一種耐堿性α-淀粉酶及其基因工程菌的構(gòu)建方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種耐堿性α?淀粉酶及其基因工程菌的構(gòu)建方法和應用，屬于酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明采用基因工程技術(shù)將來源于堿性芽孢桿菌(Bacillus sp.LS?04)的耐堿性α?淀粉酶基因克隆入pPIC9k質(zhì)粒，以P.pastoris為表達宿主細胞，經(jīng)甲醇誘導重組耐堿性α?淀粉酶表達活力達到3120U/mL。本發(fā)明的耐堿性α?淀粉酶在pH8.0–11.0范圍內(nèi)對淀粉均變現(xiàn)出良好的催化活性，可被應用于紡織退漿或洗滌助劑等領(lǐng)域。
【專利說明】
-種耐堿性α-淀粉酶及其基因工程菌的構(gòu)建方法和應用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于酶工程和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種耐堿性α-淀粉酶及其基因 工程菌的構(gòu)建方法和應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 淀粉酶是一類W淀粉、長鏈糊精和糖原等葡聚糖為底物的一類酶的總稱，按產(chǎn)生 底物異構(gòu)類型的不同可W分為α-淀粉酶和0-淀粉酶兩種;按淀粉水解方式的不同還可W內(nèi) 切型、外切型、脫枝和轉(zhuǎn)移等4個種類。α-淀粉酶即為內(nèi)切型淀粉酶的一種，其水解產(chǎn)物通常 為短鏈糊精、寡糖和葡萄糖，在食品、制藥、酒精、有機酸W及飼料和洗涂行業(yè)具有廣泛應 用。
[0003] 普通α-淀粉酶的作用抑范圍較窄，一般在抑5.0-8.0之間，而在該抑范圍之外的理 化條件下催化活力急劇下降而無法滿足工藝使用需求。通常采取的措施是改變加工工藝， 分段處理，W滿足淀粉酶的使用條件，運樣處理的結(jié)果是能源消耗大，費時費力且為環(huán)保處 理帶來壓力。因此，隨著行業(yè)發(fā)展的細化和不同加工處理領(lǐng)域條件的限制，對淀粉酶催化性 質(zhì)、性能的要求也越來越高，而傳統(tǒng)的普通α-淀粉酶更是無法滿足各應用領(lǐng)域的需求，從而 產(chǎn)生了對特殊淀粉酶如耐酸性淀粉酶、耐堿性淀粉酶或低溫淀粉酶的巨大需求。其中，耐堿 性曰-淀粉酶是指一類可W在堿性環(huán)境中(Ρ朋.0-11.0)對淀粉產(chǎn)生水解作用的一類淀粉酶， 在洗涂和紡織退漿等特殊的堿性處理工藝環(huán)境中對提高洗涂效率、改進退漿工藝等具有重 要應用和巨大需求。在2005年和2008年丹麥Novozymes公司前后推出了堿性α-淀粉酶產(chǎn)品 并在紡織退漿和洗涂劑中取得了較好應用效果。我國的中國科學院微生物所、武漢大學和 江南大學等科研院校亦相繼對堿性α-淀粉酶進行了大量研究，但截止目前我國在該酶的生 產(chǎn)領(lǐng)域尚屬空白，因此堿性α-淀粉酶已成為我國當前酶制劑行業(yè)亟待開發(fā)的品種之一。
[0004] 自1971年日本研究者化rikosM首次報道堿性α-淀粉酶W來，關(guān)于堿性α-淀粉酶 的研究報道陸續(xù)增多并主要集中在產(chǎn)生菌種的篩選、培養(yǎng)和酶的分離純化和性質(zhì)研究。堿 性α-淀粉酶的產(chǎn)生菌株通常是一類嗜堿微生物，該類微生物通常是一類酶表達量極低的原 始野生菌株，通過傳統(tǒng)誘變選育很難得到滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求的生產(chǎn)菌株。近年來隨著基 因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)的發(fā)展而逐漸在堿性α-淀粉酶的基因克隆、異源表達和酶分子改 造等方面加大了研究力度，同時也是目前快速對堿性α-淀粉酶基因進行克隆、改造和高效 表達一條重要途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 根據(jù)W上現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提出一種耐堿性α-淀粉 酶及其基因工程菌的構(gòu)建方法和應用，目的是使耐堿性α-淀粉酶具有異源高效表達性。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0007] -種耐堿性α-淀粉酶，所述耐堿性α-淀粉酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。 [000引編碼耐堿性α-淀粉酶的核巧酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009] -種含有權(quán)利要求1所述耐堿性α-淀粉酶的基因工程菌。
[0010] 所述耐堿性α-淀粉酶的基因工程菌的構(gòu)建方法，所述構(gòu)件方法包括如下步驟：
[0011] 步驟一，克隆耐堿性α-淀粉酶的基因到重組表達質(zhì)粒載體；
[0012] 步驟二，將重組表達質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到宿主細胞中。
[0013] 所述重組表達質(zhì)粒載體為pPIC9k質(zhì)粒。
[0014] 所述宿主細胞為P.pastoris GS115。
[0015] 步驟一所述克隆耐堿性α-淀粉酶的基因的制備方法為：W堿性芽抱桿菌染色體 DNA為模板，W簡并引物AlamyFl和AlamyRl為擴增引物，擴增引物序列分別如SEQ ID NO. 3 和如SEQ ID NO.4所示，通過PCR擴增方法得到耐堿性α-淀粉酶基因，將該基因與克隆載體 相連得到重組質(zhì)粒，并使用氯化巧轉(zhuǎn)化法導入大腸桿菌，之后進行抽提重組質(zhì)粒。優(yōu)選的 是，W嗜堿芽抱桿菌(Bacillus SP丄S-04)基因組DNA為模板并利用簡并引物，通過聚合酶 鏈式反應(PCR)技術(shù)擴增得到耐堿性α-淀粉酶全部編碼基因，將該基因與克隆載體PMD19- simple相連接獲得重組質(zhì)粒pMD-Alamy04并使用氯化巧轉(zhuǎn)化法導入大腸桿菌化.coli) JM109,抽提重組質(zhì)粒并測序獲得該基因的核巧酸序列及其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列信息。
[0016] 所述嗜堿芽抱桿菌(Bacillus sp.LS-04)為本發(fā)明人在研究中篩選獲得并發(fā)現(xiàn)具 有耐堿性α-淀粉酶分泌能力的菌株，并已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中屯、，保藏編號為CGMCC No. 11899，保藏日期2015年12月22日，保藏地點：中國科學院微 生物研究所。該嗜堿芽抱桿菌的相關(guān)保藏證明已于2016年4月6日提交專利申請時提交，其 申請的專利號為201610207503.5。
[0017] 所述簡并引物是通過對GenBank中公布的部分堿性α-淀粉酶基因序列進行比對和 分析而設(shè)計得到的。
[0018] 本發(fā)明中從嗜堿芽抱桿菌(Bacillus SP丄S-04)中克隆得到的耐堿性α-淀粉酶基 因具有W下特征：
[0019] (1)核巧酸數(shù)目為1545bp;
[0020] (2)6的6+〇含量為49.6%;
[0021 ] (3)與NCBI中 W公布的Exiguobacterium sp.ATlb全基因組序列（GenBank登錄號： CP001615.1)中的一段序列（1378199bp-1379741bp)的相似度最高(96%)，但仍有4%的核 巧酸序列信息的差異，表明本發(fā)明中獲得的一種耐堿性α-淀粉酶是一條未報道的新基因。
[0022] 本發(fā)明中從嗜堿芽抱桿菌(Bacillus sp.LS-04)中克隆得到的耐堿性α-淀粉酶具 有W下特征
[0023] (1)所含氨基酸數(shù)目為514個；
[0024] (2)蛋白質(zhì)分子量MW=57.3邸a;
[0025] (3)蛋白質(zhì)氨基端1-28個氨基酸為信號膚序列；
[00%] (4)蛋白質(zhì)成熟膚等電點pl = 6.58;
[0027] (5)酶的反應溫度為30-70°C，優(yōu)選反應溫度為40-60°C ;
[002引 （6)酶的反應抑為8.0-11.0，優(yōu)選反應抑為9.0-10.0;
[0029] (7)酶在50°C、pH9.0條件下的半衰期為90min;
[0030] 步驟一所述克隆耐堿性α-淀粉酶的基因到重組表達質(zhì)粒載體的方法為:通過耐堿 性α-淀粉酶成熟膚編碼基因設(shè)計引物對，W所述重組質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，使用限制性 核酸內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進行雙酶切并與同等雙酶切的表達質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化獲得重組表達質(zhì) 粒載體。優(yōu)選的是，W耐堿性α-淀粉酶成熟膚編碼基因為基礎(chǔ)設(shè)計一對引物，引物對的序列 如沈9 10^.5和如569 10^.6所示，^重組質(zhì)粒910-413111704為模板進行?〇?擴增，使用 限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和Notl對PCR產(chǎn)物進行雙酶切并與同等雙酶切的表達型質(zhì)粒 pPIC9k相連接，轉(zhuǎn)化E. coli JM109，獲得重組質(zhì)粒pPIC9k-Alamy04，抽提該重組質(zhì)粒并使用 限制性核酸內(nèi)切酶Sail進行線性化酶切，膠回收酶切產(chǎn)物并通過電穿孔法導入宿主菌 P.pastoris GS115感受態(tài)細胞，再利用營養(yǎng)缺陷型平板和淀粉檢測平板篩選獲得具有耐堿 性α-淀粉酶表達能力的基因工程菌，即攜帶耐堿性α-淀粉酶基因的重組酵母。
[0031 ] 所述p.pastoris GS115感受態(tài)細胞，其制備方法為：接種p.pastoris GS115單菌 落于裝有15血YEPD培養(yǎng)基的Ξ角瓶(250mL)中，于30°C、200巧m培養(yǎng)1加后取0.5mL培養(yǎng)基 接種至裝有50mL新鮮YEPD培養(yǎng)基的Ξ角瓶(250mL)中，繼續(xù)在相同的條件下培養(yǎng)12h后于4 °C下離屯、收集細胞并用40mL冰水預冷的無菌雙蒸水洗涂兩次，然后使用20mL冰水預冷的 Imol/L山梨醇溶液洗涂一次，再使用0.2mL Imol/L山梨醇溶液重懸細胞，即制得酵母的感 受態(tài)細胞。
[0032] 所述電穿孔法，其操作步驟為：取10化線性化重組質(zhì)粒與80化酵母感受態(tài)細胞均 勻混合后轉(zhuǎn)移至冰預冷的電機杯(0.2cm)中，置于冰上放置5min后利用電穿孔儀進行電擊 (電場強度設(shè)定為7500V/cm)，電擊結(jié)束后立即加入ImL冰水預冷的Imol/L山梨醇溶液，混勻 后取0.5mL液體涂布于營養(yǎng)缺陷型平板。
[0033] 所述YEPD培養(yǎng)基配方為:每L含有酵母膏l(xiāng)Og，膜蛋白腺20g，葡萄糖20邑。
[0034] 所述營養(yǎng)缺陷型平板為MD平板，配方為:每L含有酵母氮基3.4g，硫酸錠lOg，生物 素〇.4mg，葡萄糖20g，瓊脂粉15邑。
[0035] 所述淀粉檢測平板配方為:每L含有酵母氮基3.4g，硫酸錠lOg，生物素0.4mg，甲醇 5g，可溶性淀粉5g，瓊脂粉15g。
[0036] 所述構(gòu)建方法得到的工程菌在耐堿性α-淀粉酶生產(chǎn)中的應用。
[0037] A、種子搖瓶培養(yǎng)
[0038] 挑取重組酵母在淀粉檢測平板中劃線培養(yǎng)36-4化后，接種一個單菌落至15-20mL 液態(tài)YEPD培養(yǎng)基，于30°C、200rpm條件下培養(yǎng)20-2化后離屯、收集菌體并將菌體全部轉(zhuǎn)移至 25-35mL BMGY培養(yǎng)基，繼續(xù)在30°C、200巧m條件下培養(yǎng)12-2化后作為種子液備用。
[0039] 所述BMGY培養(yǎng)基配方為：每L含有酵母膏l(xiāng)Og，蛋白腺20g，酵母氮基3.4g，硫酸錠 lOg，生物素0.4mg，甘油lOg，憐酸鐘緩沖液（lmol/L，p冊.0) lOOmL。
[0040] 所述搖瓶均為250mLS角瓶。
[0041] B、液態(tài)搖瓶發(fā)酵
[0042] 離屯、收取上述25-30mL種子液中菌體并全部轉(zhuǎn)移至35-45mL BMMY培養(yǎng)基，于30°C、 20化pm條件下培養(yǎng)，每隔12-24h向搖瓶中補加0.2-0.4mL甲醇，同時吸取ImL發(fā)酵液并離屯、 收取上清，進行耐堿性α-淀粉酶活力測定。
[0043] 所述ΒΜΜΥ培養(yǎng)基配方為:每L含有酵母膏l(xiāng)Og，蛋白腺20g，酵母氮基3.4g，硫酸錠 lOg，生物素0.4mg，甲醇5mL，憐酸鐘緩沖液（lmol/L，p冊.0) lOOmL。
[0044] 所述搖瓶均為250mLS角瓶。
[0045] 所述耐堿性α-淀粉酶活力測定方法為：
[0046] a、采用水楊巧法測定:準確吸取適當稀釋的酶液0.5mL，加入ImLl%可溶性淀粉溶 液(溶于抑9.5的甘氨酸-氨氧化鋼緩沖液)及0.5mL P朋.5的甘氨酸-氨氧化鋼緩沖液，于40 °C保溫30min后加入3mLDNS試劑沸水浴lOmin，冷卻后加水稀釋至25mL，測定520nm處吸光 值。
[0047] b、堿性淀粉酶活力定義為:在上述反應條件下，每小時水解1%的可溶性淀粉生成 Img還原糖所需的淀粉酶的量為一個酶活力單位化)。
[004引本發(fā)明有益效果是：
[0049] 1、本發(fā)明的耐堿性α-淀粉酶基因與NCBI中W公布的Exiguobacterium sp .AUb全 基因組序列(GenBank登錄號:CP001615.1)中的一段序列（1378199bp- 13797"bp)的相似度 最高(96%)，但仍有4%的核巧酸序列信息的差異，表明本發(fā)明中獲得的一種耐堿性α-淀粉 酶是一條未報道的新基因；
[0050] 2、本發(fā)明的基因工程菌利用酵母α-化Ctor信號膚引導獲得了耐堿性α-淀粉酶成 熟膚的細胞外高效分泌表達。
[0051 ] 3、本發(fā)明的耐堿性α-淀粉酶在Ρ冊.0-11.0范圍內(nèi)對淀粉均變現(xiàn)出良好的催化活 性，可被應用于紡織退漿或洗涂助劑等領(lǐng)域。
[0052] 4、本發(fā)明的耐堿性α-淀粉酶具有良好的耐堿性能，在抑11.0條件下發(fā)揮最大催化 活力的50% W上。
【附圖說明】
[0053] 下面對本說明書附圖所表達的內(nèi)容及圖中的標記作簡要說明：
[0054] 圖1是本發(fā)明的重組質(zhì)粒pPIC-Alamy04物理圖譜；
[0055] 圖2是本發(fā)明的耐堿性α-淀粉酶不同溫度與相對酶活力的關(guān)系圖；
[0056] 圖3是本發(fā)明的耐堿性α-淀粉酶不同抑與相對酶活力的關(guān)系圖；
[0057] 圖4是本發(fā)明的耐堿性α-淀粉酶不同時間、溫度與相對酶活力的關(guān)系圖。
【具體實施方式】
[0058] 下面對照附圖，通過對實施例的描述，對本發(fā)明作進一步詳細的說明，W幫助本領(lǐng) 域技術(shù)人員對本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思、技術(shù)方案有更完整、準確和深入的理解。
[0化9]實施例1
[0060] 耐堿性α-淀粉酶基因克?。?br>[0061] 具體包括：
[0062] Α、堿性芽抱桿菌(Bacillus sp.化S-04染色體DNA提取
[0063] 使用SDS抽提法，具體步驟如下：
[0064] 將堿性芽抱桿菌在液體培養(yǎng)基(每L培養(yǎng)基含有:酵母膏5g，蛋白腺lOg，氯化鋼5g， K此P〇4 Ig，使用Na2C〇3調(diào)節(jié)抑至9.5)中培養(yǎng)12h后，離屯、收集取3mL菌體并使用0.25mL20mg/ mL溶菌酶溶液重選細胞;于37°C水浴中放置30min后加入55化10%SDS(十二烷基硫酸鋼） 溶液并于65°C水浴中保溫60min;使用等體積酪:氯仿抽提兩次后再用等體積氯仿抽提一 次，取上清并加入2倍體積的無水乙醇混勻后于室溫沉淀20min，離屯、收集核酸沉淀并使用 75 %乙醇洗涂沉淀，收集核酸沉淀并于室溫干燥15min后加入SOiiL雙蒸水，置于4°C備用。
[0065] B、耐堿性α-淀粉酶基因擴增和序列測定
[0066] W堿性芽抱桿菌(Bacillus spjLS-04染色體DNA為模板，W簡并引物AlamyFl(5 '-CGATGTTYAAGAARCGACAAGGMATT-3')和AlamyRl (5 '-TATTATTGNTGTGTRTAGATGGAA-3')為擴 增引物，使用PCR方法擴增得到耐堿性α-淀粉酶基因片段。
[0067] PCR擴增體系（50yL)如下： 模板 DNA 0.5 mL dNTP 4 |_山 冊q DNA potym閒a說： 0.5 μΕ
[006引 上、下游引物 各0.5μΙ_ DNA polymerase bul'ffer .5 jiL' 熟蒸氷 游,5
[0069] PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后取化L，加入化L T4DNA連接酶、化L T4DNA連接酶緩沖液 和化L載體pMD-simple，于16°C下反應4h后通過氯化巧轉(zhuǎn)化法導入E. coli JM109感受態(tài)細 胞，使用抗性LB平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子并獲得重組質(zhì)粒pMD-Alamy04;抽提重組質(zhì)粒并委托生 工生物工程(上海)股份有限公司完成目的基因的序列測定，測定的耐堿性α-淀粉酶基因序 列為沈Q ID NO. 1。
[0070] 所述抗性LB平板配方為每L培養(yǎng)基含有:酵母膏5g，蛋白腺lOg，氯化鋼lOg，氨節(jié)青 霉素 lOOmg。
[0071 ] C、耐堿性α-淀粉酶基因編碼多膚鏈分析
[0072] 將耐堿性α-淀粉酶基因序列（SEQ ID Ν0.1)導入生物信息學分析軟件DNAMAN進行 蛋白質(zhì)翻譯分析，獲得其所編碼多膚鏈的氨基酸序列:SEQ ID NO.2。
[0073] 實施例2
[0074] 耐堿性α-淀粉酶基因工程菌的構(gòu)建：
[0075] 具體包括：
[0076] Α、不含信號膚編碼序列耐堿性α-淀粉酶基因的克隆
[0077] 取實施例1中獲得的重組質(zhì)粒pMD-Alamy04為模板，W引物AlamyF2 ( 5 '- ACGAATTCGCAACTCCACAGAACGGTACGATGATGCA-3<)和AlamyR2(5<- TAGCGGCCGCTTATTGTTGTGTATAGATGGAA-3')為擴增引物，獲得不含信號膚編碼序列的淀粉酶 基因。PCR反應體系同實施例1所述。
[0078] B、耐堿性α-淀粉酶基因表達載體的構(gòu)建
[0079] 膠回收上述步驟中的PCR產(chǎn)物并使用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和Notl在37°C下酶 切作用化，然后于65°C加熱滅酶20min;將上述淀粉酶基因的酶切產(chǎn)物與同樣酶切處理的表 達型質(zhì)粒pPIC化相連接，獲得重組質(zhì)粒pPIC-Alamy04。所述連接方法和陽性克隆的篩選方 法同實施例1所述。
[0080] 所得重組質(zhì)粒pPIC-Alamy04,耐堿性α-淀粉酶基因插入到pPIC9k多克隆位點 EcoRI和Notl之間，使不含信號膚的耐堿性α-淀粉酶基因在pPIC化質(zhì)粒所攜帶的醇脫氨酶 強啟動子(A0XI)和酵母α-化ctor信號膚的作用下進行細胞外分泌表達。重組質(zhì)粒pPIC- Alamy04的物理圖譜如圖1所示。
[0081 ] C、重組酵母的構(gòu)建
[0082] 在35化(2yg)重組質(zhì)粒pPIC-Alamy04溶液中加入化L(IOU)限制性核酸內(nèi)切酶Sail 和4yLSal酶切緩沖液并于37°C反應4h后，于65°C下滅酶20min，然后使用DNA純化試劑盒進 行純化并使用30化雙蒸水進行洗涂，得到線性化質(zhì)粒溶液;取10化線性化質(zhì)粒溶液與60化 P.pastoris GS115感受態(tài)細胞混勻后使用電穿孔法進行轉(zhuǎn)化;立即在上述處理后的混合液 中加入5(Κ)化山梨醇溶液(0.5mol/L)，混勻后全部吸出并涂布于營養(yǎng)缺陷型平板(MD)，于30 °C培養(yǎng)4d后挑取單菌落并點種淀粉檢測平板，繼續(xù)培養(yǎng)3d后于平板中加入lOmL甘氨酸-氨 氧化鋼緩沖液(PH9.5)并在5(TC培養(yǎng)箱中靜置30min后，倒出緩沖液并自然驚干平板后使用 盧卡式艦液進行染色，經(jīng)艦液染色后出現(xiàn)透明圈的轉(zhuǎn)化子即為具有胞外表達耐堿性α-淀粉 酶能力的重組酵母。
[0083] 實施例3重組酵母發(fā)酵產(chǎn)耐堿性α-淀粉酶及性質(zhì)研究
[0084] 挑取重組酵母在淀粉檢測平板中劃線培養(yǎng)40h后，接種一個單菌落至20mL液態(tài) YEPD培養(yǎng)基，于30°C、200巧m條件下培養(yǎng)20h后離屯、收集菌體并將菌體全部轉(zhuǎn)移至30mL BMGY培養(yǎng)基，繼續(xù)在30°C、200rpm條件下培養(yǎng)1化后離屯、收集菌體并全部轉(zhuǎn)移至40mL BMMY 培養(yǎng)基，于30°C、200rpm條件下培養(yǎng)，每隔12h向搖瓶中補加0.2ml甲醇，發(fā)酵96h后，發(fā)酵液 中耐堿性α-淀粉酶活力達到3120U/mL，其活力單位約是原始菌種的44倍，表明重組耐堿性 曰-淀粉酶實現(xiàn)了異源高效表達。重組耐堿性α-淀粉酶最適作用溫度為50°C(圖2)，最適作用 抑為9.5(圖3)，在50°C、pH9.5條件下的半衰期為90min(圖4)。
[0085] 上面結(jié)合附圖對本發(fā)明進行了示例性描述，顯然本發(fā)明具體實現(xiàn)并不受上述方式 的限制，只要采用了本發(fā)明的方法構(gòu)思和技術(shù)方案進行的各種非實質(zhì)性的改進，或未經(jīng)改 進將本發(fā)明的構(gòu)思和技術(shù)方案直接應用于其它場合的，均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā) 明的保護范圍應該W權(quán)利要求書所限定的保護范圍為準。
【主權(quán)項】
1. 一種耐堿性α-淀粉酶，其特征在于，所述耐堿性α-淀粉酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述耐堿性α-淀粉酶，其特征在于，編碼耐堿性α-淀粉酶的核苷酸序 列如SEQ ID NO.2所示。3. -種含有權(quán)利要求1所述耐堿性α-淀粉酶的基因工程菌。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述耐堿性α-淀粉酶的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu) 件方法包括如下步驟： 步驟一，克隆耐堿性α-淀粉酶的基因到重組表達質(zhì)粒載體； 步驟二，將重組表達質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到宿主細胞中。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述耐堿性α-淀粉酶的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述重 組表達質(zhì)粒載體為pPIC9k質(zhì)粒。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述耐堿性α-淀粉酶的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述宿 主細胞為P.pastoris GS115。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述耐堿性α-淀粉酶的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟一 所述克隆耐堿性α-淀粉酶的基因的制備方法為：以堿性芽孢桿菌染色體DNA為模板，以簡并 引物AlamyFl和AlamyRl為擴增引物，擴增引物序列分別如SEQIDN0.3和如SEQIDN0.4所 示，通過PCR擴增方法得到耐堿性α-淀粉酶基因，將該基因與克隆載體相連得到重組質(zhì)粒， 并使用氯化鈣轉(zhuǎn)化法導入大腸桿菌，之后進行抽提重組質(zhì)粒。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述耐堿性α-淀粉酶的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟一 所述克隆耐堿性α-淀粉酶的基因到重組表達質(zhì)粒載體的方法為:通過耐堿性α-淀粉酶成熟 肽編碼基因設(shè)計引物對，引物對的序列如SEQ ID NO.5和如SEQ ID NO.6所示，以所述重組 質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，使用限制性核酸內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進行雙酶切并與同等雙酶切的 表達質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化獲得重組表達質(zhì)粒載體。9. 根據(jù)權(quán)利要求4至8任一項所述構(gòu)建方法得到的工程菌在耐堿性α-淀粉酶生產(chǎn)中的 應用。
【文檔編號】C12N15/81GK106011107SQ201610498392
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月30日
【發(fā)明人】李松, 湯斌, 楊倩, 魏勝華, 陶玉貴, 葛飛, 朱龍寶, 李婉珍
【申請人】安徽工程大學