-5兩 STS標(biāo)記之間（如圖2所示）。
[0076] 0sRNaseH2 A基因的精細定位:選取與TN1組合的F2群體中共1273株隱性個體， 在初定位的基礎(chǔ)上進一步設(shè)計SSR和STS標(biāo)記，最終將0sRNaseH2 A精確定位于BAC號為 0SJNBb0030I09上60-kb范圍之內(nèi)（圖3A)，兩邊的分子標(biāo)記為ZY12711-20與ZY12711-21引物 序列為：
[0077] ZY12711-20：F：CACAGGGACTACAGTTAAGTC,R：AGTCTTTTCCATACGCCTTAC；
[007引 ZY12711-21: F: AGTACAGTTCACCGAGTAAGT，R: TGATAAGCTCAATAACAATTG;上文中設(shè)及 的0sRNaseH2 A基因的定位標(biāo)記序列具體如表1所示。
[0079] 表UOsRNase肥A基因的定位標(biāo)記序列
[0080]
[0082] 4、基因預(yù)測和比較分析：
[0083] 根據(jù)精細定位的結(jié)果，在6〇-kb范圍內(nèi)根據(jù)Rice Automated Annotation System 化ttp: //RiceGAAS. dna. af打c. go. jp)的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)在此區(qū)間內(nèi)共有17個候選基因（圖3B)。 根據(jù)兩標(biāo)記剩余的重組個體數(shù)，我們設(shè)計了各基因的測序引物，采用PCR方法分別從rh2和 野生型品種基因組中擴增出候選基因進行測序分析。發(fā)現(xiàn)rh2突變體在L0C_0sllg05570的 第3個外顯子發(fā)生1個堿基的替換突變，由C突變?yōu)棣常箤?yīng)的氨基酸由丙氨酸突變?yōu)猷l(xiāng)氨 酸（圖3C，D)。將此用不同的突變單株及群體中突變表型的單株，各重復(fù)驗證Ξ次，突變位點 穩(wěn)定存在(測序引物序列見表2)。根據(jù)BAC克隆0SJNBb0030I09序列的基因注釋信息(NCBI)， 預(yù)測此基因編碼pWative r;Lbonuclease H21arge subunit(OsRNase肥 A)，該基因編碼區(qū) 全長2532bp，包含8個外顯子和7個內(nèi)含子，水稻中的OsRNaseH2 A基因與擬南芥中編碼 RNASE肥A蛋白的基因有69%的同源率。
[0084] 該基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表的SEQ ID No:3所示。該基因的cDNA 全長如SEQ ID NO: 1所示，曲ΝΑ全長如SEQ ID NO:2所示。
[0085] 表2、0SRNA沈肥A基因的測序引物序列
[0086]
[0087] 實施例2、
[0088] 植物轉(zhuǎn)化：
[0089] W梗稻品種"日本晴"基因組為模板，根據(jù)目的基因設(shè)計引物F-5'- AAAGGTACCTAATCTACACCAGAGCCACCAACGC-3 ' 和R-5 '-AAAGTCGACTGATCCTGTACCGCTATTACAATT TACTCA-3'，PCR擴增體系為：50化的PCR反應(yīng)體系：模板DNA 2^;2ΧΡ〔Κ buffer 2扣1^; 2mmol dNTP(^R) 10μΙ；Κ00ΡΧ(Τ0Υ0Β0)||?μΙ； ΙΟμΜ PrimerF 3μΙ；10μΜ PrimerR 3μΙ； d地2〇 eiiMPCR擴增條件為：94°C預(yù)變性2min;98°C變性 1〇3,60°(：退火3〇3,68°(：延伸8111111; 共35個循環(huán);68°C下延伸10min，15°C保溫。PCR擴增后進行電泳分離，回收得到6062bp的DNA 片段，用Κρη巧日Sal I酶切pCAMBIA1300(pl300)后連接，獲得了互補載體PCAMBIA1300- OsRNas細2 A，該克隆覆蓋了整個0RF的基因組區(qū)域（即包含了SEQ ID No:2所示的核巧酸序 列），還包括ATG上游2424-bp啟動子序列和TGA下游1106-bp終止子序列（如圖4所示）。運個 質(zhì)粒通過電擊的方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium 1:umefaciens)株系EHA105中轉(zhuǎn)化水稻。 我們利用突變體成熟種子誘導(dǎo)愈傷組織，經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)3周后，挑選生長旺盛愈傷用 作轉(zhuǎn)化的受體。用含有雙元質(zhì)粒載體的EHA105菌株侵染水稻愈傷，在黑暗、25Γ條件下共培 養(yǎng)3天后，在含有300mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)。篩選抗性愈傷在含有250mg/L潮霉素 預(yù)分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天左右。將預(yù)分化的愈傷轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上在光照條件下培養(yǎng)。一 個月左右得到抗性轉(zhuǎn)基因植株。對植株進行鑒定和連續(xù)的觀察發(fā)現(xiàn)，與同時期的突變體比 較，轉(zhuǎn)基因植株葉色恢復(fù)為正常綠色，與轉(zhuǎn)入空載P1300的日本晴表型一致。
[0090] 通過上述轉(zhuǎn)基因技術(shù)，結(jié)果表明：本發(fā)明獲得了使突變體恢復(fù)正常表型的轉(zhuǎn)基因 水稻（圖5)。
[0091] 說明：上文中所設(shè)及的各種培養(yǎng)基的配方可參考Toki S.，Hara Ν.,Οηο K.， Onodera Η.,Tagiri A.,Oka S.,Tanaka H.(2006)Early infection of scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speed transformation of rice.The Plant Journal 47:969-976。
[0092] 實施例3、
[0093] 水稻原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化及0sRNaseH2 A綠色巧光融合蛋白的定位觀察：
[0094] 將RNA沈肥A基因 cDNA序列克隆至PCAMBIA1301-S65T中構(gòu)建GFP融合載體（圖6A)
[00M] (1)生長15天左右的水稻幼苗用鋒利的刀片在塑料培養(yǎng)皿板上切碎幼苗莖葉，移 至Ij200ml洗凈的錐形瓶中（一般20ml酶解液每次60株左右;預(yù)先將酶解液倒入瓶中，根據(jù)瓶 底大小合理分配酶解液），每瓶不宜裝太多。放入28 °C搖床，60-80巧m，4-6小時。
[0096] (2)在酶解時間完成之前，配置PEG4000 40%溶液，置于65°C水浴鍋中或室溫溶 解，65°C溶解，中間取出來振蕩一次。
[0097] (3)酶解完成后，先向酶解完成的瓶中加入約15ml左右的W5。用300目（或400目）的 鋼制濾網(wǎng)將碎葉片過濾掉，用干凈的塑料培養(yǎng)皿收集酶解后的原生質(zhì)體。然后將原生質(zhì)體 緩慢倒入（或用去槍尖的槍頭吸?。?0ml離屯、管中，天平稱重平衡后，放入水平離屯、機， 150g，5min，充分收集原生質(zhì)體，離屯、完成后，緩慢吸走上清。
[0098] (4)向原生質(zhì)體沉淀中加入1ml W5溶液，緩慢輕輕傾斜混勻重懸，然后用去槍尖的 槍頭吸移到2ml離屯、管中。此時50ml離屯、管中可能還有少量未重懸的原生質(zhì)體，可再加入 1ml W5溶解，吸移到之前的2ml離屯、管中，150g，3min，移除上清液。
[0099] (5)用MMG重懸，具體加多少根據(jù)原生質(zhì)體的量和要轉(zhuǎn)的質(zhì)粒個數(shù)來定，一般最后 每個質(zhì)粒中加入lOOul稀釋的原生質(zhì)體。或者用顯微鏡稍微觀察下產(chǎn)量和酶解后完整個體 的數(shù)目比例，然后根據(jù)原生質(zhì)體的狀態(tài)來確定MMG用量。
[0100] (6)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒10-1加 g左右或lOul，于2ml離屯、管中。
[0101] (7)加入lOOul的重懸好的原生質(zhì)體，然后加入PEG 40%110ul，混勻。
[0102] (8)28 度避光靜置 15min。
[0103] (9)加入足量的W5稀釋，混勻，然后離屯、150g，3min，緩慢移除上清，再用W5洗一次 (中間會有損失，但不影響結(jié)果）。最后得到的沉淀，用W5重懸（用2ml的管子裝滿），輕輕混 勻，移到細胞培養(yǎng)板中。用錫錐紙包裹，避光28度靜置培養(yǎng)，14小時。
[0104] (10)培養(yǎng)時間完成后，將培養(yǎng)板各孔中沉淀的原生質(zhì)體輕輕混勻，吸移到2ml管 中，然后離屯、150g，3min，去除上清，保留lOOul左右上清液，重懸原生質(zhì)體。
[0105] (11)共聚焦顯微鏡觀察拍照。
[0106] 結(jié)果顯示陽性對照在細胞各個部位均有表達，說明實驗的表達系統(tǒng)工作正常， 0sRNaseH2 AGFP融合蛋白特異的在細胞核中表達，其他部位未見表達，說明0sRNaseH2 A是 定位于細胞核中的蛋白（圖6B)。
[0107] 說明：上文中所設(shè)及的各種溶液的配方可參考Zhang et曰1.A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light chloroplast-related processes.Plant Methods 2011,7:30。
[010引實施例4、
[0109] 光合色素含量測定：
[0110] 由于rh2突變體表型與溫度沒有明顯的相關(guān)性，因此我們在大田取樣，分別測定苗 期突變體白色部分(rii2wMte)和綠色部分(rii2green)及對照葉片(NIP)葉綠素含量，同時 測定光合效率。分別取突變體和野生型即十期葉片去掉主脈，剪成1cm左右的片段，稱取0.2g 浸泡于10ml 80 %丙酬，26°C條件下暗培養(yǎng)48小時。取溶液在紫外分光光度計（DU800, 邸CKMAN C0ULT邸)663皿、645皿和470皿Ξ種波長下測定葉綠素 a、葉綠素 b、類胡蘿h素的光 密度值。3次重復(fù)，然后根據(jù)Amon(1949)的方法計算出各檢測葉片中的葉綠素 a(化1 a)、葉 綠素 b (化1 b)的含量，按照WeUbu;rn(1994)計算類胡蘿h素(化r)的含量，計算公式如下：
[0111] chi a=(12.7X0D663-2.69X0D645)XV/W
[0112] chi b = (22.9 X0〇645-4.68 XODees) X V/W
[0113] car=(1000XOD47〇XV/W_3.27XChl a_104XChl b)/198
[0114] 其中：V為提取液體積（10ml)，W為葉片質(zhì)量0.2g，0D663、0D645及0D47Q為在分光光度 儀上讀取的光密度值，單位:mg/g。
[0115] 結(jié)果顯示，與野生型相比，突變體綠色部分葉綠素 a、葉綠素 b、類胡蘿h素及化1 a/ 化化的值均無明顯變化，但白色部分葉綠素 a、葉綠素 b及類胡蘿h素含量均大幅下降，但化1 a/b的比值與野生型差別不大（圖7)。運一結(jié)果說明，突變體白色部分的表型變化是由于葉 綠素和類胡蘿l·素缺失引起。
[0116] 實施例5、
[0117] 葉綠體透射電鏡的制備和觀察：
[0118] (1)樣品：取突變體苗期葉片和對照野生型苗期葉片，切成0.5~lmm3左右的小塊；
[0119] (2)固定:將切好的樣品塊放入2ml離屯、管中，加入2.5%的戊二醒溶液(PH=7.2)， 在抽真空儀器中抽真空直到葉片完全下沉。0.1M憐酸漂洗Ξ次，每15min-次，然后加入1% 餓酸固定2~3小時，直至樣品變黑；
[0120] (3)脫水:先用50 %、70 %、和90 %的乙醇溶液依次脫水，每個濃度處理20分鐘，再 用乙醇和丙酬（1:1)溶液處理20分鐘，W上均在4度冰箱內(nèi)進行，最后將樣品用純丙酬室溫 處理20分鐘；
[0121] (4)滲透:將樣品在無水丙酬和包埋劑(3:1)混合液中作用4小時，再在無水丙酬和 包埋劑（1:1)混合液處理3小時，最后在純的包埋劑中作用12小時；
[0122] (5)包埋:將上述步驟中的樣品挑的包埋盒內(nèi)，37 °C過夜，45 °C處理12小時最后60 °C處理24小時，獲得包埋樣品；
[0123] (6)切片、拍照:將包埋樣品用超薄切片機切成60-70皿左右的超薄片，然后將切片 用巧樣酸鉛溶液染色10分鐘，再有醋酸軸溶液染色30分鐘，雙蒸水清洗Ξ次后驚干，用 化化chi H-7650型透射電鏡觀察并且選擇清晰地倍數(shù)拍照。
[0124] 結(jié)果顯示野生型葉片的葉肉細胞中葉綠體數(shù)目較多，葉綠體結(jié)構(gòu)完整，葉綠體中 基粒片層層次豐富，排列緊密。突變體葉片綠色部分相比野生型葉綠體結(jié)構(gòu)和數(shù)量并無明 顯變化，但突變體白色部分相比野生型葉綠體數(shù)量明顯減少、葉綠體內(nèi)部無明顯的基粒結(jié) 構(gòu)（圖8)。觀察結(jié)果表明目的基因的突變造成了突變體白色部分中葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)育缺陷。
[0125] 最后，還需要注意的是，W上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā) 明不限于W上實施例，還可W有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容 直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 水稻DNA復(fù)制相關(guān)基因 OsRNase H2A編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于：該蛋白質(zhì)具有SEQ ID No:3所示的氨基酸序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻DNA復(fù)制相關(guān)基因 OsRNase H2A編碼的蛋白質(zhì)，其特征在 于:所述氨基酸序列還包括在SEQ ID N〇:3所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一 個或多個氨基酸或其他物種的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。3. 編碼權(quán)利要求1或2所述蛋白質(zhì)的基因，其特征在于：該基因具有SEQ ID N〇:l、SEQ ID No :2所示的核苷酸序列。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于:所述核苷酸序列還包括在SEQ. ID. No: 1和2 所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一個或多個核苷酸而生成的突變體、等位基因 或衍生物。5. -種含有權(quán)利要求3或4所述基因的質(zhì)粒。6. -種含有權(quán)利要求3或4所述基因的植物表達載體。7. -種宿主細胞，其特征在于:該宿主細胞含有權(quán)利要求3或4所述的基因序列。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細胞，其特征在于：該細胞為大腸桿菌細胞、農(nóng)桿菌細胞 或植物細胞。9. 如權(quán)利要求3或4所述基因的用途，其特征在于：改良水稻葉片形態(tài)、顏色；提高光合 效率。10. -種改良水稻葉片形態(tài)、影響葉綠素含量的方法的方法，其特征在于:包括用具有 SEQ ID No: 1和2所示的核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)化水稻細胞，再將轉(zhuǎn)化后的水稻細胞培育成植 株。
【文檔編號】A01H5/00GK106011105SQ201610524845
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月1日
【發(fā)明人】朱麗, 錢前, 邱振楠, 王小琦, 赫磊, 張森, 曾大力, 張光恒, 胡江, 郭龍彪, 董國軍, 任德勇, 高振宇
【申請人】中國水稻研究所