用于制備葡聚糖聚合物的葡糖基轉(zhuǎn)移酶的制作方法【專利摘要】本文公開了組合物，其包含具有至少1000的重均聚合度(DPw)的聚α?1，3?1，6?葡聚糖。該葡聚糖聚合物包含至少30％α?1，3鍵和至少30％α?1，6鍵。也公開了合成聚α?1，3?1，6?葡聚糖的葡糖基轉(zhuǎn)移酶。還公開了聚α?1，3?1，6?葡聚糖的醚衍生物以及使用此類衍生物作為粘度調(diào)節(jié)劑的方法?！緦＠f明】用于制備葡聚糖聚合物的葡糖基轉(zhuǎn)移酶[00011本申請要求美國臨時申請61/939,811(提交于2014年2月14日）的權益，其全文以引用方式并入本文。
技術領域：
[0002]本發(fā)明屬于多糖及多糖衍生物領域。特別地，本發(fā)明涉及某些聚α-1，3_1，6-葡聚糖、合成這些葡聚糖的葡糖基轉(zhuǎn)移酶、這些葡聚糖的醚以及這樣的醚作為粘度調(diào)節(jié)劑的用途?！?br>背景技術：
】[0003]期望利用酶促合成或微生物的遺傳工程來發(fā)現(xiàn)新結(jié)構(gòu)多糖，研究人員已發(fā)現(xiàn)可生物降解并且可由可再生來源的原料經(jīng)濟地制備的多糖。一種這樣的多糖是聚α-1，3_葡聚糖，一種以具有α-1，3-糖苷鍵為特征的葡聚糖聚合物。[0004]已通過使鹿糖的水性溶液與從唾液鏈球菌（Streptococcussalivarius)分離的葡糖基轉(zhuǎn)移酶(gtf)接觸分離到聚α-l，3-葡聚糖(Simpson等人，Microbiology141:1451-1460，1995)。美國專利7,000,000公開了使用唾液鏈球菌(3.8&1丨抑4118)8七打酶來制備多糖纖維。該纖維的聚合物中的至少50%己糖單元通過α-1，3_糖苷鍵連接。所公開的聚合物當將其以高于臨界濃度溶解于溶劑或包含溶劑的混合物中時形成液晶溶液。由該溶液，紡制并使用高度適用于紡織物的連續(xù)的、結(jié)實的棉樣纖維。[0005]鑒于新葡聚糖多糖及其衍生物在多種應用中的潛在實用性，它們的開發(fā)是期望的。還期望鑒定可合成新葡聚糖多糖，尤其是具有混合糖苷鍵和高分子量的那些的葡糖基轉(zhuǎn)移酶。【
發(fā)明內(nèi)容】[0006]在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種反應溶液，其包含水、蔗糖和合成聚α-1，3-1，6-葡聚糖的葡糖基轉(zhuǎn)移酶。所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶包含與SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10至少90%相同的氨基酸序列。[0007]在第二實施方案中，（i)通過所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶合成的聚α-1，3_1，6-葡聚糖的至少30%糖苷鍵是α-l，3鍵，（ii)通過所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶合成的聚α-l，3-1，6-葡聚糖的至少30%糖苷鍵是α-l，6鍵，并且（iii)通過所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶合成的聚α-l，3-1，6-葡聚糖具有至少1000的重均聚合度(DPW)。[0008]在第三實施方案中，通過所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶合成的聚α-1，3-1，6-葡聚糖的至少60%糖苷鍵是α-l，6糖苷鍵。[0009]在第四實施方案中，通過所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶合成的聚α-1，3-1，6-葡聚糖的DPwS至少10000。[0010]在第五實施方案中，所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶包含SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10的氨基酸序列。[0011]在第六實施方案中，本發(fā)明涉及一種用于制備聚α-1，3-1，6-葡聚糖的方法，該方法包括使至少水、蔗糖和合成聚α-l，3_1，6_葡聚糖的葡糖基轉(zhuǎn)移酶接觸的步驟。所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶包含與SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8或SEQIDN0:10至少90%相同的氨基酸序列。在該方法中制備的聚α-1，3_1，6-葡聚糖可任選地是分離的。[0012]在第七實施方案中，（i)在所述方法中通過所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶合成的聚α-1，3_1，6-葡聚糖的至少30%糖苷鍵是α-l，3鍵，（ii)所述聚α-l，3-1，6_葡聚糖的至少30%糖苷鍵是α-l，6鍵，并且(iii)所述聚α-l，3_1，6_葡聚糖具有至少1000的DPW。[0013]在第八實施方案中，在所述方法中通過所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶合成的聚α-l，3-l，6-葡聚糖的至少60%糖苷鍵是α-l，6鍵。[0014]在第九實施方案中，在所述方法中通過所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶合成的聚α-l，3-1，6-葡聚糖的DPW為至少10000。[0015]序列簡述[0016]表1.核酸和蛋白質(zhì)序列號概述【具體實施方式】[0018]所引用的全部專利和非專利文獻的公開內(nèi)容全文以引用方式并入本文。[0019]如本文所用，術語"發(fā)明"或"所公開發(fā)明"并非旨在進行限制但一般性地適用于權利要求書中限定的或本文中所述的任何發(fā)明。這些術語在本文中可互換使用。[0020]本文中的術語"葡聚糖"是指D-葡萄糖單體通過糖苷鍵連接的多糖。[0021]術語"糖苷鍵(glycosidiclinkage)"和"糖苷鍵(glycosidicbond)"在本文中可互換使用并且是指將一個碳水化合物分子與另一個碳水化合物分子連接的共價鍵的類型。本文中使用的術語"α-1，3_糖苷鍵"是指將α-D-葡萄糖分子通過相鄰α-D-葡萄糖環(huán)上的碳1和3彼此連接的共價鍵的類型。本文中使用的術語"α-1，6_糖苷鍵"是指將α-D-葡萄糖分子通過相鄰α-D-葡萄糖環(huán)上的碳1和6彼此連接的共價鍵的類型。在本文中，將"α-D-葡萄糖"稱為"葡萄糖"。除非另外指出，否則本文中公開的所有糖苷鍵均是糖苷鍵。[0022]本文的聚a-l，3_l，6-葡聚糖的糖苷鍵分布可使用本領域中已知的任何方法來確定。例如，可使用利用核磁共振(NMR)光譜學(例如，13CNMR或1HNMR)的方法來確定鍵分布?？墒褂玫倪@些以及其它方法在FoodCarbohydrates：Chemistry,PhysicalProperties，andApplications(S.W.Cui編輯，第3章，S.W.Cui，StructuralAnalysisofPolysaccharides，Taylor&FrancisGroupLLC，BocaRaton，F(xiàn)L，2005)中進行了公開，其以引用方式并入本文。[0023]術語"聚α_!，3_!，6_葡聚糖"、"聚α_!，3_!，6_葡聚糖聚合物"和"聚(α_!，3)(α-i，6)葡聚糖"在本文中可互換使用(注意:這些術語中鍵指示"1，3"和"1，6"的順序不重要）。本文的聚a-l，3_l，6-葡聚糖是包含通過糖苷鍵連接在一起的葡萄糖單體單元的聚合物，其中至少約30%的糖苷鍵是€(-1，3-糖苷鍵，并且至少約30%的糖苷鍵是€[-1，6-糖苷鍵。聚€[-1，3-1，6_葡聚糖是一種類型的包含混合糖苷鍵成分的多糖。在某些實施方案中，術語聚a-1，3-1，6-葡聚糖的含義不包括"交替聚糖(&1丨從1^10"，其是包含連續(xù)地彼此交替的€[-1，3鍵和a-1，6鍵的葡聚糖（美國專利5702942、美國專利申請公開2006/0127328)。"連續(xù)地彼此交替"的a-1，3鍵和a-1，6鍵可直觀地表示為例如...G-l，3-G-1，6-G-1，3-G-1，6-G-1，3-G-1，6-G-l，3-G'··，其中G表不匍甸糖。[0024]本文的聚a-l，3-l，6-葡聚糖例如可通過包含與SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10至少90%相同的氨基酸序列的葡糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生。這樣的產(chǎn)生可來自于本文的gtf反應。[0025]本文的術語"蔗糖"是指由通過a-1，2_糖苷鍵連接的a-D-葡萄糖分子和β-D-果糖分子構(gòu)成的非還原性二糖。通常將鹿糖稱為食糖(tablesugar)。[0026]本文的聚α-1，3-1，6-葡聚糖或聚α-1，3-1，6-葡聚糖醚化合物的"分子量"可表示為數(shù)均分子量(Μη)或重均分子量(Mw)。另選地，分子量可表示為道爾頓、克/摩爾、DPW(重均聚合度)或DPn(數(shù)均聚合度）。用于計算這些分子量量度的多種方式在本領域中是已知的，例如高壓液相色譜(HPLC)、尺寸排阻色譜(SEC)或凝膠滲透色譜(GPC)。[0027]術語"葡糖基轉(zhuǎn)移酶"、"gtf酶"、"gtf酶催化劑"、"gtf"和"葡聚糖蔗糖酶"在本文中可互換使用。本文的gtf酶的活性催化底物蔗糖反應產(chǎn)生產(chǎn)物聚α-1，3_1，6-葡聚糖和果糖。gtf反應的其它產(chǎn)物(副產(chǎn)物)可包括葡萄糖(其中葡萄糖由葡糖基-gtf酶中間體復合物水解而來）、多種可溶性寡糖和明串珠菌二糖(其中葡糖基-gtf酶中間體復合物的葡萄糖與果糖連接）。明串珠菌二糖是由通過α-l，5鍵連接的葡萄糖和果糖構(gòu)成的二糖。葡糖基轉(zhuǎn)移酶的野生型形式一般包含(在Ν末端至C末端方向上)信號肽、可變域、催化域和葡聚糖結(jié)合域。本文的gtf根據(jù)CAZy(Carbohydrate-ActiveEnZymes，碳水化合物活性酶)數(shù)據(jù)庫而歸類于糖苷水解酶家族70(GH70)之下（Cantarel等人，NucleicAcidsRes.37:D233-238，2009)〇[0028]術語"葡糖基轉(zhuǎn)移酶催化域"和"催化域"在本文中可互換使用并且是指賦予葡糖基轉(zhuǎn)移酶聚α-l，3_1，6_葡聚糖產(chǎn)生活性的葡糖基轉(zhuǎn)移酶域。[0029]術語"gtf反應"和"酶促反應"在本文中可互換使用并且是指通過葡糖基轉(zhuǎn)移酶進行的反應。本文中使用的"gtf反應溶液"一般性地指這樣的溶液，其在含有蔗糖和水的溶液中包含至少一種活性葡糖基轉(zhuǎn)移酶并且任選地包含其它組分。在gtf反應溶液中進行使水、蔗糖和葡糖基轉(zhuǎn)移酶接觸的步驟。本文中使用的術語"在合適的gtf反應條件下"是指支持鹿糖通過葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性轉(zhuǎn)化為聚α-l，3_1，6_葡聚糖的gtf反應條件。本文的gtf反應不是天然存在的。[0030]術語"按體積計百分比"、"體積百分比"、"vol%"和"v/v%"在本文中可互換使用。溶劑中溶質(zhì)的按體積計百分比可使用下式來確定：[(溶質(zhì)的體積）八溶液的體積）]χ100%〇[0031]術語"按重量計百分比"、"重量百分比(wt%)"和"重量-重量百分比（％w/w)"在本文中可互換使用。按重量計百分比是指物質(zhì)在其包含于組合物、混合物或溶液中時以質(zhì)量計的百分比。[0032]術語"增加的"、"增強的"、和"提高的"在本文中可互換使用。這些術語是指更大的量或活性，例如大于原始量或活性的量或活性，或者與原始量或活性相比大大過量的量或活性，并且包括介于其之間的所有量或活性。另選地，這些術語可指例如這樣的量或活性，其至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%大于正與增加的量或活性比較的量或活性。[0033]術語"多核苷酸"、"多核苷酸序列"和"核酸序列"在本文中可互換使用。這些術語涵蓋核苷酸序列等。多核苷酸可以是RNA或DNA的聚合物，其可以是單鏈或雙鏈的、任選地包含合成的、非天然的或經(jīng)改變的核苷酸堿基。多核苷酸可由cDNA、基因組DNA、合成DNA或它們的混合物的一個或多個片段構(gòu)成。[0034]本文中使用的術語"基因"是指表達蛋白質(zhì)的多核苷酸序列，并且其可指單獨的編碼區(qū)或者可包含該編碼區(qū)上游和/或下游的調(diào)控序列（例如，該編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄起始位點上游的5'非翻譯區(qū)）。"天然"或"內(nèi)源"基因是指具有其自身調(diào)控序列的天然可見的基因；該基因以其天然位置位于生物體基因組中。"嵌合基因"是指不是天然基因的任何基因，其包含不同時天然可見的調(diào)控序列和編碼序列。"外來"或"異源"基因是指通過基因轉(zhuǎn)移到入到宿主生物體內(nèi)的基因。外來基因可包括插入到非天然生物體內(nèi)的天然基因、導入到天然宿主內(nèi)的新位置的天然基因，或嵌合基因。本文公開的某些實施方案中的多核苷酸序列是異源的。"轉(zhuǎn)基因"是已通過轉(zhuǎn)化操作導入基因組中的基因。"經(jīng)密碼子優(yōu)化的基因"是其密碼子使用頻率已設計成模擬特定宿主細胞之優(yōu)選密碼子使用的頻率的基因。[0035]本文中使用的術語"重組的"或"異源的"是指例如通過化學合成或通過借助遺傳工程技術操作分離的核酸片段的兩個原本單獨序列片段的人工組合。術語"重組的"、"轉(zhuǎn)基因的"、"經(jīng)轉(zhuǎn)化的"、"工程化的"或"改造成用于外源基因表達的"在本文中可互換使用。[0036]本文中使用的術語"轉(zhuǎn)化"指將核酸分子轉(zhuǎn)移到宿主生物體內(nèi)。核酸分子可以是自主復制的質(zhì)粒，或者它可以整合到宿主生物體的基因組中。包含轉(zhuǎn)化核酸片段的宿主生物體是"轉(zhuǎn)基因的"、"重組的"或"經(jīng)轉(zhuǎn)化的"，并且可稱為"轉(zhuǎn)化體"。[0037]天然氨基酸序列或多核苷酸序列是天然存在的，而非天然氨基酸序列或核苷酸序列在自然界中不存在。[0038]本文中使用的"編碼序列"是指編碼特定氨基酸序列的DNA序列。本文中使用的"調(diào)控序列"是指位于編碼序列的轉(zhuǎn)錄起始位點上游的核苷酸序列，即5'非翻譯區(qū)和3'非編碼區(qū)，并且其可影響相關編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性，或者翻譯。調(diào)控序列可包括啟動子、增強子、沉默子、5'非翻譯前導序列、內(nèi)含子、多腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效應子結(jié)合位點、莖-環(huán)結(jié)構(gòu)以及參與基因表達調(diào)控的其它元件。[0039]本文中關于多核苷酸或多肽序列使用的術語"序列同一性"或"同一性"是指當在指定比較窗內(nèi)比對最大對應性時兩條序列中相同的核酸堿基或氨基酸殘基。因此，"序列同一性百分比"或"同一性百分比"指通過在比較窗內(nèi)比較兩個最佳比對序列來確定的值，其中與參照序列(其不包含添加或缺失)相比，比較窗中多核苷酸或多肽序列的一部分可包含添加或缺失（即，空位）以實現(xiàn)兩條序列的最佳比對。如下計算所述百分比：確定在兩條序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目以得到匹配的位置的數(shù)目，將匹配的位置的數(shù)目除以比較窗中的總位置數(shù)目，并將結(jié)果乘以1〇〇以得到序列同一性百分比。[0040]可使用可在NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)網(wǎng)站在線可用的基本局部比對檢索工具(BLAST)算法例如來測量本文中公開的兩條或更多條多核苷酸序列（BLASTN算法）或多肽序列（BLASTP算法）之間的百分比同一性。另選地，可使用Clustal算法（例如，ClustalW或ClustalV)來實現(xiàn)序列之間的百分比同一"性。對于使用Clustal比對方法的多重比對，默認值可對應于GAPPENALTY=10和GAPLENGTHPENALTY=10。用Clustal方法進行逐對比對和計算蛋白質(zhì)序列的百分比同一性的默認參數(shù)可以是KTUPLE=1、GAPPENALTY=3、WIND0W=5和DIAGONALSSAVED=5。對于核酸，這些參數(shù)可以是KTUPLE=2、GAPPENALTY=5、WIND0W=4和DIAGONALSSAVED=4。仍另選地，可利用EMBOSS算法(例如，needle)使用BL0SUM矩陣(例如BL0SUM62)用以下參數(shù)來實現(xiàn)序列之間的百分比同一性：例如GAP0PEN=10、GAPEXTEND=0.5、ENDGAPPENALTY=錯誤、ENDGAP0PEN=10、ENDGAPEXTEND=0.5。[0041]本文中公開了多種多肽氨基酸序列和多核苷酸序列作為某些實施方案的特征?？墒褂门c本文所公開序列至少約70-85%、85-90%或90%-95%相同的這些序列的變體。另選地，變體氨基酸序列或多核苷酸序列可與本文所公開的序列具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。變體氨基酸序列或多核苷酸序列可具有所公開序列的相同功能/活性，或者具有所公開序列的至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%功能/活性。[0042]在某些實施方案中使用的術語"分離的"是指已從其天然來源完全或部分純化的任何細胞組分(例如，分離的多核苷酸或多肽分子）。在一些情況下，分離的多核苷酸或多肽分子是較大組合物、緩沖體系或試劑混合物的一部分。例如，分離的多核苷酸或多肽分子可以以異源方式包含在細胞或生物體內(nèi)。另一示例是分離的葡糖基轉(zhuǎn)移酶。[0043]術語"聚α-1，3-1，6-葡聚糖醚化合物"、"聚α-1，3-1，6-葡聚糖醚"和"聚α-1，3-1，6-葡聚糖醚衍生物"在本文中可互換使用。本文的聚α-1，3_1，6-葡聚糖醚化合物是已醚化有一個或多個有機基團的聚α-1，3-1，6-葡聚糖，使得該化合物具有約0.05至約3.0的有機基團取代度(DoS)。這樣的醚化發(fā)生在聚α-1，3-1，6-葡聚糖的至少30%葡萄糖單體單元的一個或多個羥基處。[0044]聚α-1，3-1，6-葡聚糖醚化合物由于含有亞結(jié)構(gòu)CcOC而在本文中稱為"醚"，其中"Cc"表示聚α-1，3-1，6_葡聚糖醚化合物的葡萄糖單體單元的碳原子(其中這樣的碳原子與該醚的聚α-1，3_1，6-葡聚糖前體中的羥基[0Η]鍵合），并且其中"C"表示有機基團的碳原子。因此，例如，關于參與本文醚中的-1，3-G-1，3-的葡萄糖單體單元(G)，葡萄糖(G)的Cc原子2、4和/或6可獨立地與0Η基團連接，或者與有機基團醚連接。類似地，例如，關于參與本文醚中的-1，3-G-1，6-的葡萄糖單體單元(G)，葡萄糖(G)的CG原子2、4和/或6可獨立地與0Η基團連接，或者與有機基團醚連接。此外，例如，關于參與本文醚中的-1，6-G-1，6-的葡萄糖單體單元(G)，葡萄糖(G)的CG原子2、3和/或4可獨立地與0H基團連接，或者與有機基團醚連接。類似地，例如，關于參與本文醚中的-1，6-G-1，3-的葡萄糖單體單元(G)，葡萄糖(G)的Cc原子2、3和/或4可獨立地與0Η基團連接，或者與有機基團醚連接。[0045]應理解，本文的聚α-1，3-1，6-葡聚糖醚化合物的"葡萄糖"單體單元通常具有一個或多個醚連接的有機基團。因此，還可將這樣的葡萄糖單體單元稱為醚化葡萄糖單體單元。[0046]本文公開的聚α-1，3-1，6_葡聚糖醚化合物是合成的人造化合物。同樣地，包含聚α-1，3-1，6-葡聚糖(例如，分離的聚α-1，3-1，6-葡聚糖）的組合物是合成的人造化合物。[0047]本文中使用的"有機基團"是指一個或跟更多個碳的鏈，其（i)具有式_CnH2n+1(即，完全飽和的烷基）或者（ii)大部分是飽和的但是一個或多個氫被另一原子或官能團取代(即，"被取代的烷基"）。這樣的取代可以是一個或多個羥基、氧原子（從而形成醛或酮基團）、羧基或其它烷基。因此，作為示例，本文的有機基團可以是烷基、羧基烷基或羥基烷基。[0048]本文的"羧基烷基"基團是指其中烷基的一個或多個氫原子被羧基取代的被取代烷基。本文的"羥基烷基"基團是指其中烷基的一個或多個氫原子被羥基取代的被取代烷基。[0049]本文的"鹵化物"是指包含一個或多個鹵素原子(例如，氟、氯、溴、碘)的化合物。本文的鹵化物可指包含一個或多個鹵離子基團（例如，氟、氯、溴或碘）的化合物。鹵離子基團可充當醚化劑的反應基團。[0050]術語"反應"、"反應組合物"和"醚化反應"在本文中可互換使用并且是指至少包含聚α-1，3-1，6_葡聚糖和醚化劑的反應。通常將這些組分混合(例如，得到漿料)和/或溶解于含有堿金屬類氫氧化物的溶劑(有機溶劑和/或水性溶劑）中。將反應放置在適于醚化劑用有機基團醚化聚α-1，3-1，6_葡聚糖的葡萄糖單元的一個或多個羥基的條件(例如，時間、溫度)下，從而產(chǎn)生聚α-1，3-1，6-葡聚糖醚化合物。[0051]本文的術語"堿性條件"是指pH為至少11或12的溶液或混合物。堿性條件可通過本領域中已知的任何方式，例如通過將堿金屬類氫氧化物溶解于溶液或混合物中來制備。[0052]術語"醚化劑"和"烷基化劑"在本文中可互換使用。本文的醚化劑是指可用于用有機基團醚化聚α-1，3-1，6_葡聚糖的葡萄糖單元的一個或多個羥基的試劑。因此，醚化劑含有有機基團。[0053]本文的術語"聚α-1，3_1，6-葡聚糖漿料"是指包含葡糖基轉(zhuǎn)移酶酶促反應的諸如以下組分的水性混合物:例如聚α-l，3-1，6-葡聚糖、蔗糖、一種或多種葡糖基轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖和果糖。[0054]本文的術語"聚α-1，3_1，6-葡聚糖濕濾餅"是指已與漿料分離并用水或水性溶液洗滌的聚α-l，3-1，6-葡聚糖。在制備濕濾餅時，不干燥聚α-l，3-1，6-葡聚糖。[0055]本文中使用的術語"取代度"（DoS)是指聚α-1，3_1，6-葡聚糖醚化合物的每個單體單元(葡萄糖）中被取代的羥基的平均數(shù)。由于本文的聚α-l，3_1，6_葡聚糖(據(jù)信其是直鏈或支鏈的）的葡萄糖單體單元中最多具有三個羥基，因此本文的聚α-l，3-1，6_葡聚糖醚化合物的取代度可不高于3。[0056]本文中使用的術語"摩爾取代度"（M.S.)是指聚α-1，3_1，6-葡聚糖醚化合物中每個單體單元的有機基團的摩爾數(shù)。另選地，M.S.可指用于與聚α-l，3-1，6_葡聚糖中的單體單元反應的醚化劑的平均摩爾數(shù)（因此M.S.可描述用醚化劑衍生化的程度）。需注意，聚〇_1，3-1，6-葡聚糖的M.S.值可不具有上限。例如，當已將含有羥基的有機基團（例如，羥乙基或羥丙基)醚化至聚α-l，3-1，6_葡聚糖時，有機基團的羥基可經(jīng)歷進一步的反應，從而使更多的有機基團與聚α-l，3-1，6-葡聚糖偶聯(lián)。[0057]本文的術語"交聯(lián)"是指在一個或多個聚合物分子中使兩個鄰近原子連接的化學鍵、原子或原子基團。應當理解，在包含交聯(lián)聚α-l，3-1，6_葡聚糖醚的組合物中，交聯(lián)可發(fā)生在至少兩個聚α-1，3_1，6-葡聚糖醚分子之間（即，分子間交聯(lián)）；還可存在分子內(nèi)交聯(lián)。本文中使用的"交聯(lián)劑"是可產(chǎn)生交聯(lián)的原子或化合物。[0058]術語"水性膠體"和"水凝膠"在本文中可互換使用。水性膠體是指其中水是分散介質(zhì)的膠體系統(tǒng)。本文的"膠體"是指在下顯微鏡下分散于整個另一物質(zhì)的物質(zhì)。因此，本文的水性膠體還可指聚α-l，3-1，6-葡聚糖和/或一種或多種聚α-l，3-1，6-葡聚糖醚化合物在水或水性溶液中的分散體、混合物或溶液。[0059]本文的術語"水性溶液"是指其中溶劑是水的溶液。本文的聚α-1，3-1，6-葡聚糖和/或一種或多種聚α-l，3_1，6_葡聚糖醚化合物可分散、混合和/或溶解于水性溶液中。水性溶液可充當本文的水性膠體的分散介質(zhì)。[0060]本文中使用的術語"粘度"是指流體或水性組合物(例如水性膠體)抵抗趨于促使其流動之力的程度的量度。本文中可使用的多種粘度單位包括厘泊（cPs)和帕斯卡-秒(Pa·s)。厘泊是泊的百分之一;一泊等于0.100kg·nf1·s'因此，本文中使用的術語"粘度調(diào)節(jié)劑"和"粘度改性劑"是指可改變/調(diào)節(jié)流體或水性組合物的粘度的任何物質(zhì)。[0061]本文中使用的術語"剪切致稀性能"是指水性膠體或水性溶液的粘度隨剪切速率增加而減小。本文中使用的術語"剪切增稠性能"是指水性膠體或水性溶液的粘度隨剪切速率增加而增大。本文的"剪切速率"是指將向水性膠體或水性溶液施加漸進式剪切變形時的速率。剪切變形可旋轉(zhuǎn)地施加。[0062]本文中關于增加水性組合物粘度的方法使用的術語"接觸"是指導致使水性組合物和聚α-l，3-1，6_葡聚糖醚化合物在一起的任何行為。例如，接觸可通過本領域中已知的任何方式來進行，例如溶解、混合、搖動或均化。[0063]所公開發(fā)明的一些實施方案涉及一種反應溶液，其包含水、蔗糖和合成聚α-l，3_1，6_葡聚糖的葡糖基轉(zhuǎn)移酶。所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶包含與SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8或SEQIDN0:10至少90%相同的氨基酸序列。顯著地，這些酶可合成能夠衍生成粘度調(diào)節(jié)質(zhì)量提尚的釀的聚0-]^，3_1，6_匍聚糖。[0064]關于在本文的反應溶液中產(chǎn)生的聚α-l，3-1，6-葡聚糖：[0065](丨)所述聚€1-1，3-1，6-葡聚糖的至少30%糖苷鍵是€[-1，3鍵，[0066](ii)所述聚α-l，3_1，6_葡聚糖的至少30%糖苷鍵是α-l，6鍵，并且[0067](iii)所述聚α-1，3_1，6-葡聚糖具有至少1000的重均聚合度(DPW)。[0068]通過本文的葡糖基轉(zhuǎn)移酶合成的聚α-1，3_1，6-葡聚糖的至少30%糖苷鍵是α-1，3鍵，并且至少30%糖苷鍵是α-l，6鍵。另選地，α-l，3鍵的百分比可為至少31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%或64%。仍另選地，〇-1，6鍵的百分比可為至少31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%或69%〇[0069]通過本文的葡糖基轉(zhuǎn)移酶合成的聚α-1，3_1，6-葡聚糖可具有前述任一個α-1，3鍵百分比和前述任一個α_1，6鍵百分比，只要百分比的總和不大于100%即可。例如，所述聚^1，3-1，6-葡聚糖可具有（1)30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%或40%(30%-40%)€[-1，3鍵中的任一個，和（^)60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%或69%(60%-69%)0-1，6鍵中的任一個，只要百分比的總和不大于100%即可。非限制性示例包括具有31%α-1，3鍵和67%α-1，6鍵的聚α-l，3_1，6_葡聚糖。α-l，3鍵和α-1，6鍵分布的其它示例提供于表2中。在某些實施方案中，在本文的gtf反應溶液中產(chǎn)生的聚α-l，3_1，6_葡聚糖的至少60%糖苷鍵是α-l，6鍵。[0070]通過本文的葡糖基轉(zhuǎn)移酶合成的聚α-l，3-1，6_葡聚糖可具有例如少于10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的除α-l，3和α-l，6之外的糖苷鍵。在另一個實施方案中，聚α-l，3_1，6_葡聚糖僅具有α-l，3鍵和α-l，6鍵。[0071]通過本文的葡糖基轉(zhuǎn)移酶合成的聚α-l，3-1，6_葡聚糖的骨架可以是直鏈/非支鏈的。另選地，聚α_1，3-1，6_匍聚糖中可存在分支。因此，在某些實施方案中，聚α-l，3-1，6_匍聚糖可不具有分支點或者具有少于約30%、29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%分支點作為該聚合物中糖苷鍵的一定百分比。[0072]在所公開發(fā)明的某些實施方案中，葡糖基轉(zhuǎn)移酶可合成包含不連續(xù)地彼此交替的α_1，3鍵和α-l，6鍵的聚α-l，3-1，6-甸聚糖。對于下述討論，認為...6-1，3-6-1，6-〇-1，3-6_1，6-G-1，3-G_...(其中G表示葡萄糖)表示六個葡萄糖單體單元通過連續(xù)地交替α-1，3鍵和α-l，6鍵而連接的延伸段。另選地，通過本文的葡糖基轉(zhuǎn)移酶合成的聚α-l，3-1，6-葡聚糖可包含例如少于2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個連續(xù)地用交替€(-1，3鍵和€[-1，6鍵連接的葡萄糖單體單元。[0073]通過本文的葡糖基轉(zhuǎn)移酶合成的聚α-l，3-1，6_葡聚糖的分子量可作為DPW(重均聚合度)或DPn(數(shù)均聚合度)來測量。另選地，可以以道爾頓或克/摩爾來測量分子量。提及聚α-1，3_1，6-葡聚糖的數(shù)均分子量(Mn)或重均分子量(Mw)也是可用的。[0074]通過本文的葡糖基轉(zhuǎn)移酶合成的聚α-1，3-1，6_葡聚糖具有至少約1000的DPW。例如，所述聚α-1，3-1，6-葡聚糖的DPW可為至少約10000。另選地，所述DPW可為至少約1000至約15000。仍另選地，所述DPwSJ為例如至少約1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000或15000(或介于1000和15000之間的任意整數(shù)）。鑒于本文的聚α-1，3_1，6-葡聚糖具有至少約1000的DPW，這樣的葡聚糖聚合物通常但不一定是水不溶性的。[0075]在所公開gtf反應溶液的某些實施方案中，聚α-1，3_1，6-葡聚糖可具有例如至少約50000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、1100000、1200000、1300000、1400000、1500000或1600000(或介于50000和1600000之間的任意整數(shù))的Mw。[0076]本文的葡糖基轉(zhuǎn)移酶可從任何微生物來源(例如細菌或真菌)獲得。細菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶的示例是來源于鏈球菌屬(Streptococcus)菌種、明串珠菌屬(Leuconostoc)菌種或乳桿菌屬（Lactobacillus)菌種的那些。鏈球菌屬菌種的示例包括唾液鏈球菌(S.salivarius)、遠緣鏈球菌(S.sobrinus)、離齒鏈球菌(S.dentirousetti)、汗毛鏈球菌(S.downei)、變異鏈球菌（S.mutans)、口腔鏈球菌（S.oralis)、解沒食子酸鏈球菌(S.gallolyticus)和血鏈球菌(S.sanguinis)。明串珠菌屬菌種的示例包括腸膜明串珠菌(L.mesenteroides)、L·amelibiosum、阿根廷明串珠菌（L·argentinum)、肉色明串珠菌(L.carnosum)、梓檬明串珠菌(L.citreum)、乳脂明串珠菌(L.cremoris)、葡萄聚糖明串珠菌(L.dextranicum)和果糖明串珠菌(L.fructosum)。乳桿菌屬菌種的示例包括嗜酸乳桿菌(1^.8(^(1(^]1；[1118)、德氏乳桿菌(1^.(161131'11601<：；[；0、瑞士乳桿菌(1^.]161￥61：；[(3118)、唾液乳桿菌(L.salivarius)、干酪乳酸桿菌（L.casei)、彎曲乳桿菌（L.curvatus)、胚芽乳桿菌(L.plantarum)、清酒乳桿菌(L.sakei)、短乳桿菌(L.brevis)、布氏乳桿菌(L.buchneri)、發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)和羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)0[0077]本文的葡糖基轉(zhuǎn)移酶可包含與SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8或SEQIDN0:10至少90%相同的氨基酸序列，或者由其組成，其中所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶具有活性。另選地，葡糖基轉(zhuǎn)移酶可包含與SEQIDN0:4、SEQIDN0:20、SEQIDN0:28或SEQIDN0:30至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列，或者由其組成，其中所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶具有活性。仍另選地，葡糖基轉(zhuǎn)移酶可包含SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8或SEQIDN0:10，或者由其組成。[0078]鑒于某些氨基酸彼此共有類似的結(jié)構(gòu)和/或電荷特征（即，保守的），可如下用保守的氨基酸殘基來取代所公開gtf酶序列的一個或多個氨基酸（"保守氨基酸取代"：[0079]1.下列小脂族非極性或輕微極性殘基可相互取代:Ala(A)、Ser(S)、Thr(T)、Pro(P)、Gly(G);[0080]2.下列極性帶負電荷殘基及其酰胺可相互取代:Asp(D)、Asn(N)、GlU(E)、Gln(Q);[0081]3.下列極性帶正電荷殘基可相互取代:His(H)、Arg(R)、Lys(K);[0082]4.下列脂族非極性殘基可相互取代:Ala(A)、Leu(L)、Ile(I)、Val(V)、Cys(C)、Met(M);以及[0083]5·下列大脂族殘基可相互取代:Phe(F)、Tyr(Y)、Trp(W)。[0084]用于gtf反應溶液中的葡糖基轉(zhuǎn)移酶的示例可以是本文所公開的任意氨基酸序列，并且還可在N末端和/或C末端包含1至300(或介于其之間的任意整數(shù))個殘基。例如，這樣的另外殘基可來自葡糖基轉(zhuǎn)移酶所來源于的對應野生型序列，或者可以是其它序列，例如表位標簽(在N末端或C末端)或異源信號肽(在N末端）。[0085]本文的葡糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列可由例如SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7或SEQIDN0:9中提供的多核苷酸序列編碼。另選地，這樣的氨基酸序列可由與SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7或SEQIDN0:9至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的多核苷酸序列編碼。[0086]可使用一種或多種不同的葡糖基轉(zhuǎn)移酶來實施所公開的發(fā)明。例如，所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶不具有或者具有非常低(低于1%)的交替鹿糖酶(alternansucrase)活性。[0087]本文的葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以是引發(fā)劑獨立性的或引發(fā)劑依賴性的。引發(fā)劑獨立性葡糖基轉(zhuǎn)移酶進行葡聚糖合成不需要引發(fā)劑的存在。引發(fā)劑依賴性葡糖基轉(zhuǎn)移酶需要在反應溶液中存在在葡聚糖聚合物合成期間充當酶引發(fā)劑的引發(fā)分子。本文中使用的術語"引發(fā)劑"是指能夠可用作葡糖基轉(zhuǎn)移酶的引發(fā)物的任何分子。例如，寡糖和多糖可起引發(fā)劑的作用。例如，可用于某些實施方案的引發(fā)劑包括右旋糖酐以及其它基于碳水化合物的引發(fā)劑，例如水解葡聚糖。美國專利申請公開2013/0244287(其以引用方式并入本文)公開了使用聚α-l，3-葡聚糖作為起始材料來制備水解葡聚糖。用作引發(fā)劑的右旋糖酐可以是例如右旋糖酐Τ10(即，具有10kD的分子量的右旋糖酐）。另選地，右旋糖酐引發(fā)劑可具有例如約2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或251^)的分子量。[0088]所公開發(fā)明的葡糖基轉(zhuǎn)移酶可通過本領域中已知的任何方式來產(chǎn)生。例如，所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶可在異源表達系統(tǒng)(例如微生物異源表達系統(tǒng)）中重組產(chǎn)生。異源表達系統(tǒng)的示例包括細菌(例如，大腸桿菌，例如T0P10或MG1655;芽孢桿菌屬)和真核生物(例如，酵母，例如畢赤酵母屬(Pichiasp.)和酵母屬(Saccharomycessp.)表達系統(tǒng)。[0089]本文所述的葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以以任意純化狀態(tài)(例如，純或非純)使用。例如，可在使用之前純化和/或分離葡糖基轉(zhuǎn)移酶。非純葡糖基轉(zhuǎn)移酶的示例包括細胞裂解物形式的那些。細胞裂解物或提取物可由用于異源表達該酶的細菌(例如，大腸桿菌）制備。例如，可使用French壓碎器對細菌進行破裂。在一些另選實施方案中，可用均化器（例如，APV，Rannie，Gaulin)均化細菌。葡糖基轉(zhuǎn)移酶通常在這些類型的制備物中通常是可溶解的。本文的細菌細胞裂解物、提取物或均漿可以以約0.15-0.3%(v/v)用于由蔗糖制備聚α-1，3_1，6-葡聚糖的反應溶液中。[0090]在某些實施方案中，異源基因表達系統(tǒng)可以是設計成用于蛋白質(zhì)分泌的異源基因表達系統(tǒng)。在這樣的實施方案中，所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶包含信號肽(信號序列）。所述信號肽可以是其天然信號肽或異源信號肽。[0091]本文的葡糖基轉(zhuǎn)移酶的活性可使用本領域中已知的任何方法來確定。例如，可通過測量包含蔗糖（約50g/L)、右旋糖酐Τ10(約lmg/mL)和磷酸鉀緩沖液(約pH6.5,50mM)的反應溶液中還原糖(例如，果糖和葡萄糖）的產(chǎn)生來確定葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性，其中將該溶液在約22-25°C下保持約24-30小時。還原糖可如下測量：向包含約INNaOH和約0.1%氯化三苯基四唑的混合物添加0.0lmL反應溶液，然后監(jiān)測OD480?處吸光度的增加，持續(xù)5分鐘。[0092]如有需要，可對本文的gtf反應溶液的溫度加以控制。在某些實施方案中，所述溫度為約5°C至約50°C。在某些其它實施方案中，所述溫度為約20°C至約40°C。另選地，所述溫度可為約20-(：、2Γ(：、22Γ、23Γ、24Γ、25Γ、26Γ、27Γ、28Γ、2%~、3(Τ(：、3Γ(：、32Γ、33。(：、34。(：、35。(：、36。(：、37。(：、38。(：、39。(：或40。(：。[0093]可使用本領域中已知的多種方式來維持本文的gtf反應溶液的溫度。例如，可通過將容納反應溶液的容器放置于設定在期望溫度的空氣或水浴培養(yǎng)箱中來維持溫度。[0094]本文的gtf反應溶液中蔗糖的初始濃度可為例如約20g//L至約400g/L。另選地，蔗糖的初始濃度可為約75g/L至約175g/L，或約50g//L至約150g/L。仍另選地，蔗糖的初始濃度可為例如約40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150或16(^/1(或介于40和1608/1之間的任意整數(shù)）。"蔗糖的初始濃度"是指緊接已添加所有反應溶液組分(水、蔗糖、gtf酶）之后gtf反應溶液中的蔗糖濃度。[0095]任何等級的蔗糖都可用于本文所公開的反應溶液中。例如，蔗糖可以是高度純的(多99.5%)、具有至少99.0%的純度或者可以是試劑級蔗糖。用于本文中的蔗糖可來源于任何可再生糖源，例如甘蔗、糖用甜菜、木薯、甜高粱或谷物。蔗糖可以以任何形式例如結(jié)晶形式或非結(jié)晶形式(例如，糖漿或蔗汁)提供。[0096]在某些實施方案中，gtf反應溶液的pH可為約4.0至約8.0。另選地，所述pH可為約4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5或8.0?？梢酝ㄟ^添加或摻入合適的緩沖液來調(diào)節(jié)或控制PH，所述緩沖液包括但不限于磷酸鹽、tris、檸檬酸鹽或它們的組合。gtf反應溶液中的緩沖液濃度可為例如OmM至約100mM，或者約10、20或50mM。[0097]所公開的發(fā)明還涉及用于制備聚α-1，3_1，6-葡聚糖的方法，該方法包括使至少水、蔗糖和合成聚α-l，3_1，6_葡聚糖的葡糖基轉(zhuǎn)移酶接觸的步驟。所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶包含與SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8或SEQIDN0:10至少90%相同的氨基酸序列。聚α-l，3-1，6-葡聚糖在接觸步驟中產(chǎn)生。該聚α-l，3-1，6-葡聚糖可任選地是分離的。[0098]本文方法中產(chǎn)生聚α-l，3-1，6-葡聚糖的接觸步驟可包括提供包含水、蔗糖和本文所公開的任意葡糖基轉(zhuǎn)移酶的gtf反應溶液。應理解，隨著葡糖基轉(zhuǎn)移酶合成聚α-l，3-1，6_葡聚糖，反應溶液通常變成反應混合物，因為反應變渾濁指示不溶性聚α-l，3-1，6-葡聚糖從溶液中析出。所公開方法的接觸步驟可以以任意數(shù)量的方式來進行。例如，可首先將期望量的蔗糖溶解于水(任選地，還可在該制備階段添加其它組分）中，之后添加葡糖基轉(zhuǎn)移酶。例如，可使溶液保持靜止，或者通過攪拌或軌道搖動進行攪動。所述反應可以是并且通常是不含細胞的。[0099]在某些實施方案中，gtf反應的完成可在視覺上（例如，沉淀聚α-l，3-1，6_葡聚糖不再聚集)和/或通過測量溶液中剩余的蔗糖的量來確定，其中超過約90%的百分比蔗糖消耗可指示反應完成。通常來說，所公開方法的反應的完成可花費約12、18、24、30、36、48、60、72、84或96小時。反應時間可取決于例如某些參數(shù)，例如反應中使用的蔗糖和葡糖基轉(zhuǎn)移酶的量。[0100]基于反應溶液中使用的蔗糖的重量，在本文某些實施方案中的gtf反應中產(chǎn)生的聚α-l，3-1，6_葡聚糖的收率可為至少約4%、5%、6%、7%或8%。[0101]在所公開方法中制備的聚α-l，3-1，6_葡聚糖可任選地是分離的。例如，可通過離心或過濾來分離不溶性聚α-l，3-1，6-葡聚糖。這樣，使聚α-l，3-1，6-葡聚糖與反應溶液的其余部分分離，所述其余部分可包含水、果糖和某些副產(chǎn)物(例如，明串珠菌二糖、可溶性寡糖）。該溶液還可包含葡萄糖單體和殘余的蔗糖。[0102]在本文gtf反應中產(chǎn)生的聚α-1，3-1，6-葡聚糖的鍵分布和/或分子量可為上文所公開那些中的任一種。例如，（i)至少30%糖苷鍵是α-1，3鍵，（ii)至少30%糖苷鍵是α-1，6鍵，并且（iii)聚α-1，3-1，6-葡聚糖具有至少1000的DPW。在gtf反應中產(chǎn)生的聚α-1，3-1，6-葡聚糖可具有至少60%α-l，6鍵和/或具有至少約10000的DPW。[0103]所公開發(fā)明的一些實施方案涉及包含聚α-1，3_1，6-葡聚糖的組合物，其中：[0104](丨)所述聚€1-1，3-1，6-葡聚糖的至少30%糖苷鍵是€[-1，3鍵，[0105](ii)所述聚α-l，3_1，6_葡聚糖的至少30%糖苷鍵是α-l，6鍵，[0106](iii)所述聚α-l，3-1，6_葡聚糖具有至少1000的重均聚合度(DPW);并且[0107](iv)所述聚α-l，3_1，6_葡聚糖的α-l，3鍵和α-l，6鍵不連續(xù)地彼此交替。[0108]顯著地，本文公開的聚α-l，3-1，6_葡聚糖可衍生成粘度調(diào)節(jié)質(zhì)量提高的醚。[0109]本文所公開的聚α-l，3_1，6_葡聚糖的至少30%糖苷鍵是α-l，3鍵并且所述聚α-l，3-1，6-葡聚糖的至少30%糖苷鍵是α-l，6鍵。另選地，本文的聚α-l，3-1，6-葡聚糖中α-l，3鍵的百分比可為至少31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%或64%。仍另選地，本文的聚〇-1，3-1，6-葡聚糖中α-l，6鍵的百分比可為至少31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%或69%。[0110]本發(fā)明的聚α-l，3-1，6_葡聚糖可具有前述任一個α-l，3鍵百分比和前述任一個α-1，6鍵百分比，只要百分比的總和不大于100%即可。例如，本文的聚α-l，3-1，6_葡聚糖可具有（1)30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%或40%(30%-40%)〇-1，3鍵中的任一個，和（ii)60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%或69%(60%-69%)α-l，6鍵中的任一個，只要百分比的總和不大于100%即可。非限制性示例包括具有31%α-1，3鍵和67%α-1，6鍵的聚α-l，3_1，6_葡聚糖。α-l，3鍵和α-l，6鍵分布的其它示例提供于表2中。在某些實施方案中，所述聚α-l，3_1，6_葡聚糖的至少60%糖苷鍵是α-l，6鍵。[0111]本發(fā)明的聚α-1，3_1，6-葡聚糖可具有例如少于10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的除α-l，3和α-l，6之外的糖苷鍵。在另一個實施方案中，聚α-l，3_1，6_葡聚糖只具有α-l，3鍵和α-l，6鍵。[0112]本文公開的聚α-l，3-1，6_葡聚糖的骨架可以是直鏈的/非支鏈的。另選地，聚α-l，3-1，6_葡聚糖中可存在分支。因此，在某些實施方案中，聚α-l，3-1，6_葡聚糖可不具有分支點或者具有少于約30%、29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%分支點作為該聚合物中糖苷鍵的一定百分比。[0113]所公開組合物中的聚α-l，3-1，6-葡聚糖的α-l，3鍵和α-l，6鍵不連續(xù)地彼此交替。對于下述討論，認為···G-1，3-G-l，6?，3?，6?，3-G-···(其中G表不匍甸糖)表不六個葡萄糖單體單元通過連續(xù)地交替α-l，3鍵和α-l，6鍵而連接的延伸段。在本文的某些實施方案中，聚a-l，3-l，6-葡聚糖可包含少于2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個連續(xù)地用交替α-l，3鍵和α-l，6鍵連接的葡萄糖單體單元。[0114]本文公開的聚α-1，3-1，6-葡聚糖的分子量可作為DPW(重均聚合度)或DPn(數(shù)均聚合度)來測量。另選地，可以以道爾頓或克/摩爾來測量分子量。提及聚α-1，3_1，6-葡聚糖的數(shù)均分子量(Μη)或重均分子量(Mw)也是可用的。[0115]本文的聚α-l，3_1，6_葡聚糖具有至少約1000的DPW。例如，所述聚α-l，3_1，6_葡聚糖的DPW可為至少約10000。另選地，所述DPW可為至少約1000至約15000。仍另選地，所述DPW可為例如至少約1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000或15000(或介于1000和15000之間的任意整數(shù)）。鑒于本文的聚α-l，3-1，6_葡聚糖具有至少約1000的DPw，這樣的葡聚糖聚合物通常但不一定是水不溶性的。[0116]本文的聚α-1，3_1，6-葡聚糖可具有例如至少約50000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、1100000、1200000、1300000、1400000、1500000或1600000(或介于50000和1600000之間的任意整數(shù)）的]^。在某些實施方案中，所述^為至少約1000000。[0117]本文的聚α-l，3-1，6_葡聚糖可包含例如至少6個葡萄糖單體單元。另選地，葡萄糖單體單元的數(shù)目可為例如至少約10、50、100、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、〇或9000(或介于10和9000之間的任意整數(shù)）。[0118]本文的聚α-1，3-1，6-葡聚糖可例如使用包含與SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8或SEQIDN0:10至少90%相同的氨基酸序列的葡糖基轉(zhuǎn)移酶來產(chǎn)生。另選地，所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶可包含與SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8或SEQIDN0:10至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同或者100%相同的氨基酸序列。所公開發(fā)明的聚α-l，3-l，6-葡聚糖的產(chǎn)生可用例如本文公開的gtf反應來實現(xiàn)。[0119]本文的聚α-l，3-1，6_葡聚糖例如在干燥時可以以粉末的形式提供或者在濕潤時可以以糊劑、膠體或其它分散體的形式提供。在某些實施方案中，包含聚α-l，3-1，6-葡聚糖的組合物是其中組成聚α-l，3_1，6_葡聚糖用作增稠劑的組合物。據(jù)信，本文的聚α-l，3_1，6-葡聚糖適合作為增稠劑，增稠劑是吸收液體(例如水)并且在這樣的吸收之后溶脹的物質(zhì)。聚α-l，3_1，6_葡聚糖在液體中的溶脹可產(chǎn)生例如漿料或膠體。[0120]包含聚α-l，3-1，6_葡聚糖的組合物可以是以下形式:個體護理產(chǎn)品、藥物產(chǎn)品、食物產(chǎn)品、家用產(chǎn)品或工業(yè)產(chǎn)品，例如下文所公開之用于應用聚α-l，3-1，6-葡聚糖醚衍生物的那些產(chǎn)品中的任一種。所述組合物中聚α-1，3_1，6-葡聚糖的量可為例如約0.1-10wt%、0·l_5wt%、0·l_4wt%、0·l_3wt%、0·l_2wt%或0·l_lwt%，或者向所述組合物提供期望增稠程度的量。[0121]所公開發(fā)明的一些實施方案涉及包含聚α-l，3-1，6-葡聚糖醚化合物的組合物，其中：[0122](i)所述聚α-l，3-1，6-葡聚糖醚化合物的至少30%糖苷鍵是α-l，3鍵，[0123](ii)所述聚α-l，3-1，6-葡聚糖醚化合物的至少30%糖苷鍵是α-l，6鍵，[0124](iii)所述聚α-l，3-1，6_葡聚糖醚化合物具有至少1000的重均聚合度(DPW);[0125](iv)所述聚α-l，3-1，6-葡聚糖醚化合物的α-l，3鍵和α-l，6鍵不連續(xù)地彼此交替，并且[0126](v)所述聚α-l，3-1，6_葡聚糖醚化合物具有約0.05至約3.0的有機基團取代度(DoS)〇[0127]顯著地，本文公開的聚α-1，3_1，6-葡聚糖醚化合物具有提高的粘度調(diào)節(jié)質(zhì)量，例如在低濃度下增粘水性組合物的能力。此外，本文的聚α-1，3_1，6-葡聚糖醚化合物可具有相對低的DoS但仍然是有效的粘度調(diào)節(jié)劑。[0128]本文公開的聚α-1，3_1，6-葡聚糖醚化合物的至少30%糖苷鍵是α-1，3鍵并且所述聚α-l，3-1，6-葡聚糖醚化合物的至少30%糖苷鍵是α-l，6鍵。另選地，本文的聚α-l，3-1，6-葡聚糖醚化合物中α-1，3鍵的百分比可為至少31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%或64%。仍另選地，本文的聚α-l，3-1，6-葡聚糖醚化合物中α-l，6鍵的百分比可為至少31%、32%、33%、34%、35%、36%,37%,38%,39%Α0%Α1%Α2%Α3%Α4：%Α5%Α6%Α7%Α8%Α9%,50%,51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%或69%。[0129]本發(fā)明的聚α-1，3-1，6-葡聚糖醚化合物可具有前述任一個α-1，3鍵百分比和前述任一個α-1，6鍵百分比，只要百分比的總和不大于100%即可。例如，所述聚α-1，3_1，6-葡聚糖醚化合物可具有（〇30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%或40%(30%-40%)€[-1，3鍵中的任一個，和（^)60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%或69%(60%-69%)α-1，6鍵中的任一個，只要百分比的總和不大于100%即可。非限制性示例包括具有31%α-1，3鍵和67%α-1，6鍵的聚α-1，3_1，6-葡聚糖醚化合物。本文的某些聚α-l，3_1，6_葡聚糖醚化合物的α-l，3鍵和α-l，6鍵分布的其它示例提供于表2中，表2公開了可用于制備所公開醚的分離聚α-l，3_1，6_葡聚糖的鍵分布。在某些實施方案中，所述聚α-l，3-1，6-葡聚糖醚化合物的至少60%糖苷鍵是α-l，6鍵。[0130]本發(fā)明的聚α-1，3_1，6-葡聚糖醚化合物可具有例如少于10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的除α-l，3和α-l，6之外的糖苷鍵。在另一個實施方案中，聚α-l，3_1，6-葡聚糖醚化合物僅具有α-l，3鍵和α-l，6鍵。[0131]本文公開的聚α-l，3-1，6_葡聚糖醚化合物的骨架可以是直鏈的/非支鏈的。另選地，所述聚α-l，3-1，6-葡聚糖醚化合物中可存在分支。因此，在某些實施方案中，聚α-l，3-1，6_葡聚糖醚化合物可不具有分支點或者具有少于約30%、29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%分支點作為該聚合物中糖苷鍵的一定百分比。[0132]本文公開的聚α-l，3-1，6_葡聚糖醚化合物的α-l，3鍵和α-l，6鍵不連續(xù)地彼此交替。對于下述討論，認為…·G-1，3-G-l，6-G-l，3-G-l，6?，3-G-···(其中G表不釀化匍甸糖)表示六個葡萄糖單體單元通過連續(xù)地交替α-l，3鍵和α-l，6鍵而連接的延伸段。在本文的某些實施方案中，聚α-1，3-1，6-葡聚糖醚化合物可包含少于2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個連續(xù)地用交替α-l，3鍵和α-l，6鍵連接的葡萄糖單體單元。[0133]本文公開的聚α-1，3_1，6-葡聚糖醚化合物的分子量可作為DPW(重均聚合度)或DPn(數(shù)均聚合度)來測量。另選地，可以以道爾頓或克/摩爾來測量分子量。提及聚α-l，3-l，6-葡聚糖醚化合物的數(shù)均分子量(Mn)或重均分子量(Mw)也是可用的。[0134]本文的聚α-l，3-1，6_葡聚糖醚化合物具有至少約1000的DPW。例如，所述聚α-l，3_1，6-葡聚糖醚化合物的DPW可為至少約10000。另選地，所述DPW可為至少約1000至約15000。仍另選地，所述DPwSJ為例如至少約1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000或15000(或介于1000和15000之間的任意整數(shù)）。[0135]本文的聚α-1，3-1，6-葡聚糖醚化合物可具有例如至少約50000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、1100000、1200000、1300000、1400000、1500000或1600000(或介于50000和1600000之間的任意整數(shù)）的]^。在某些實施方案中，所述Mw為至少約1000000。[0136]本文的聚α-1，3_1，6-葡聚糖醚化合物可包含至少6個葡萄糖單體單元(這些單元中的大多數(shù)通常含有醚連接的有機基團）。另選地，葡萄糖單體單元的數(shù)目可為例如至少約10、50、100、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、〇或9000(或介于10和9000之間的任意整數(shù)）。[0137]本發(fā)明的聚α-1，3-1，6_葡聚糖醚化合物具有約0.05至約3.0的有機基團取代度(DoS)。在某些實施方案中，聚α-l，3_1，6_葡聚糖醚化合物的DoS可為約0.3至1.0。所述DoS可另選地為至少約0·1、0·2、0·3、0·4、0·5、0·6、0·7、0·8、0·9、1·0、1·1、1·2、1·3、1·4、1·5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.喊3.0〇[0138]本文的聚α-1，3-1，6-葡聚糖醚化合物中與有機基團醚連接之葡萄糖單體單元(即，其中葡萄糖單體單元的一個或多個羥基已用有機基團醚化)的百分比可根據(jù)聚α-1，3_1，6-葡聚糖在醚化反應中與有機基團醚化的程度而不同。該百分比可為例如至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%(或介于30%和100%之間的任意整數(shù)值）。[0139]應理解，基于與醚化合物之葡萄糖單體單元相關的糖苷鍵(例如，-1，6-G_1，3-)，該葡萄糖單體單元的某些碳原子可獨立地與0H基團連接，或者與有機基團醚連接。[0140]本文的有機基團可以是例如烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基或癸基。[0141]另選地，有機基團可以是其中烷基的一個或多個碳上具有取代的被取代烷基。所述取代可以是一個或多個羥基、醛、酮和/或羧基基團。例如，被取代的烷基可以是羥基烷基、二羥基烷基或羧基烷基。[0142]合適羥基烷基的示例是羥甲基（CH20H)、羥乙基（例如，-CH2CH2OH、CH(OH)CH3)、羥丙基（例如，〇120120120!1、-〇1201(0!〇013、01(0!〇012013)、羥丁基和羥戊基。其它示例包括二羥基烷基(二醇），例如二羥基甲基、二羥基乙基(例如，-CH(OH)CH20H)、二羥基丙基（例如，CH2CH(OH)CH20H、-CH(OH)CH(OH)CH3)、二羥基丁基和二羥基戊基。[0143]合適羧基烷基的示例是羧甲基（CH2⑶0H)、羧乙基（例如，-CH2CH2⑶0H、CH(⑶0H)CH3)、羧丙基(例如，CH2CH2CH2COOH、-CH2CH(C00H)CH3、CH(C00H)CH2CH3)、羧丁基和羧戊基。[0144]仍另選地，烷基的一個或多個碳可被另一烷基取代。這樣的取代基烷基的示例是甲基、乙基和丙基。作為舉例說明，有機基團可以是-ch(ch3)ch2ch3或CH2CH(CH3)CH3,其二者均是具有甲基取代的丙基。[0145]由多種被取代烷基的上述示例應清楚可知，在某些實施方案中，烷基上的取代(例如，羥基或羧基)可與該烷基的末端碳原子鍵合，其中該末端碳原子與醚連接至聚α_1，3-1，6-葡聚糖醚化合物中的葡萄糖單體單元的末端相對。這種末端取代的一個示例是CH2CH2CH2OH的羥丙基。另選地，取代可以在烷基的內(nèi)部碳原子上。內(nèi)部取代的一個示例是CH2CH(OH)CH3的羥丙基。烷基可具有一個或多個可相同（例如，兩個羥基[二羥基])或不同(例如，羥基和羧基)的取代。[0146]在本文公開的某些實施方案中，聚α-1，3_1，6-葡聚糖可包含一種類型的有機基團。這樣的化合物的示例包含羧基烷基作為有機基團（一般來說，羧基烷基聚α-1，3_1，6-葡聚糖）。這樣的化合物的一個具體非限制性示例是羧甲基聚α-l，3_1，6_葡聚糖。[0147]另選地，本文公開的聚α-1，3_1，6-葡聚糖醚化合物可包含兩種或更多種不同類型的有機基團。這樣的化合物的示例包含（i)兩種不同的烷基作為有機基團、（ii)烷基和羥基烷基作為有機基團（一般來說，烷基羥基烷基聚α-l，3-1，6-葡聚糖）、（iii)烷基和羧基烷基作為有機基團（一般來說，烷基羧基烷基聚α-1，3_1，6-葡聚糖）、（iv)羥基烷基和羧基烷基作為有機基團（一般來說，烷基烷基羧基烷基聚α-1，3_1，6-葡聚糖）、（v)兩種不同的羥基烷基作為有機基團，或者(vi)兩種不同的羧基烷基作為有機基團。這樣的化合物的具體非限制性示例包括乙基羥乙基聚α-l，3-1，6-葡聚糖、羥基烷基甲基聚α-l，3-1，6-葡聚糖、羧甲基輕乙基聚α_1，3-1，6-匍聚糖和駿甲基輕丙基聚α-l，3-1，6-匍聚糖。[0148]聚α-l，3-1，6-葡聚糖醚化合物可由本文公開的任意聚α-l，3-1，6-葡聚糖衍生而來。例如，本發(fā)明的聚α-l，3-1，6_葡聚糖醚化合物可如本文所公開的通過使用醚化反應對聚α-l，3-1，6-葡聚糖進行醚-衍生化來產(chǎn)生。[0149]在所公開發(fā)明的一些實施方案中，聚α-l，3-1，6_葡聚糖醚化合物所衍生自的聚α-1，3-1，6_葡聚糖是葡糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)物，所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶包含與SEQIDNO:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8或SEQIDN0:10至少90%相同的氨基酸序列。另選地，所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶可包含與SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8或SEQID吣：10至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同或者100%相同的氨基酸序列。[0150]在所公開發(fā)明的某些實施方案中，包含聚α-l，3-l，6-葡聚糖醚化合物的組合物可以是具有至少約l〇cPs的粘度的水性膠體或水性溶液。另選地，這樣的水性膠體或水性溶液具有例如至少約100、250、500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、3000、3500或4000cPs(或介于100和4000cPs之間的任意整數(shù))的粘度。[0151]粘度可用水性膠體或水性溶液在約3°C至約110°C(或介于3°C和110°C之間的任意整數(shù))的任何溫度下進行測量。另選地，可在約4°C至30°C，或約20°C至25°C的溫度下測量粘度。可在大氣壓(約760托)或者任意其它更高或更低的壓力下測量粘度。[0152]本文公開的水性膠體或水性溶液的粘度可使用粘度計或流變儀或者使用本領域中已知的任何其它方式來測量。本領域技術人員應理解，可使用粘度計或流變儀來測量本發(fā)明中表現(xiàn)出剪切致稀性能或剪切增稠性能的那些水性膠體或水性溶液（即，粘度隨流動條件變化的液體）的粘度。可在例如約10至1OOOrpm(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)）（或介于10和1OOOrpm之間的任意整數(shù)）的旋轉(zhuǎn)剪切速率下測量這樣的實施方案的粘度。另選地，可在約10、60、150、250或600rpm的旋轉(zhuǎn)剪切速率下測量粘度。[0153]本文公開的水性膠體或水性溶液的pH可為約2.0至約12.0。另選地，pH可為約2.0、3·0、4·0、5·0、6·0、7·0、8·0、9·0、10·0、11·0、12·0;約4.0至8.0;或者約5.0至8.0。[0154]本文公開的聚α-l，3-1，6_葡聚糖醚化合物可以以例如以下重量百分比（wt%)存在于水性膠體或水性溶液中：至少約0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0·6%、0·7%、0·8%、0·9%、1·0%、1·2%、1·4%、1·6%、1·8%、2·0%、2·5%、3·0%、3·5%、4·0%、4·5%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%或30%。[0155]本文的水性膠體或水性溶液可包含除聚α-l，3-1，6_葡聚糖醚化合物之外的其它組分。例如，所述水性膠體或水性溶液可包含一種或多種鹽，例如鈉鹽(例如，NaCl、Na2S〇4)。鹽的其它非限制性示例包括具有以下的那些：（i)鋁、銨、鋇、鈣、鉻（Π或III)、銅（I或II)、鐵(II或III)、氫、鉛（II)、鋰、鎂、錳（II或III)、汞（I或II)、鉀、銀、鈉鍶、錫（II或IV)或鋅的陽離子；以及(ii)乙酸鹽、硼酸鹽、溴酸鹽、溴化物、碳酸鹽、氯酸鹽、氯化物、亞氯酸鹽、鉻酸鹽、氰胺、氰化物、重鉻酸鹽、磷酸二氫鹽、氰鐵酸鹽、氰亞鐵酸鹽、氟化物、碳酸氫鹽、磷酸氫鹽、硫酸氫鹽、硫化氫、亞硫酸氫鹽、氫化物、氫氧化物、次氯酸鹽、碘酸鹽、碘化物、硝酸鹽、氮化物、亞硝酸鹽、草酸鹽、氧化物、高氯酸鹽、高錳酸鹽、過氧化物、磷酸鹽、亞磷酸鹽、磷化物、亞磷酸鹽、硅酸鹽、錫酸鹽、亞錫酸鹽、硫酸鹽、硫化物、亞硫酸鹽、酒石酸鹽或硫氰酸鹽的陰離子。因此，例如具有來自上述(i)的陽離子和來自上述(ii)的陰離子的任何鹽均可存在于水性膠體或水性溶液中。鹽可以以約.01%至約10.〇〇%(或介于.01和10.00之間的任意百分之一增量)的wt%存在于水性膠體或水性溶液中。[0156]本領域技術人員應理解，在本發(fā)明的某些實施方案中，聚α-l，3-1，6-葡聚糖醚化合物可以以陰離子形式存在于水性膠體或水性溶液中。示例可包括具有含有經(jīng)羧基取代的烷基的有機基團的那些聚α-1，3_1，6-葡聚糖醚化合物。羧基烷基聚α-1，3_1，6-葡聚糖醚化合物中的羧基(C00H)在水性條件下可轉(zhuǎn)化為羧酸(C0(T)基團。這樣的陰離子基團可與鹽陽離子(例如上文（i)中所列舉的那些中的任一種）（例如，鉀、鈉或鋰的陽離子)相互作用。因此，聚α-l，3-1，6-葡聚糖醚化合物可以是例如羧基烷基聚α-l，3-1，6-葡聚糖醚鈉(例如，羧甲基聚α-l，3_1，6_葡聚糖鈉）、羧基烷基聚α-l，3_1，6_葡聚糖醚鉀(例如，羧甲基聚α-l，3_1，6-葡聚糖鉀）或羧基烷基聚α-l，3-1，6-葡聚糖醚鋰(例如，羧甲基聚α-l，3-1，6-葡聚糖鋰)。[0157]本文公開的聚α-l，3-1，6_葡聚糖醚化合物可使用本領域中已知的任何方式進行交聯(lián)。這樣的交聯(lián)可以是硼酸酯交聯(lián)，其中硼酸酯來自于任何含硼化合物(例如，硼酸、二硼酸鹽、四硼酸鹽、五硼酸鹽、諸如Polybor?的聚合物化合物、硼酸的聚合物化合物、堿硼酸鹽）。另選地，可用多價金屬(例如鈦或鋯)來實現(xiàn)交聯(lián)。鈦交聯(lián)可使用諸如乳酸鈦銨、三乙醇胺鈦、乙酰丙酮酸鈦和鈦多羥基絡合物的含鈦IV化合物來實現(xiàn)。鋯交聯(lián)可使用諸如以下的含鋯IV化合物來實現(xiàn):乳酸鋯、碳酸鋯、乙酰丙酮酸鋯、三乙醇胺鋯、二異丙胺乳酸鋯和鋯的多羥基絡合物。仍另選地，可用美國專利4,462,917、4,464,270、4,477,360和4,799,550中所述的任何交聯(lián)劑來實現(xiàn)交聯(lián)，所述專利全部以引用方式并入本文。交聯(lián)劑(例如，硼酸酯）可以以例如約0·2wt%至20wt%，或者約0.1wt%、0·2wt%、0·3wt%、0·4wt%、0·5wt%、lwt%、2wt%、3wt%、4wt%、5wt%、6wt%、7wt%、8wt%、9wt%、10wt%、15wt%或20wt%的濃度存在于水性膠體或水性溶液中。[0158]據(jù)信，交聯(lián)的本文所公開的聚α-l，3-1，6_葡聚糖醚化合物與其非交聯(lián)對應物相比在水性溶液中通常具有更高的粘度。另外，據(jù)信交聯(lián)的聚α-l，3-1，6_葡聚糖醚化合物與其非交聯(lián)對應物相比可具有提高的剪切增稠性能。[0159]在本發(fā)明的某些實施方案中，據(jù)信水性膠體和水性溶液具有剪切致稀性能或者具有剪切增稠性能。剪切致稀性能觀察為隨著剪切速率增加水性膠體或水性溶液的粘度降低，而剪切增稠性能表現(xiàn)為隨著剪切速率增加水性膠體或水性溶液的粘度增加。本文水性溶液的剪切致稀性能或剪切增稠性能的調(diào)節(jié)歸因于將聚α-1，3-1，6-葡聚糖混合成水性組合物。因此，可將本發(fā)明的一種或多種聚α-l，3-1，6-葡聚糖醚化合物添加至水性液體、溶液或混合物以調(diào)節(jié)其流變特性（即，水性液體、溶液或混合物的流變特性得到調(diào)節(jié)）。此外，可將本發(fā)明的一種或多種聚α-l，3_1，6_葡聚糖醚化合物添加至水性液體、溶液或混合物以調(diào)節(jié)其粘度。[0160]本發(fā)明的水性膠體和水性溶液的流變特性可通過在遞增的旋轉(zhuǎn)剪切速率(例如，約1Orpm至約250rpm)下測量粘度來觀察。例如，本文公開的水性膠體或水性溶液的剪切致稀性能可觀察為：當旋轉(zhuǎn)剪切速率從約lOrpm提高至60rpm、從lOrpm提高至150rpm、從lOrpm提高至250rpm、從60rpm提高至150rpm、從60rpm提高至250rpm或從150rpm提高至250rpm，粘度(cPs)減小至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%(或介于5%和95%之間的任意整數(shù)）。作為另一個示例，本文所公開水性膠體或水性溶液的剪切增稠性能可觀察為：當旋轉(zhuǎn)剪切速率從約1Orpm提高至60rpm、從1Orpm提高至150rpm、從1Orpm提高至250rpm、從60rpm提高至150rpm、從60rpm提高至250rpm或從150rpm提高至250rpm，粘度（cps)增大至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、125%、150%、175%或200%(或介于5%和200%之間的任意整數(shù)）。[0161]本文公開的水性膠體或水性溶液可以是個人護理產(chǎn)品、藥物產(chǎn)品、食物產(chǎn)品、家用產(chǎn)品或工業(yè)產(chǎn)品的形式，和/或包含在其中。本文公開的聚α-l，3-1，6_葡聚糖醚化合物在這些產(chǎn)品的每一種中均可用作增稠劑。如果需要，可將這樣的增稠劑可與一種或多種其它類型的增稠劑聯(lián)合使用，例如美國專利8541041中公開的那些，該專利的公開內(nèi)容全文以引用方式并入本文。[0162]本文的個人護理產(chǎn)品不受特別限制并且包括例如皮膚護理組合物、化妝品組合物、抗真菌組合物和抗細菌組合物。本文的個人護理產(chǎn)品可以是例如以下形式:洗劑、乳膏、糊劑、香膏、軟膏劑、發(fā)膏劑、凝膠、液體、這些的組合等。本文公開的個人護理產(chǎn)品可包含至少一種活性成分?；钚猿煞止J為引起期望藥理效果的成分。[0163]在某些實施方案中，可將皮膚護理產(chǎn)品施用于皮膚以解決與缺乏水分相關的皮膚損傷。皮膚護理產(chǎn)品還可用于解決皮膚的視覺外觀(例如，降低片狀皮膚、有裂紋皮膚和/或紅皮膚的出現(xiàn))和/或皮膚的觸感(例如，降低皮膚的粗糙度和/或干燥度，同時提高皮膚的柔軟度和精細度）。皮膚護理產(chǎn)品通常可包含至少一種用于治療或預防皮膚疾病、提供化妝品效果或者向皮膚提供增濕益處的活性成分，例如氧化鋅、凡士林、白凡士林、礦物油、魚肝油、羊毛脂、二甲聚硅氧烷、硬質(zhì)脂肪、維生素A、尿囊素、爐甘石、高嶺土、甘油或膠態(tài)燕麥片以及這些的組合。例如，皮膚護理產(chǎn)品可包含一種或多種天然的增濕因子，例如神經(jīng)酰胺、透明質(zhì)酸、甘油、角鯊烷、氨基酸、膽固醇、脂肪酸、甘油三酯、磷脂、糖鞘脂、脲、亞油酸、糖胺聚糖、黏多糖、乳酸鈉或吡咯烷酮羧酸鈉?？砂谄つw護理產(chǎn)品中的其它成分包括但不限于甘油酯、杏仁油、芥花籽油、角鯊烷、角鯊烯、椰油、玉米油、霍霍巴油、霍霍巴蠟、卵磷脂、橄欖油、紅花油、芝麻油、牛油樹脂、豆油、甜杏仁油、向日葵油、茶樹油、牛油樹脂、棕櫚油、膽固醇、膽固醇酯、蠟酯、脂肪酸和橙油。[0164]本文的個人皮膚護理產(chǎn)品還可以是化妝品或其它產(chǎn)品的形式，包括但不限于例如唇膏、睫毛膏、胭脂、粉底、腮紅。眼線膏、唇線筆、唇彩、其它化妝品、防曬霜、防曬劑（sunblock)、指甲油、摩絲、噴發(fā)劑、定型凝膠、指甲調(diào)理劑、洗浴凝膠、淋浴凝膠、身體洗滌劑、洗臉劑、洗發(fā)劑、皮膚調(diào)理劑(免洗型或清洗型）、營養(yǎng)發(fā)水、染發(fā)劑、染發(fā)產(chǎn)品、亮發(fā)產(chǎn)品、護發(fā)精華素、頭發(fā)防卷曲產(chǎn)品、頭發(fā)分叉端修復產(chǎn)品、唇膏、皮膚調(diào)理劑、冷霜、保濕劑、身體噴劑、肥皂、身體擦洗劑、去死皮劑、收斂劑、緊膚洗劑、脫毛劑、燙發(fā)液、去肩制劑、止汗劑組合物、除臭劑、剃須產(chǎn)品、剃須前產(chǎn)品、剃須后產(chǎn)品、清潔劑、皮膚凝膠、漂洗劑、牙膏或漱口劑。[0165]本文的藥物產(chǎn)品可以是例如乳劑、液體、酏劑、凝膠、混懸劑、溶液、乳膏或軟膏劑的形式。此外，本文的藥物產(chǎn)品可以是本文所公開的任意個人護理產(chǎn)品的形式。藥物產(chǎn)品還可包含一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑和/或藥學上可接受的鹽。本文公開的聚〇_1，3_1，6_葡聚糖醚化合物還可用于膠囊、包封劑、片劑包衣中，以及用作藥劑和藥物的賦形劑。[0166]本文的食物產(chǎn)品的非限制性示例包括蔬菜、肉和豆餅;經(jīng)改造海產(chǎn)品;經(jīng)改造的奶酪棒;奶油湯；肉汁和沙司；色拉調(diào)味品；蛋黃醬;洋蔥環(huán);果醬、果凍和糖漿;餅餡;馬鈴薯制品，例如炸薯條和膨化薯條;用于油炸食品、烙餅/華夫餅和蛋糕的面糊;寵物食品;飲料;冷凍甜點;冰淇淋;培養(yǎng)的乳制品，例如松軟乳酪;酸乳、乳酪和酸奶油;蛋糕糖衣和漿汁;攪打澆頭;經(jīng)發(fā)酵或未經(jīng)發(fā)酵的焙烤食品等。[0167]本文公開的聚α-l，3_1，6_葡聚糖醚化合物、水性膠體和水性組合物可用于賦予食物產(chǎn)品（或任意的個人護理產(chǎn)品、藥物產(chǎn)品或工業(yè)產(chǎn)品）以下一種或多種物理特性;例如增稠性、冷凍/解凍穩(wěn)定性、潤滑性、保濕性和排水性、成膜性、質(zhì)感、一致性、形狀保持性、乳化性、粘合性、混懸性和膠凝化性。本文公開的聚α-1，3_1，6-葡聚糖醚化合物通?？梢砸岳缂sO.Olwt%至約5wt%的水平用于食物產(chǎn)品中。[0168]本文公開的聚α-1，3_1，6-葡聚糖醚化合物可以以提供期望增稠程度的量包含于食品或任何其它可攝取的材料(例如，腸內(nèi)藥物制劑）中。例如，以重量計，產(chǎn)品中聚α-1，3_1，6_葡聚糖醚化合物的濃度或量可為約0·l_3wt%、0·l_4wt%、0·l_5wt%或0·l-10wt%。[0169]本文的家用和/或工業(yè)產(chǎn)品可以是以下形式:例如干墻帶-填縫混合料;砂漿;水泥漿;水泥灰泥;噴霧灰泥;水泥粉飾灰泥;黏合劑;糊劑;墻/天花板質(zhì)地成構(gòu)劑；用于帶式鑄造、擠壓成型和注射模塑的粘合劑和加工助劑，以及陶瓷；用于殺蟲劑、除草劑和肥料的噴霧粘附劑和/或分散助劑;衣物洗滌劑;硬質(zhì)表面清潔劑;空氣清新劑;聚合物乳劑;諸如水基凝膠的凝膠;表面活性劑溶液;諸如水基涂料的涂料;保護性涂層;黏合劑;密封劑和填縫劑;諸如水基墨水的墨水;金屬加工流體；用于電鍍、磷化、鍍鋅和/或一般性金屬清潔操作的乳劑基金屬清潔流體;液壓流體(例如，在井下作業(yè)中用于壓裂的那些）；以及水性礦物漿料。[0170]所公開的發(fā)明還涉及用于增加水性組合物的粘度的方法。該方法包括使一種或多種聚α-l，3-1，6_葡聚糖醚化合物與所述水性組合物接觸，其中：[0171](i)所述聚α-l，3-1，6-葡聚糖醚化合物的至少30%糖苷鍵是α-l，3鍵，[0172](ii)所述聚α-l，3-1，6-葡聚糖醚化合物的至少30%糖苷鍵是α-l，6鍵，[0173](iii)所述聚α-1，3_1，6-葡聚糖醚化合物具有至少1000的重均聚合度(DPW);并且[0174](iv)所述聚α-l，3-1，6-葡聚糖醚化合物的α-l，3鍵和α-l，6鍵不連續(xù)地彼此交替。[0175]該方法中的接觸步驟導致水性組合物的粘度增加。本文公開的任何水性膠體和水性溶液均可使用該方法來產(chǎn)生。[0176]本文的水性組合物可以是例如水（例如，去離子水）、水性溶液或水性膠體。在約20-25°(：下測量的水性組合物在接觸步驟之前的粘度可為約0-1000(^?8(或介于0-lOOOOcPs之間的任意整數(shù)）。由于所述水性組合物在某些實施方案中可以是水性膠體等，因為應顯而易見的是，所述方法可用于增加已具有粘性的水性組合物的粘度。[0177]使本文公開的聚α-l，3-1，6-葡聚糖醚化合物與水性組合物接觸增加該水性組合物的粘度。與水性組合物在混合或溶解步驟之前的粘度相比，粘度增加可為增加至少約1%、10%、100%、1000%、100000%或1000000%(或介于1%和1000000%之間的任意整數(shù)）。應顯而易見的是，當水性組合物在接觸步驟之前具有很低至不具有粘度時，可使用所公開的方法來獲得粘度的極大百分比增加。[0178]用于增加水性組合物粘度的方法中的接觸步驟可通過借助本領域中已知的任何方式將本文所公開的任何聚α-1，3_1，6-葡聚糖醚化合物混合或溶解在水性組合物中來進行。例如，混合或溶解可人工進行或者用機器(例如，工業(yè)混合器或攪拌器、定軌振蕩器、攪拌板、均化器、超聲波破碎儀、砂磨機)進行。在某些實施方案中，混合或溶解可包括均化步驟。根據(jù)將聚α-1，3_1，6-葡聚糖醚化合物與水性組合物混合的需要，可進行均化（以及任何其它類型的混合)約5至60、5至30、10至60、10至30、5至15或10至15秒(或基于5和60秒之間的任意整數(shù)）或者更長時間。均化器可以以至5000至30000rpm、10000至30000rpm、15000至30000rpm、15000至25000rpm、或20000rpm(或介于5000和30000rpm之間的任意整數(shù)）使用。將本文公開的使用均化步驟制備的水性膠體和水性溶液稱為均化水性膠體和水性溶液。[0179]在將聚α-l，3-1，6-葡聚糖醚化合物與水性組合物組合或者溶解在其中之后，可過濾或者可不過濾所得水性組合物。例如，可或者可不過濾用均化步驟制備的水性組合物。[0180]所公開發(fā)明還涉及用于制備聚α-l，3-1，6_葡聚糖醚化合物的方法。該方法包括：在堿性條件下使聚α-l，3-1，6_葡聚糖與至少一種含有有機基團的醚化劑在反應中接觸，其中所述有機基團被醚化至聚α-l，3-1，6-葡聚糖從而產(chǎn)生聚α-l，3-1，6-葡聚糖醚化合物。關于該方法的更多信息：[0181](i)所述聚α-l，3-1，6-葡聚糖的至少30%糖苷鍵是α-l，3鍵，[0182](ii)所述聚α-l，3-1，6_葡聚糖的至少30%糖苷鍵是α-l，6鍵，[0183](iii)所述聚α-l，3_1，6_葡聚糖具有至少1000的重均聚合度(DPW)，[0184](iv)所述聚α-l，3-1，6-葡聚糖的α-l，3鍵和α-l，6鍵不連續(xù)地彼此交替，并且[0185](v)所述聚α-l，3-1，6-葡聚糖醚化合物具有約0.05至約3.0的有機基團取代度(DoS)〇[0186]通過該方法制備的聚α-l，3-1，6_葡聚糖醚化合物可任選地是分離的。[0187]在堿性條件下使聚α-l，3-1，6_葡聚糖與至少一種含有有機基團的醚化劑在反應中接觸。該步驟可通過首先如下制備堿性條件來進行:使聚α-l，3-1，6_葡聚糖與溶劑和一種或多種堿金屬類氫氧化物接觸以提供混合物(例如，漿料)或溶液。因此，醚化反應的堿性條件可包含堿金屬類氫氧化物溶液。堿性條件的pH可為至少約11.0、11.2、11.4、11.6、11.8、12.0、12.2、12.4、12.6、12.8或13.0。[0188]多種堿金屬類氫氧化物均可使用，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化|丐、氫氧化鋰和/或四乙基氫氧化銨。具有聚α-1，3-1，6-葡聚糖和溶劑的制備物中堿金屬類氫氧化物的濃度可為約約l_70wt%、5_50wt%、5_10wt%、10_50wt%、10_40wt%或10_30wt%(或介于lwt%和70wt%之間的任意整數(shù)）。另選地，堿金屬類氫氧化物(例如氫氧化鈉）的濃度可為至少約lwt%、2wt%、3wt%、4wt%、5wt%、6wt%、7wt%、8wt%、9wt%、10wt%、llwt%、12wt%、13wt%、14wt%、15wt%、16wt%、17wt%、18wt%、19wt%、20wt%、21wt%、22wt%、23wt%、24wt%、25wt%、26wt%、27wt%、28wt%、29wt%或30wt%。用于制備喊性條件的喊金屬類氫氧化物可在完全水性溶液或者包含一種或多種水溶性有機溶劑(例如乙醇或異丙醇）的水性溶液中。另選地，堿金屬類氫氧化物可作為固體添加以提供堿性條件。[0189]在制備醚化反應時可任選地包含在內(nèi)或用作主要溶劑的多種有機溶劑包括例如醇、丙酮、二氧雜環(huán)己烷、異丙醇和甲苯;這些溶劑均不能使聚α-1，3_1，6-葡聚糖溶解。在某些實施方案中，可使用甲苯或異丙醇。有機溶劑可在添加堿金屬類氫氧化物之前或之后添加。包含聚α-l，3-1，6-葡聚糖和堿金屬類氫氧化物的制備物中有機溶劑(例如，異丙醇或甲苯）的濃度可為至少約l〇wt%、15wt%、20wt%、25wt%、30wt%、35wt%、40wt%、45wt%、50wt%、55wt%、60wt%、65wt%、70wt%、75wt%、80wt%、85wt%或90wt%(或介于10wt%和90wt%的任意整數(shù)）。[0190]另選地，在制備醚化反應時可使用能夠使聚α-1，3_1，6-葡聚糖溶解的溶劑。這些溶劑包括但不限于氯化鋰(LiCl)/N，N-二甲基-乙酰胺(DMAc)，S02/二乙胺(DEA)/二甲基亞砜(DMS0)，LiCl/1，3_二甲基_2_咪唑啉酮（DMI)，N，N-二甲基甲酰胺（DMF)/N2〇4、DMS0/四丁基-氟化銨三水合物（了84?)，^甲基嗎啉4-氧化物0麗〇)，附（杜611)(〇!1)2[杜6111/4三（2-氨基乙基）胺]水性溶液以及LiCKk·3H20、NaOH/脲水性溶液、水性氫氧化鈉、水性氫氧化鉀、甲酸和離子性液體的熔融物。[0191]可通過混合來使聚α-1，3-1，6-葡聚糖與溶劑和一種或多種堿金屬類氫氧化物接觸。這樣的混合可在彼此添加這些組分期間或之后進行?；旌峡赏ㄟ^例如人工混合、使用頂置式混合器的混合、使用磁力攪拌棒的混合或搖動來進行。在某些實施方案中，可先將聚〇_1，3_1，6_葡聚糖混合在水或水性溶液中，之后將其與溶劑和/或堿金屬類氫氧化物混合。[0192]在使聚α-l，3-1，6-葡聚糖、溶劑和一種或多種堿金屬類氫氧化物彼此接觸之后，可任選地將所得組合物維持在環(huán)境溫度下，持續(xù)長達14天。本文中使用的術語"環(huán)境溫度"是指約15-30°C或20-25°C(或介于15°C和30°C之間的任意整數(shù)）的溫度。另選地，可將所述組合物在約30°C至約150°C(或介于30°C和150°C之間的任意整數(shù)）的溫度下在或不在回流下加熱長達約48小時。在某些實施方案中，可將所述組合物在約55°C下加熱約30分鐘或約60分鐘。因此，可將由將聚α-1，3-1，6-葡聚糖、溶劑和一種或多種堿金屬類氫氧化物彼此混合獲得的組合物在約50°C、51°C、52°C、53°C、54°C、55°C、56°C、57°C、58°C、59°C或60°C下加熱約30-90分鐘。[0193]在使聚α-1，3-1，6-葡聚糖、溶劑和一種或多種堿金屬類氫氧化物彼此接觸之后，可任選地過濾所得組合物(施加或不施加溫度處理步驟）。這樣的過濾可使用漏斗、離心機、壓力過濾器或本領域中已知的允許從固體中去除液體的任何其它方法和/或設備來進行。盡管過濾可除去很多堿金屬類氫氧化物，但是經(jīng)過濾的聚α-l，3-1，6-葡聚糖仍然呈堿性(即，經(jīng)堿化處理的聚α-l，3_1，6_葡聚糖），從而提供堿性條件。[0194]在本文的制備聚α-l，3-1，6_葡聚糖醚化合物的方法中，在堿性條件下使包含有機基團的醚化劑與聚α-1，3-1，6-葡聚糖在反應中接觸。例如，可向通過如上述所述使聚α-1，3-1，6_葡聚糖、溶劑和一種或多種堿金屬類氧化物彼此接觸制備的組合物添加醚化劑。另選地，可在制備堿性條件時將醚化劑包含在內(nèi)（例如，可將醚化劑與聚α-1，3-1，6-葡聚糖和溶劑混合，之后與堿金屬類氫氧化物混合）。[0195]如本文所公開的，本文的醚化劑是指可用于用有機基團醚化聚α-1，3-1，6_葡聚糖的葡萄糖單元的一個或多個羥基的試劑。這樣的有機基團的示例包括烷基、羥基烷基和羧基烷基?？稍诜磻惺褂靡环N或多種醚化劑。[0196]適于制備烷基聚α-1，3_1，6_葡聚糖醚化合物的醚化劑包括例如二烷基硫酸酯、二烷基碳酸酯、烷基鹵（例如，烷基氯）、碘代烷、烷基三氟甲磺酸酯（烷基三氟甲烷磺酸酯）和烷基氟磺酸酯。因此，用于制備甲基聚α-1，3-1，6_葡聚糖醚的醚化劑的示例包括硫酸二甲酯、碳酸二甲酯、甲基氯、碘代甲烷、三氟甲磺酸甲酯和氟磺酸甲酯。用于制備乙基聚α-1，3_1，6_葡聚糖醚的醚化劑的示例包括硫酸二乙酯、碳酸二乙酯、乙基氯、碘代乙烷、三氟甲磺酸乙酯和氟磺酸乙酯。用于制備丙基聚α-1，3-1，6_葡聚糖醚的醚化劑的示例包括硫酸二丙酯、碳酸二丙酯、丙基氯、碘代丙烷、三氟甲磺酸丙酯和氟磺酸丙酯。用于制備丁基聚α-1，3_1，6-葡聚糖醚的醚化劑的示例包括硫酸二丁酯、碳酸二丁酯、丁基氯、碘代丁烷和三氟甲磺酉支丙醋。[0197]適于制備羥基烷基聚α-1，3_1，6_葡聚糖醚化合物的醚化劑包括例如環(huán)氧烷烴，例如環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷(例如，1，2_環(huán)氧丙烷）、環(huán)氧丁烷(例如，1，2_環(huán)氧丁烷、2,3_環(huán)氧丁烷、1，4_環(huán)氧丁烷)或它們的組合。作為示例，環(huán)氧丙烷可用作用于制備羥丙基聚α-1，3_1，6_葡聚糖的醚化劑，環(huán)氧乙烷可用作用于制備羥乙基聚α-1，3-1，6_葡聚糖的醚化劑。另選地，可使用羥基烷基鹵（例如，羥基烷基氯)作為用于制備羥基烷基聚α-1，3-1，6_葡聚糖的醚化劑。羥基烷基鹵的示例包括羥乙基鹵、羥丙基鹵（例如，2-羥丙基氯、3-羥丙基氯)和羥丁基鹵。另選地，可使用亞烷基氯醇作為用于制備羥基烷基聚α-1，3-1，6_葡聚糖的醚化劑。可使用的亞烷基氯醇包括但不限于氯乙醇、氯丙醇、氯丁醇或這些的組合。[0198]用于制備二羥基烷基聚α-1，3_1，6_葡聚糖醚化合物的醚化劑包括例如二羥基烷基鹵（例如，二羥基烷基氯），例如二羥基乙基鹵、二羥基丙基鹵（例如，2，3-二羥基丙基氯[即，3-氯-1，2-丙二醇])或二羥基丁基鹵。例如，2,3_二羥基丙基氯可用于制備二羥基丙基聚α-1，3-1，6-葡聚糖。[0199]適于制備羧基烷基聚α-1，3-1，6-葡聚糖醚化合物的醚化劑可包括鹵代烷基化物(例如，氯烷基化物）。鹵代烷基化物的示例包括鹵代乙酸鹽(例如，氯乙酸鹽）、3_鹵代丙酸鹽(例如，3-氯丙酸鹽)和4-鹵代丁酸鹽(例如，4-氯丁酸鹽）。流入，可使用氯乙酸鹽(例如單氯乙酸鹽）（例如，氯乙酸鈉)作為制備羧甲基聚α-1，3-1，6_葡聚糖的醚化劑。[0200]當制備具有兩種或更多種不同有機基團的聚α-1，3-1，6-葡聚糖醚化合物時，可相應地使用兩種或更多種不同的醚化劑。例如，可使用環(huán)氧烷烴和烷基氯二者作為制備烷基羥基烷基聚α-1，3-1，6_葡聚糖醚的醚化劑。因此，可組合本文公開的任何醚化劑以制備具有兩種或更多種不同有機基團的聚α-1，3_1，6_葡聚糖醚化合物。這樣的兩種或更多種醚化劑可同時用于反應中，或者可順序用于反應中。當順序使用時，可任選地在每次添加之間使用下文所公開的任意溫度處理(例如，加熱）步驟?？蛇x擇順序引入醚化劑以控制每種有機基團的期望DoS。一般來說，如果期望某一特定醚化劑形成在醚產(chǎn)物中的有機基團與所需添加之另一有機基團的DoS相比具有更高的DoS，則首先使用該特定醚化劑。[0201]在堿性條件下與聚α-1，3_1，6-葡聚糖在反應中接觸的醚化劑的量可基于所產(chǎn)生聚α-1，3_1，6_匍聚糖釀化合物中所需的DoS來確定。本文廣生的聚α-1，3_1，6_匍聚糖釀化合物中每個葡萄糖單體單元上醚取代基團的量可使用核磁共振(NMR)光譜學來確定。聚〇_1，3_1，6_葡聚糖的摩爾取代度(MS)值沒有上限。一般來說，醚化劑可以以每摩爾聚α-1，3_1，6_葡聚糖至少約0.05摩爾的量使用。可使用的醚化劑的量不存在上限。[0202]用于產(chǎn)生本文的聚α-1，3-1，6_葡聚糖醚化合物的反應可任選地在壓力容器中進行，所述壓力容器例如Parr反應器、高壓釜、振蕩管或本領域中公知的任何其它壓力容器。[0203]在堿性條件下使聚α-1，3-1，6-葡聚糖與醚化劑接觸的步驟之后，可任選地加熱本文的反應。反應溫度以及施加這樣的溫度的時間可在寬界限內(nèi)變化。例如，任選地可將反應維持在環(huán)境溫度下持續(xù)長達14天。另選地，可在約25°C至約200°C(或介于25°C至和200°C之間的任意整數(shù)）下在或不在回流下加熱反應。反應時間可相應地變化:溫度越低時間越長，溫度越高時間越短。[0204]在制備羧甲基聚α-1，3-1，6_葡聚糖的某些實施方案中，可將反應加熱至約55°C持續(xù)約3小時。因此，例如，可將用于制備本文的羧基烷基聚α-1，3-1，6_葡聚糖的反應加熱至約50°C至約60°C(或介于50°C和60°C之間的任意整數(shù)），持續(xù)約2小時至約5小時。例如，在這些實施方案中可使用諸如鹵代乙酸鹽(例如，單氯乙酸鹽)的醚化劑。[0205]任選地，可在加熱或不加熱下將本文的醚化反應維持在惰性氣體下。如本文所用，術語"惰性氣體"是指在一組給定反應條件(例如所公開的用于制備本文的反應的那些）下不發(fā)生化學反應的氣體。[0206]可同時將本文所公開反應的所有組分混合在一起并升至期望的反應溫度，隨之在攪拌或不攪拌下維持溫度，直至形成期望的聚α-1，3-1，6_葡聚糖醚化合物。另選地，可如上所述將混合組分放置在環(huán)境溫度下。[0207]在醚化之后，可中和反應的pH。反應的中和可使用一種或多種酸來進行。本文中使用的術語"中性pH"是指不呈顯著酸性或堿性的pH(例如，約6-8，或者約6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8或8.0的pH)。可用于此目的的多種酸包括但不限于硫酸、乙酸(例如，冰乙酸）、鹽酸、硝酸、任何礦物酸(無機酸）、任何有機酸或這些酸的任意組合。[0208]任選地可將在本文的反應中產(chǎn)生的聚α-1，3-1，6_葡聚糖醚化合物用不容易使該化合物溶解的液體洗滌一次或多次。例如，通?？捎么肌⒈?、芳族化合物或這些的任意組合來洗滌聚α-1，3-1，6_葡聚糖醚，這取決于其中醚化合物的溶解度(其中缺乏溶解度對洗滌而言是期望的）。一般來說，包含有機溶劑(例如醇)的溶劑優(yōu)選用于洗滌聚α-1，3-1，6_葡聚糖醚。例如，可將聚α-1，3-1，6-葡聚糖醚產(chǎn)物用包含甲醇或乙醇的水性溶液洗滌一次或多次。例如，可使用70_95wt%乙醇來洗滌產(chǎn)物。在另一實施方案中，可用甲醇:丙酮(例如，60:40)溶液來洗滌聚α-1，3-1，6-葡聚糖醚產(chǎn)物。[0209]在所公開反應中產(chǎn)生的聚α-1，3-1，6_葡聚糖醚產(chǎn)物可以是分離的。該步驟可在中和和/或洗滌步驟之前或之后使用漏斗、離心機、壓力過濾器或者本領域中已知的允許從固體中去除液體的任何其它方法和/或設備來進行?？墒褂帽绢I域中已知的任何方法來干燥分離的聚α-1，3-1，6-葡聚糖醚產(chǎn)物，例如真空干燥、空氣干燥或冷凍干燥。[0210]可使用聚α-1，3-1，6_葡聚糖醚產(chǎn)物作為起始材料來重復上述任意醚化反應以進行進一步修飾。該方法可適于增加有機基團的DoS和/或向醚產(chǎn)物添加一種或多種不同的有機基團。[0211]聚α-1，3_1，6-葡聚糖醚產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、分子量和DoS可使用本領域中已知的多種物理化學分析(例如NMR光譜學和尺寸排阻色譜(SEC))來確認。[0212]上述聚α-1，3_1，6-葡聚糖的任何實施方案均可用于本文的醚化反應。例如，本文中用于醚化反應的聚α-1，3-1，6-葡聚糖可以是包含與SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8或SEQIDN0:10至少90%相同之氨基酸序列的葡糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)物。另選地，所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶可包含與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDN0:10至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同或者100%相同的氨基酸序列。[0213]本文中用于制備聚α-1，3_1，6-葡聚糖醚化合物的聚α-1，3_1，6-葡聚糖可使用一種或多種葡糖基轉(zhuǎn)移酶(gtf)由蔗糖酶促產(chǎn)生。在將該酶促反應的聚α-1，3-1，6_葡聚糖產(chǎn)物用于制備醚之前可對其進行純化。另選地，可將gtf反應的聚α-1，3_1，6-葡聚糖產(chǎn)物經(jīng)稍微加工或不經(jīng)加工而用于制備聚α-l，3-1，6-葡聚糖醚化合物。[0214]可將聚α-1，3-1，6_葡聚糖衆(zhòng)料直接用于本文所公開的用于制備聚α-l，3_1，6_葡聚糖醚化合物的上述任何過程。如本文所用，"聚α-l，3-1，6-葡聚糖漿料"是指包含gtf酶促反應的組分的混合物。除聚α-1，3_1，6-葡聚糖自身之外，gtf酶促反應還可包含諸如以下多種組分:蔗糖、一種或多種gtf酶、葡萄糖、果糖、明串珠菌二糖、緩沖液、:FennaSure?、可溶性寡糖、寡糖引發(fā)劑、細菌酶提取物組分、硼酸鹽、氫氧化鈉、鹽酸、細胞裂解液、蛋白質(zhì)和/或核酸。最低限度地，除聚α-1，3_1，6-葡聚糖自身之外，gtf酶促反應的組分還可包括例如蔗糖、一種或多種gtf酶、葡萄糖和果糖。在另一個示例中，除聚α-1，3-1，6-葡聚糖自身之外，gtf酶促反應的組分還可包括例如蔗糖、一種或多種gtf酶、葡萄糖、果糖、明串珠菌二糖和可溶性寡糖(并且任選地包括細菌酶提取物組分）。應顯而易見的是，聚α-1，3_1，6-葡聚糖在如本文所公開的在漿料中時尚未進行純化或洗滌。還應顯而易見的是，漿料表示完成的或已產(chǎn)生可觀察量聚α-l，3-1，6-葡聚糖的gtf酶促反應，聚α-l，3-1，6-葡聚糖由于其不溶于水性反應環(huán)境(例如，5-7的pH)而形成固體。聚α-1，3_1，6-葡聚糖漿料可通過如本文中所公開的設置gtf反應來制備。[0215]另選地，可將聚α-1，3_1，6-葡聚糖的濕濾餅直接用于本文所公開的用于制備聚^1，3-1，6-葡聚糖醚化合物的上述任何方法。本文中的術語"聚〇-1，3-1，6-葡聚糖的濕濾餅"是指已與漿料分離(例如，過濾)并且用水或水性溶液洗滌的聚α-1，3_1，6-葡聚糖。例如，可將濕濾餅洗滌至少1、2、3、4、5或更多次。在制備濕濾餅時，不干燥聚€1-1，3-1，6-葡聚糖。鑒于經(jīng)洗滌的聚α-l，3_1，6_葡聚糖保留有水，將濕濾餅稱為"濕的"。[0216]聚α-l，3-1，6-葡聚糖的濕濾餅可使用本領域中已知的用于使固體與液體分離的任何裝置(例如過濾器或離心機)來制備。例如，可將在漿料中的聚α-1，3_1，6-葡聚糖固體經(jīng)濾紙收集使用網(wǎng)篩的漏斗上?？蓪⒔?jīng)過濾的濕濾餅重懸于水(例如，去離子水）中并過濾一次或多次以除去漿料的可溶性組分，例如蔗糖、果糖和明串珠菌二糖。作為用于制備濕濾餅的另一個示例，可通過離心作為沉淀物從漿料收集聚α-l，3-1，6-葡聚糖，將其重懸于水(例如，去離子水)中，并且額外再沉淀和重懸一次或多次。[0217]本文公開的組合物和方法的非限制性示例包括：[0218]1.-種反應溶液，包含水、蔗糖和合成聚α-1，3-1，6-葡聚糖的葡糖基轉(zhuǎn)移酶，其中所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶包含與SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDΝ0:8或SEQIDNO:10至少90%相同的氨基酸序列。[0219]2.根據(jù)實施方案1所述的反應溶液，其中[0220](i)所述葡聚糖的至少30%糖苷鍵是α-1，3鍵，[0221](ii)所述葡聚糖的至少30%糖苷鍵是α-1，6鍵，并且[0222](iii)所述葡聚糖具有至少1000的重均聚合度(DPW)。[0223]3.根據(jù)實施方案1或2所述的反應溶液，其中所述葡聚糖的至少60%糖苷鍵是α-1，6鍵。[0224]4.根據(jù)實施方案1、2或3所述的反應溶液，其中所述葡聚糖的DPW為至少10000。[0225]5.根據(jù)實施方案1、2、3或4所述的反應溶液，其中所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶包含SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8或SEQIDN0:10的氨基酸序列。[0226]6.-種用于制備聚α-1，3-1，6-葡聚糖的方法，包括：[0227]a)使至少水、蔗糖和合成聚α-1，3-1，6_葡聚糖的葡糖基轉(zhuǎn)移酶接觸，其中所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶包含與SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDΝ0:8或SEQIDΝ0:10至少90%相同的氨基酸序列，由此產(chǎn)生聚α-1，3-1，6-葡聚糖；以及[0228]b)任選地，分離步驟(a)中產(chǎn)生的聚α-1，3_1，6-葡聚糖。[0229]7.根據(jù)實施方案6所述的方法，其中[0230](i)所述葡聚糖的至少30%糖苷鍵是α-1，3鍵，[0231](ii)所述葡聚糖的至少30%糖苷鍵是α-1，6鍵，并且[0232](iii)所述葡聚糖具有至少1000的重均聚合度(DPW)。[0233]8.根據(jù)實施方案6或7所述的方法，其中所述葡聚糖的至少60%糖苷鍵是α-1，6鍵。[0234]9.根據(jù)實施方案6、7或8所述的方法，其中所述葡聚糖的DPW為至少10000。[0235]實施例[0236]在下文提供的實施例1-8中對所公開發(fā)明進行進一步限定。應該理解，盡管這些實施例說明了本發(fā)明的某些優(yōu)選方面，但僅是以舉例說明的方式給出。通過上述討論和這些實施例，本領域技術人員可確定本發(fā)明的必要特征，并且在不脫離本發(fā)明的實質(zhì)和范圍的情況下，可對本發(fā)明進行各種變化和修改以使其適應多種用途和條件。[0237]盤曼[0238]中使用的一些縮寫的含義如下："g"意指克，"h"意指小時，"mL"意指毫升，"psi"意指鎊每平方英寸，"wt%"意指重量百分比，"μπΓ意指微米，"°C"意指攝氏度，"mg"意指毫克，"mm"意指毫米，"此"意指微升，"mmol"意指毫摩爾，"min"意指分鐘，"mol%"意指摩爾百分比，"M"意指摩爾，"mM"意指毫摩爾，"N"意指正常，"rpm"意指每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，"w/v"意指重量體積，"MPa"意指兆帕斯卡"LB"意指肉湯，"nm"意指納米，"0D"意指光密度，"IPTG"意指異丙基硫代-半乳糖苷，"xg"意指重力，"SDS-PAGE"意指十二烷基硫酸鈉聚丙稀酰胺電泳，"DTT"意指二硫蘇糖醇，"BCA"意指二喹啉甲酸，"DMAc"意指N，N'-二甲基乙酰胺，"DMS0"意指二甲基亞砜，"NMR"意指核磁共振，"SEC"意指尺寸排阻色譜，"DI7K"意指去離子水。[0239]gg[0240]T10右旋糖酐（D9260)、IPTG(cat#I6758)、氯化三苯基四唑和BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒/試劑從SigmaCo.(St.Louis，M0)獲得。BELLC0旋轉(zhuǎn)瓶來自于BellcoCo.(Vineland，NJ)〇LB培養(yǎng)基來自于Beeton，DickinsonandCompany(FranklinLakes,NJ)〇Suppressor7153消泡劑從CognisCorporation(Cincinnati，OH)獲得。所有的其它化學制品均從此類化學制品的常用供應商獲得。[0241]種子培養(yǎng)基[0242]用于培養(yǎng)發(fā)酵罐的起始培養(yǎng)物的種子培養(yǎng)基包含:酵母提取物(Amberx695,5.0克/升（g/L))、K2HP〇4(10·Og/L)、KH2P〇4(7·Og/L)、二水合檸檬酸鈉（1·Og/L)、（NH4)2S〇4(4·Og/L)、MgS〇4七水合物（1·Og/L)和檸檬酸鐵銨(0·1Og/L)。使用5NNaOH或H2S〇4來將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至6.8,并且在燒瓶中對培養(yǎng)基進行滅菌。滅菌后的添加物包括葡萄糖（20mL/L的50%w/w溶液)和氨芐青霉素(4mL/L的25mg/mL原液）。[0243]發(fā)酵罐培養(yǎng)基[0244]在發(fā)酵罐中使用的生長培養(yǎng)基包含:KH2P〇4(3.50g/L)、FeS〇4七水合物(0.05g/L)、MgS〇4七水合物(2·0g/L)、二水合檸檬酸鈉（1·90g/L)、酵母提取物(AMBEREX695，5·0g/L)、Suppressor7153消泡劑（0.25mL/L)、NaCl(1.0g/L)、CaCl2二水合物（10g/L)和NIT痕量元素溶液（lOmL/LhNIT痕量元素溶液包含一水合檸檬酸（10g/L)、MnS〇4水合物（2g/L)、NaCl(28/1)、？6304七水合物（0.58/1)、21^04七水合物（0.28/1)、〇1304五水合物(0.028/1)和NaMo〇4二水合物(0.02g/L)。滅菌后的添加物包括葡萄糖（12.5g/L的50%w/w溶液)和氨芐青霉素(4mL/L的25mg/mL原液）。[0245]一般性方法[0246]在發(fā)酵中產(chǎn)生重組葡糖基轉(zhuǎn)移酶(gtf)[0247]通過制備表達gtf酶之大腸桿菌菌株的種前培養(yǎng)物來起始在發(fā)酵罐中產(chǎn)生重組gtf酶。將種子培養(yǎng)基的10mL等分試樣加入125-ml的一次性帶擋板燒瓶中并接種大腸桿菌菌株在20%甘油中的1.0-mL等分試樣。在于300rpm下?lián)u動的同時將培養(yǎng)物在37°C下培養(yǎng)3小時。[0248]用于起始gtf發(fā)酵培養(yǎng)的種子培養(yǎng)物通過向2-L搖瓶添加0.5L種子培養(yǎng)基來制備。將l.OmL種前培養(yǎng)物無菌轉(zhuǎn)移到燒瓶中的0.5L種子培養(yǎng)基中，并在37°C和300rpm下培養(yǎng)5小時。在37°C下，在光密度550nm(0D55Q)>2時將種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含有8L發(fā)酵罐培養(yǎng)的14-L發(fā)酵罐(Braun，PerthAmboy，NJ)中。[0249]允許大腸桿菌在發(fā)酵罐培養(yǎng)基中生長。當該培養(yǎng)物的蔗糖濃度降低至0.5g/L，向其進料葡萄糖(含有l(wèi)%w/wMgS〇4·7H20的50%w/w葡萄糖溶液）。以每分鐘0.36克進料(g進料/分鐘）開始葡萄糖進料并且分別每小時漸進式增加至0.42、0.49、0.57、0.66、0.77、0.90、1.04、1.21、1.41、1.63、1.92和2.2g進料/分鐘。在此之后，使進料速率保持不變。使用YSI葡萄糖分析儀(YSI，YellowSprings，0H)來監(jiān)測培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度。。當葡萄糖濃度超過0.lg/L時，降低或暫時停止進料速率。當細胞達到70的OD55Q時通過添加9mL的0.5MIPTG來進行gtf酶表達的誘導。將溶解氧(D0)濃度控制在25%的空氣飽和度。首先通過葉輪攪拌速率(400至1200rpm)，隨后通過通風速率(2至10標準升/分鐘，slpm)來控制D0。使用NH4〇H(14.5%w/v)和H2SO4(20%w/v)來將培養(yǎng)物pH控制在6.8。將回壓維持在0.5巴。在不同的間隔（20、25和30小時），將向發(fā)酵罐中添加5mlSuppressor7153消泡劑以抑制發(fā)泡。在加入IPTG后8小時通過離心收獲細胞并將其作為細胞糊儲存在-80°C。[0250]將由發(fā)酵獲得的每種gtf酶的細胞糊以150g/L懸浮于pH7.2的50mM磷酸鉀緩沖液中以制備漿料。將漿料在12,00(^1(1^111116型機4?￥-1000或4?￥16.56)下勻化并將均漿冷卻至4°C。在中等劇烈的攪拌下，每升細胞均漿添加50g絮凝劑溶液(Aldrichno.409138，在pH7.0的50mM磷酸鈉緩沖液中為5%)。將攪動降低至輕度攪拌，持續(xù)15分鐘。隨后，通過在5-10°C下以4500rpm離心3小時使細胞勻漿澄清。將含有gtf酶的上清液用30千道爾頓(kDa)截留膜濃縮(大約5X)以提供gtf提取物。[0251]Gtf酶活性的測定[0252]通過測量gtf反應溶液中還原糖(果糖和蔗糖）的產(chǎn)生來確定Gtf酶活性。通過向包含蔗糖(50g/L)、磷酸鉀緩沖液(pH6.5,50mM)和右旋糖酐T10(lmg/mL)的混合物添加gtf提取物（如上制備）來制備反應溶液;將gtf提取物添加至按體積計5%。然后，將反應溶液在22-25°C下溫育24-30小時，在此之后對其進行離心。將上清液(0.01mL)添加至含有INNaOH和0.1%氯化三苯基四唑（Sigma-Aldrich)的混合物。將混合物溫育5分鐘，在此之后使用ULTR0SPEC分光光度計(PharmaciaLKB，NewYork，NY)測定其OD48〇r?以測量還原糖果糖和葡萄糖的存在。[0253]糖苷鍵的確定[0254]通過13C匪R(核磁共振）或1Η匪R來確定通過gtf酶合成的葡聚糖產(chǎn)物中的糖苷鍵。[0255]對于13CNMR，在50°C下于攪拌下將干葡聚糖聚合物(25-30mg)溶解于lmL包含按重量計3%LiCl的氘化DMS0中。使用玻璃移液管，將該溶液中的0.8mL轉(zhuǎn)移到5-mmNMR管中。利用裝備有CPDUL冷凍探針的BrukerAvance500-MHzNMR光譜儀（Billerica，MA)使用26041.7Hz的光譜窗口以125.76MHz的光譜頻率采集定量13CWR譜。利用使用waltz去偶的反門控去偶脈沖序列，其中采集時間為0.629秒，脈沖間延遲為5秒，6000個脈沖。使用2.0Hz的指數(shù)乘法轉(zhuǎn)換時間域數(shù)據(jù)。[0256]對于1HNMR，將大約20mg葡聚糖聚合物樣品稱重到分析天平上的小瓶中。將小瓶從天平上移走并向小瓶添加0.8mL包含按重量計3%LiCl的氘化DMS0(DMS0-d6)。將混合物用磁力攪拌棒攪拌并溫熱至90°C，直至葡聚糖樣品溶解。使混合物冷卻至室溫。在于室溫下攪拌的同時，向聚合物溶液添加〇.2mL的三氟乙酸(TFA)在DMS0-d6中的按體積計20%溶液。添加TFA是為了將所有的羥基質(zhì)子信號移出出現(xiàn)碳水化合物環(huán)質(zhì)子信號的光譜區(qū)。使用玻璃移液管將最終溶液中的一部分(〇.8mL)轉(zhuǎn)移到5-mmNMR管中。使用NMR光譜儀以500MHz或更大的質(zhì)子頻率采集定量1HNMR譜。使用11.Oppm的光譜窗口和5.5ppm的傳送器偏移來采集光譜。以10秒的脈沖間延遲和1.5秒的采集時間施加90°脈沖，施加32個脈沖。使用0.15Hz的指數(shù)乘法轉(zhuǎn)換時間域數(shù)據(jù)。[0257]重均聚合度(DPff)的確定[0258]通過SEC來確定經(jīng)gtf酶合成的葡聚糖產(chǎn)物的DPW。將干葡聚糖聚合物溶解于DMAc和5%LiCl(0.5mg/mL)中并在100°C下?lián)u動過夜。所使用的SEC系統(tǒng)為偶聯(lián)有以下三個在線檢測器的來自于WatersCorporation(MiIford，MA)的Al1iance?2695分離模塊：來自Waters的差示折光計2410、來自WyattTechnologies(SantaBarbara，CA)的多角度光散射光度計Heleos?8+和來自Wyatt的差示毛細管粘度計ViscoStar?。用于SEC的柱為來自Shodex(Japan)的四個苯乙烯-二乙烯基苯柱以及兩個線性KD-806M、KD-802和KD-801柱以提高在聚合物分布的低分子量區(qū)的分辨率。流動相為具有0.11%LiCl的DMAc。所使用的色譜條件為:在柱和檢測器隔室中為50°C，在樣品和注射器隔室中為40°C，流量為0.5mL/分鐘并且注射體積為l〇〇yL。用于數(shù)據(jù)簡化的軟件包是來自Waters的Empower?第3版(具有寬葡聚糖聚合物標準的校準)和來自Wyatt的Astra第6版(使用柱校準的三重檢測方法）。[0259]實施例1[0260]6七謂每4297(5￡〇10從)：2)的制備[0261]該實施例描述了制備以GI號7684297標識于GENBANK中的口腔鏈球菌gtf酶的N末端截短形式（SEQIDN0:2,由SEQIDN0:1編碼，在本文中稱為"4297"）。[0262]使用經(jīng)優(yōu)化以在大腸桿菌中進行蛋白質(zhì)表達的密碼子來合成編碼gtf4297的核苷酸序列（DNA2·0，Inc·，MenloPark，CA)。將編碼gtf4297(SEQIDN0:2)的核酸產(chǎn)物（SEQIDNO:1)亞克隆到pJexpress404u(DNA2·0，Inc·)中以產(chǎn)生標識為PMP70的質(zhì)粒構(gòu)建體。使用該質(zhì)粒構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化大腸桿菌MG1655(ATCC?47076)細胞以產(chǎn)生標識為MG1655/pMP52的菌株。[0263]依照一般性方法部分中公開的操作來進行gtf4297通過細菌表達的產(chǎn)生及其酶活性的測定。通過4297產(chǎn)生的葡聚糖的鍵分布和DPW示于表2中（參見下文的實施例6)。[0264]實施例2[0265]Gtf酶3298(SEQIDN0:4)的制備[0266]該實施例描述了制備以GI號322373298標識于GENBANK中的鏈球菌C150gtf酶的N末端截短形式(SEQIDN0:4,由SEQIDNO:3編碼，在本文中稱為"3298"）。[0267]使用經(jīng)優(yōu)化以與大腸桿菌中進行蛋白質(zhì)表達的密碼子來合成編碼gtf3298的核苷酸序列（DNA2.0，Inc·)。將編碼gtf3298(SEQIDN0:4)的核酸產(chǎn)物（SEQIDN0:3)亞克隆至1JpJexpress404"中以產(chǎn)生標識為PMP98的質(zhì)粒構(gòu)建體。使用該質(zhì)粒構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化大腸桿菌MG1655(ATCC?47076)細胞以產(chǎn)生標識為MG1655/pMP98的菌株。[0268]依照一般性方法部分中公開的操作來進行gtf3298通過細菌表達的產(chǎn)生及其酶活性的測定。通過3298產(chǎn)生的葡聚糖的鍵分布和DPW示于表2中（參見下文的實施例6)。[0269]實施例3[0270]Gtf酶0544(SEQIDN0:6)的制備[0271]該實施例描述了制備以GI號290580544標識于GENBANK中的變異鏈球菌gtf酶的N末端截短形式(SEQIDN0:6,由SEQIDNO:5編碼，在本文中稱為"0544"）。[0272]使用經(jīng)優(yōu)化以與在大腸桿菌中進行蛋白質(zhì)表達的密碼子來合成編碼gtf0544的核苷酸序列（DNA2.0，Inc.)。將編碼gtf0544(SEQIDN0:6)的核酸產(chǎn)物（SEQIDN0:5)亞克隆到pJexpress404g)中以產(chǎn)生標識為PMP67的質(zhì)粒構(gòu)建體。使用該質(zhì)粒構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化大腸桿菌MG1655(ATCC?47076)細胞以產(chǎn)生標識為MG1655/pMP67的菌株。[0273]依照一般性方法部分中公開的操作來進行gtf0544通過細菌表達的產(chǎn)生及其酶活性的測定。通過0544產(chǎn)生的葡聚糖的鍵分布和DPW示于表2中（參見下文的實施例6)。[0274]實施例4[0275]Gtf酶5618(SEQIDN0:8)的制備[0276]該實施例描述了制備以GI號328945618標識于GENBANK中的血鏈球菌gtf酶的N末端截短形式（SEQIDN0:8,由SEQIDN0:7編碼，在本文中稱為"5618"）。[0277]使用經(jīng)優(yōu)化以與在大腸桿菌中進行蛋白質(zhì)表達的密碼子來合成編碼gtf5618的核苷酸序列（DNA2·0，Inc·)。將編碼gtf5618(SEQIDN0:8)的核酸產(chǎn)物（SEQIDN0:7)亞克隆到pJexpress404'中以產(chǎn)生標識為PMP72的質(zhì)粒構(gòu)建體。使用該質(zhì)粒構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化大腸桿菌MG1655(ATCC?47076)細胞以產(chǎn)生標識為MG1655/pMP72的菌株。[0278]依照一般性方法部分中公開的操作來進行gtf5618通過細菌表達的產(chǎn)生及其酶活性的測定。通過5618產(chǎn)生的葡聚糖的鍵分布和DPW示于表2中（參見下文的實施例6)。[0279]實施例5[0280]6七謂每2379(5￡〇10恥：10)的制備[0281]該實施例描述了制備以GI號662379標識于GENBANK中的唾液鏈球菌gtf酶的N末端截短形式(SEQIDN0:10，由SEQIDN0:9編碼，在本文中稱為"2379"）。[0282]使用經(jīng)優(yōu)化以與在大腸桿菌中進行蛋白質(zhì)表達的密碼子來合成編碼gtf2379的核苷酸序列(DNA2.0，Inc·)。將編碼gtf2379(SEQIDN0:10)的核酸產(chǎn)物（SEQIDN0:9)亞克隆到pJejipress404?中以產(chǎn)生標識為PMP65的質(zhì)粒構(gòu)建體。使用該質(zhì)粒構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化大腸桿菌MG1655(ATCC?47076)細胞以產(chǎn)生標識為MG1655/pMP65的菌株。[0283]依照一般性方法部分中公開的操作來進行gtf2379通過細菌表達的產(chǎn)生及其酶活性的測定。通過2379產(chǎn)生的葡聚糖的鍵分布和DPW示于表2中（參見下文的實施例6)。[0284]實施例6[0285]使用Gtf酶的不溶性葡聚糖聚合物的產(chǎn)生[0286]該實施例描述了使用上述實施例中制備的gtf酶來合成葡聚糖聚合物。[0287]依照一般性方法部分中公開的操作用上述各種gtf酶來進行反應。簡言之，制備包含蔗糖（50g/L)、磷酸鉀緩沖液(pH6.5，50mM)和gtf酶(按體積計劑2.5%提取物）的gtf反應溶液。在22-25°C下24-30小時之后，通過離心收獲不溶性葡聚糖聚合物產(chǎn)物，用水洗滌三次，用乙醇洗滌一次并在50°C下干燥24-30小時。[0288]依照一般性方法部分中公開的操作，通過13CNMR來確定來自每個反應的不溶性葡聚糖聚合物產(chǎn)物中的糖苷鍵，并通過SEC確定每種產(chǎn)物的DPW。這些分析的結(jié)果示于表2中。[0289]^2[0290]通過多種Gtf酶產(chǎn)生的葡聚糖的鍵和DPff[0292]因此，鑒定能夠產(chǎn)生具有異質(zhì)糖苷鍵分布(α-1，3和1，6鍵)和至少約1000的DPW的不溶性葡聚糖聚合物的gtf酶。這些酶可用于產(chǎn)生適于衍生成下游產(chǎn)物例如葡聚糖醚的不溶性聚α-l，3-1，6-葡聚糖，如下文實施例7中證明的。[0293]實施例7[0294]羧甲基聚α-1，3-1，6-葡聚糖的制備[0295]該實施例描述了制備葡聚糖醚衍生物，羧甲基聚α-1，3_1，6-葡聚糖。[0296]首先如實施例6中但稍作修改來制備聚α-l，3-1，6-葡聚糖。具體地，在3L蒸餾水中制備包含蔗糖(300g)、磷酸鉀緩沖液(pH5.5;8.178)#丨酶4297提取物(9〇1^)的葡聚糖聚合反應溶液。在22-25°C下24-30小時之后，通過離心收獲不溶性葡聚糖聚合物產(chǎn)物，過濾，用水洗滌三次，用乙醇洗滌兩次并在50°C下干燥24-30小時。獲得約12g聚α-1，3_1，6-葡聚糖。[0297]如一般性方法中所述來確定不溶性葡聚糖聚合物的DP0P糖苷鍵。該聚合物具有10,540的0??以及31%€[-1，3和67%€[-1，6的鍵分布。其具有1100000的重均分子量(]\〇。使用該固體葡聚糖如下制備羧甲基聚α-l，3-1，6-葡聚糖。[0298]將lg聚α-1，3_1，6-葡聚糖添加至在50-mL容量圓底燒瓶中的20mL異丙醇中，所述圓底燒瓶安裝有用于監(jiān)測溫度的熱電偶和與循環(huán)浴連接的冷凝器以及磁力攪拌棒。向制備物逐滴添加氫氧化鈉(40mL的15%溶液），然后在熱板上將其加熱至25°C。將制備物攪拌1小時，之后使溫度升高至55°C。然后，添加單氯乙酸鈉(0.3g)以提供反應，將反應在55°C下保持3小時，之后用冰乙酸中和。然后，通過真空過濾收集固體材料并用乙醇(70%)洗滌四次，在20-25°C下這空干燥并通過NMR分析以確定該固體的取代度(DoS)。經(jīng)鑒定該固體為DoS為0.464的羧甲基聚€(-1，3-1，6-葡聚糖鈉(表3中的樣品10)。[0299]表3提供了另外的羧甲基聚α-l，3-1，6_葡聚糖樣品的DoS測量結(jié)果的列表，所述羧甲基聚α-1，3_1，6-葡聚糖使用與上述方法類似的方法但如該表中所示經(jīng)一定修改來制備。表3中所列的每個反應均使用1為1100000的聚α-1，3_1，6-葡聚糖作為底物。表3中的結(jié)果表明，通過改變醚化反應的試劑量和時間，可改變產(chǎn)物DoS。[0300]整[0301]由聚α-l，3-1，6-葡聚糖制備的羧甲基聚α-l，3-1.6-葡聚糖鈉的樣品[0303]3試劑是指單氯乙酸鈉。[0304]b作為每摩爾聚α-l，3-1，6_葡聚糖的試劑摩爾數(shù)(第二列）或每摩爾聚a-Ι，3_1，6_葡聚糖的NaOH摩爾數(shù)計算的摩爾比(第三列）。[0305]由此，得以制備并分離羧甲基聚α-l，3-1，6_葡聚糖的葡聚糖醚衍生物。[0306]實施例8[0307]使用羧甲基聚α-l，3-1，6-葡聚糖的粘度調(diào)節(jié)[0308]該實施例描述了羧甲基聚α-l，3-1，6_葡聚糖對水性組合物的粘度的作用。[0309]如實施例72中所述制備多種駿甲基聚α-l，3_1，6_匍聚糖納樣品（1A-1D)。為了制備這些樣品各自的〇.6wt%溶液，向DI水（17g)添加0.102g羧甲基聚α-1，3_1，6-葡聚糖鈉。然后，使用臺式渦旋儀在l〇〇〇rpm下混合每種制備物，直至固體完全溶解。[0310]為了確定羧甲基聚α-1，3-1，6-葡聚糖的粘度，使用裝備有控溫（20°C)循環(huán)浴的BrookfieldIII+粘度計來使溶解葡聚糖醚樣品的每種溶液經(jīng)受多種剪切速率。使用從0.lrpm增加至232.5rpm的梯度程序來增加剪切速率，并且每20秒使剪切速率增加4.55(1/s)。該實驗在14.72(l/s)下的結(jié)果列于表4中。[0311]產(chǎn)|[0312]羧甲基聚α-l，3-1，6-葡聚糖溶液在不同剪切速率下的粘度[0314]3在14.72印111下的粘度。[0315]^17.04rpm下的粘度。[0316]總結(jié)于表4中的結(jié)果表明，低濃度(0.6wt%)的羧甲基聚α-l，3-1，6_葡聚糖當溶解在DI水中時可增加DI水的粘度。此外，表4中的結(jié)果表明，相對低的DoS(例如，低至0.464，參照表3和4中的樣品1D)足以使羧甲基聚α-1，3_1，6-葡聚糖成為水性組合物的有效粘度調(diào)節(jié)劑。[0317]值得注意的是，用羧甲基聚α-1，3_1，6-葡聚糖獲得的粘度水平顯著高于使用羧甲基右旋糖酐(參照比較例10)和羧甲基α-1，3-葡聚糖(參照比較例12)觀察到的粘度水平(將表4與表6和8進行比較）。這不管是具有與上述羧甲基聚α-l，3_1，6_葡聚糖樣品之DoS水平類似的DoS水平的這些其它試劑(將表3與表5和7進行比較)還是使用相同濃度(0.6wt%)的這些其它試劑。[0318]實施例9(比較)[0319]由固體右旋糖酐制備羧甲基右旋糖酐[0320]該實施例描述了制備用于實施例10的羧甲基右旋糖酐。[0321]將0.5g固體右旋糖酐(Mw=750000)添加至在50-mL容量圓底燒瓶中的10mL異丙醇中，所述圓底燒瓶安裝有用于監(jiān)測溫度的熱電偶和與循環(huán)浴連接的冷凝器以及磁力攪拌棒。向制備物逐滴添加氫氧化鈉(〇.9mL的15%溶液），然后在熱板上將其加熱至25°C。將制備物攪拌1小時，之后使溫度升高至55°C。然后，添加單氯乙酸鈉(0.15g)以提供反應，將反應在55°C下保持3小時，之后用冰乙酸中和。然后，通過真空過濾收集固體材料并用乙醇(70%)洗滌四次，在20-25°C下這空干燥并通過NMR分析以確定該固體的取代度(DoS)。經(jīng)鑒定該固體為羧甲基右旋糖酐鈉。[0322]使用Mw不同的右旋糖酐來制備另外的羧甲基右旋糖酐鈉。該實施例中制備的羧甲基右旋糖酐鈉的DoS值提供于表5中。[0323]^5[0324]由固體右旋糖酐制備的羧甲基右旋糖酐鈉的樣品[0326]3試劑是指單氯乙酸鈉。[0327]b作為每摩爾右旋糖酐的試劑摩爾數(shù)(第三列）或每摩爾右旋糖酐的NaOH摩爾數(shù)計算的摩爾比(第四列）。[0328]在實施例10中測試這些羧甲基右旋糖酐樣品的粘度調(diào)節(jié)作用。[0329]實施例10(比較)[0330]剪切速率對羧甲基右旋糖酐粘度的影響[0331]該實施例描述了包含實施例9中制備之羧甲基右旋糖酐樣品的溶液的粘度以及剪切速率對其粘度的影響。[0332]如實施例9中所述制備多種羧甲基右旋糖酐鈉樣品（2A和2B)。為了制備這些樣品各自的0.6wt%溶液，向DI水（17g)添加0.102g羧甲基右旋糖酐鈉。然后，使用臺式渦旋儀在lOOOrpm下混合每種制備物，直至固體完全溶解。[0333]為了確定羧甲基右旋糖酐的粘度，使用裝備有控溫（20°C)循環(huán)浴的BrookfieldIII+粘度計來使溶解右旋糖酐醚樣品的每種溶液經(jīng)受多種剪切速率。使用從O.lrpm增加至232.5rpm的梯度程序來增加剪切速率，并且每20秒使剪切速率增加4.55(Ι/s)。該實驗在14.72(l/s)下的結(jié)果列于表6中。[0334]^6[0335]羧甲基右旋糖酐溶液在不同剪切速率下的粘度[0337]總結(jié)于表6中的結(jié)果顯示，羧甲基右旋糖酐的0.6wt%溶液具有約2.5_7cPs的粘度。這些粘度水平顯著低于在水中使用相同低濃度(〇.6wt%)的羧甲基聚α-1，3_1，6-葡聚糖樣品所觀察到的粘度水平。特別地，表4顯示羧甲基聚α-1，3_1，6-葡聚糖溶液具有約48-2010cPs的粘度。更值得注意的是羧甲基右旋糖酐樣品2Β在粘度調(diào)節(jié)方面的這一差異，其可能具有比羧甲基聚α-1，3_1，6-葡聚糖的分子量更高的分子量。盡管具有更高的分子量，但是羧甲基右旋糖酐樣品2Β顯示出比羧甲基聚α-1，3_1，6-葡聚糖顯著更低的粘度調(diào)節(jié)效果。[0338]因此，據(jù)信聚α-1，3_1，6-葡聚糖比羧甲基右旋糖酐具有更大的粘度調(diào)節(jié)效果。[0339]實施例11(比較)[0340]羧甲基聚α-l，3-葡聚糖的制備[0341]該實施例描述了制備用于實施例12的羧甲基聚α-1，3_葡聚糖。[0342]如美國專利申請公開2013/0244288中所述使用gtfj酶制備來制備聚α-1，3_葡聚糖，所述專利申請公開全文以引用方式并入本文。[0343]將150g聚α-1，3_葡聚糖(Mw=192000)添加至在500-mL容量圓底燒瓶中的3000mL異丙醇中，所述圓底燒瓶安裝有用于監(jiān)測溫度的熱電偶和與循環(huán)浴連接的冷凝器以及磁力攪拌棒。向制備物逐滴添加氫氧化鈉(600mL的15%溶液），然后在熱板上將其加熱至25°C。將制備物攪拌1小時，之后使溫度升高至55°C。然后，添加單氯乙酸鈉（以提供反應，將反應在55°C下保持3小時，之后用90%冰乙酸中和。然后，通過真空過濾收集固體材料并用乙醇(70%)洗滌四次，在20-25°C下這空干燥并通過NMR分析以確定該固體的取代度(DoS)。經(jīng)鑒定該固體為羧甲基聚α-l，3-葡聚糖鈉。[0344]使用與上述方法類似的方法但如表7中所示經(jīng)一定修改來制備另外的羧甲基聚α_1，3-葡聚糖鈉。表7中所列的每個反應均使用^為192000的聚α-1，3_葡聚糖作為底物。[0345]^7[0346]羧甲基聚α-l，3-葡聚糖的樣品[0348]3試劑是指單氯乙酸鈉。[0349]b作為每摩爾聚α-l，3-葡聚糖的試劑摩爾數(shù)(第二列)或每摩爾聚α-l，3-葡聚糖的NaOH摩爾數(shù)計算的摩爾比（第三列）。[0350]在實施例12中測試這些羧甲基聚α-1，3_葡聚糖樣品的粘度調(diào)節(jié)作用。[0351]實施例12(比較)[0352]使用羧甲基聚α-l，3-葡聚糖的粘度調(diào)節(jié)[0353]該實施例描述了羧甲基聚α-1，3_葡聚糖對水性組合物的粘度的作用。[0354]如實施例11中所述制備不同的羧甲基聚α-1，3_葡聚糖鈉樣品（C1A和C1B)。為了制備這些樣品各自的〇.6wt%溶液，向DI水（17g)添加0.102g羧甲基聚α-1，3-葡聚糖鈉。然后，使用臺式渦旋儀在l〇〇〇rpm下混合每種制備物，直至固體完全溶解。[0355]為了確定羧甲基聚α-1，3_葡聚糖在不同剪切速率下的粘度，使用裝備有控溫(20°C)之循環(huán)浴的BrookfieldΙΙΙ+粘度計來使溶解葡聚糖醚樣品的每種溶液經(jīng)受不同的剪切速率。使用從O.lrpm增加至232.5rpm的梯度程序來增加剪切速率，并且每20秒使剪切速率增加4.55(l/s)。該實驗在14.72(l/s)下的結(jié)果列于表8中。[0356]塾[0357]羧甲基聚α-l，3-葡聚糖溶液的粘度[0359]總結(jié)于表8中的結(jié)果顯示，羧甲基聚α-1，3_葡聚糖的0.6wt%溶液具有約6_22cPs的粘度。這些粘度水平低于在水中使用相同低濃度(〇.6wt%)的羧甲基聚α-1，3_1，6-葡聚糖樣品所觀察到的粘度水平。特別地，表4顯示羧甲基聚α-1，3_1，6-葡聚糖溶液具有約48-2010cPs的粘度。[0360]因此，據(jù)信聚α-1，3_1，6-葡聚糖比羧甲基聚α-1，3_葡聚糖具有更大的粘度調(diào)節(jié)作用。[0361]實施例13(比較)[0362]使用羧甲基纖維素的粘度調(diào)節(jié)[0363]該實施例描述了羧甲基纖維素(CMC)對水性組合物的粘度的作用。[0364]將從〇11?〇]^他1：1'；[1:;[011&116&11:11(0&11丨8(30)獲得的0\^樣品（034和0313，表9)溶解于DI水中以制備每種樣品的0.6wt%溶液。[0365]為了確定CMC在不同剪切速率下的粘度，使用裝備有控溫（20°C)循環(huán)浴的BrookfieIdII1+粘度計來使溶解CMC樣品的每種溶液經(jīng)受不同的剪切速率。使用從0.lrpm增加至232.5rpm的梯度程序來增加剪切速率，并且每20秒使剪切速率增加4.55(1/s)。該實驗在14.72(l/s)下的結(jié)果列于表9中。[0366]塾[0367]CMC溶液的粘度[0369]因此，CMC(0.6wt%)可增加水性溶液的粘度。然而，據(jù)信該增加粘度的能力低于羧甲基聚α-l，3_1，6_匍聚糖增加粘度的能力。[0370]因此，據(jù)信聚α-1，3_1，6-葡聚糖可比CMC具有更大的粘度調(diào)節(jié)作用?！局鳈囗棥?.一種反應溶液，包含水、蔗糖和合成聚α-1，3-1，6-葡聚糖的葡糖基轉(zhuǎn)移酶，其中所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶包含與SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDΝ0:8或SEQIDNO:10至少90%相同的氨基酸序列。2.根據(jù)權利要求1所述的反應溶液，其中：(i)所述葡聚糖的至少30%糖苷鍵是α-1，3鍵，(ii)所述葡聚糖的至少30%糖苷鍵是α-1，6鍵，并且(iii)所述葡聚糖具有至少1000的重均聚合度(DPW)。3.根據(jù)權利要求2所述的反應溶液，其中所述葡聚糖的至少60%糖苷鍵是α_1，6鍵。4.根據(jù)權利要求2所述的反應溶液，其中所述葡聚糖的DPW為至少10000。5.根據(jù)權利要求1所述的反應溶液，其中所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶包含SEQIDNO:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8或SEQIDN0:10的氨基酸序列。6.-種用于制備聚α-1，3-1，6-葡聚糖的方法，包括：a)使至少水、蔗糖和合成聚α-1，3-1，6_葡聚糖的葡糖基轉(zhuǎn)移酶接觸，其中所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶包含與SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8或SEQIDN0:10至少90%相同的氨基酸序列，由此產(chǎn)生聚α-1，3-1，6_葡聚糖；以及b)任選地，分離步驟(a)中產(chǎn)生的所述聚α-1，3-1，6-葡聚糖。7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中：(i)所述葡聚糖的至少30%糖苷鍵是α-1，3鍵，(ii)所述葡聚糖的至少30%糖苷鍵是α-1，6鍵，并且(iii)所述葡聚糖具有至少1000的重均聚合度(DPW)。8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所述葡聚糖的至少60%糖苷鍵是α-1，6鍵。9.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所述葡聚糖的DPW為至少10000?！疚臋n編號】C12P19/04GK105980413SQ201580008474【公開日】2016年9月28日【申請日】2015年2月11日【發(fā)明人】J.L.保林,M.S.佩恩,T.J.丹尼斯,Y.布倫,R.納姆比亞,T.肖爾斯【申請人】納幕爾杜邦公司