使用生物聚合物的傷口敷料的制備方法、及利用其方法制備的使用生物聚合物的傷口敷料的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種使用生物聚合物的傷口敷料的制備方法。根據(jù)本發(fā)明制備的傷口敷料可具有抑制傷口感染和防止粘連的優(yōu)異效果。
【專利說(shuō)明】
使用生物聚合物的傷口敷料的制備方法、及利用其方法制備 的使用生物聚合物的傷口敷料
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種使用生物聚合物的傷口敷料的制備方法及利用其方法制備的使 用生物聚合物的傷口敷料。根據(jù)本發(fā)明制備的傷口敷料可具有抑制傷口感染和防止粘連的 優(yōu)異效果。
【背景技術(shù)】
[0002] 術(shù)后傷口感染是手術(shù)患者最常見(jiàn)的院內(nèi)感染，占所有被感染病人的38%，根據(jù)美 國(guó)疾病預(yù)防控制中心和保存中心(CDC)全國(guó)醫(yī)院感染監(jiān)控(NNIS)系統(tǒng)報(bào)告，手術(shù)部位感染 (SSI)是第三個(gè)最常見(jiàn)的院內(nèi)感染，據(jù)住院患者統(tǒng)計(jì)，所述感染占全部醫(yī)院感染的14~ 16%。另一份報(bào)告顯示，美國(guó)每年執(zhí)行2700萬(wàn)例手術(shù)，其中發(fā)生SSI有67.5萬(wàn)例，并且歐洲每 年執(zhí)行3000萬(wàn)例手術(shù)，其中發(fā)生SSI有90萬(wàn)例左右。SSI對(duì)發(fā)病率和恢復(fù)期是一個(gè)不利因素， 對(duì)于患者、施術(shù)者和整體醫(yī)療保健行業(yè)會(huì)造成嚴(yán)重的問(wèn)題，導(dǎo)致住院期間延長(zhǎng)，由此帶來(lái)醫(yī) 療保險(xiǎn)預(yù)算的增加。由于外科手術(shù)技法和無(wú)菌技術(shù)多年來(lái)發(fā)展，許多國(guó)家的SSI發(fā)生率已顯 著降低，但是，這種進(jìn)展引起到其他問(wèn)題，例如耐藥菌株增加和高風(fēng)險(xiǎn)手術(shù)患者增加。尤其， 糖尿病或肥胖患者的手術(shù)顯示增加了SSI的風(fēng)險(xiǎn)，并且在這一領(lǐng)域發(fā)病率的增加也是有關(guān) 從事人員主要關(guān)注的焦點(diǎn)。世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì)，糖尿病患者的數(shù)量將會(huì)從2010年的1.71億 增加到3.66億，從而要對(duì)SSI引起格外注意。
[0003] 在為防止SSI所做的努力中，除了嚴(yán)格的無(wú)菌環(huán)境和此基礎(chǔ)上的手術(shù)技術(shù)應(yīng)用外， 在預(yù)防方面上，可以考慮使用抗生素。然而，抗生素長(zhǎng)期的直接血管內(nèi)給藥可導(dǎo)致抗生素耐 藥性及所得到的毒性風(fēng)險(xiǎn)，因此使用抗生素需要謹(jǐn)慎的考慮。并且，在專利號(hào)為1，321，818 和專利公開(kāi)號(hào)為2014/0038915A1的美國(guó)專利中公開(kāi)了以局部使用作為目的的產(chǎn)品（ _G :entacolK_<和ColkUcmpCKR )如可吸收的慶大霉素膠原植入物(GCI)，它的出現(xiàn)可以幫助解 決這種問(wèn)題。
[0004] 與直接血管內(nèi)注射相比，慶大霉素的局部使用可以在傷口部位形成顯著更高濃 度，反而可致慶大霉素在血液中的濃度相對(duì)降低，因此與血管內(nèi)注射相比，可以減少副作用 或毒性的風(fēng)險(xiǎn)。此外，通過(guò)這種方法，可以期待避免抗生素長(zhǎng)期低濃度給藥引起的耐性問(wèn) 題、以及高濃度慶大霉素起到與廣譜抗生素同樣的作用。實(shí)際上，已經(jīng)確認(rèn)局部高濃度治療 導(dǎo)致慶大霉素耐藥菌株死亡，據(jù)報(bào)告顯示，在諸多領(lǐng)域的外科手術(shù)例(GI，cardiovascular and orthopeadic surgery)中，用于預(yù)防或治療目的的這種產(chǎn)品的使用，會(huì)減少SSI風(fēng)險(xiǎn)。
[0005] 另外，術(shù)后粘連是正常彼此分開(kāi)的周圍器官或組織之間的連接，其是由在包括由 炎癥、切口、擦傷或外科手術(shù)等引起的創(chuàng)傷的傷口愈合過(guò)程中纖維組織或外滲物的過(guò)度生 成以及血液的凝固而產(chǎn)生的。在任一種外科手術(shù)后可能會(huì)引起粘連，并且由于在手術(shù)后愈 合過(guò)程中在手術(shù)部位周圍的器官或組織之間的粘連，可能會(huì)引起嚴(yán)重的臨床后遺癥。
[0006] 據(jù)報(bào)道，通常手術(shù)后器官粘連的發(fā)生率的范圍是55 %~93 % (Ann. Royal Coll .Surg.Engl ·，75,147-153,1993)。腹部手術(shù)后發(fā)生粘連較多。盡管這些粘連中的一些 可能發(fā)生自發(fā)分解，但是在大多數(shù)的情況下甚至是在傷口愈合以后仍然存在有粘連，這可 能導(dǎo)致多種后遺癥。后遺癥的種類是多種多樣的。根據(jù)美國(guó)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，已知在隨后的手術(shù) 中所述術(shù)后粘連（作為主要的癥狀）伴隨有49 %至74%的腸閉塞、15 %至20 %的不育癥、 20%至50%的慢性骨盆痛、和 19%的腸穿孔(Eur.J.Surg.，Suppl577,32-39，1997)。
[0007]腹膜內(nèi)粘連的形成機(jī)制已在G r a n g e r發(fā)表的論文中有詳細(xì)的描述 (Infert.Reprod.Med.Clin.North Am.，5:3,391_404,1994) aGranger認(rèn)為在手術(shù)后產(chǎn)生的 滲出物中由凝血過(guò)程中產(chǎn)生的纖維蛋白引起粘連。炎性滲出物富含纖維蛋白，所述纖維蛋 白在傷口表面形成血塊。當(dāng)纖維蛋白降解時(shí)，間皮再生，這通常導(dǎo)致傷口的愈合。纖維蛋白 的降解或纖維蛋白溶解依賴于纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白溶酶（其為纖維蛋白溶解 酶），并且該反應(yīng)由存在于間皮和基礎(chǔ)基質(zhì)中的組織型纖溶酶原激活物(tPA)所促進(jìn)。然而， 如果不發(fā)生纖維蛋白溶解，則炎性細(xì)胞和成纖維細(xì)胞滲透到所述纖維蛋白基質(zhì)中，導(dǎo)致組 織粘連。在這種方式中，通過(guò)一系列的纖維蛋白生成機(jī)制和纖維蛋白溶解機(jī)制而發(fā)生粘連， 并且這兩個(gè)機(jī)制之間的關(guān)系是復(fù)雜的且與傷口的愈合過(guò)程是密切相關(guān)的。
[0008] 作為預(yù)防所述粘連的多種方法之一，已針對(duì)預(yù)防相鄰組織之間粘連形成的抗粘連 劑進(jìn)行深入研究，所述抗粘連劑是通過(guò)在組織的傷口愈合過(guò)程中采用屏障形成物理屏障來(lái) 進(jìn)行預(yù)防所述粘連，這與表面活性劑的作用相似。這些屏障所采用的抗粘連屏障可根據(jù)它 們的類型大致地分為兩類:一類是包括薄膜型、非交織型和海綿型的膜型屏障，另一類是包 括凝膠型的溶液型屏障。
[0009] 所述膜型抗粘連材料的實(shí)施例包括氧化-再生纖維素、膨體聚四氟乙烯（以下稱為 "ePTFE"）、由改性透明質(zhì)酸、羧甲基纖維素鈉和化學(xué)改性劑等組成的膜劑。所述溶液型抗粘 連材料的實(shí)施例包括乳酸鹽林格溶液、右旋糖酐-70溶液、肝素溶液、羧甲基纖維素鈉溶液、 透明質(zhì)酸溶液、硫酸軟骨素溶液、聚乙二醇溶液、泊洛沙姆溶液等。在這些溶液型抗粘連材 料中，乳酸鹽林格溶液、右旋糖酐-70溶液、肝素溶液等具有主要的機(jī)制，即在腹膜的愈合過(guò) 程中誘導(dǎo)纖維蛋白覆蓋的表面相互分離。盡管它們是已被用于通過(guò)使組織相互分離而抑制 粘連的制劑，但是由于它們能被腹膜快速吸收，因此不能得到令人滿意的抗粘連效果 (Am.Surg.，63,775-777，1983)。同時(shí)，由于聚乙二醇等在體內(nèi)不能降解，僅可采用當(dāng)吸收時(shí) 可通過(guò)代謝途徑排出的低分子量材料。然而，使用所述低分子量材料會(huì)導(dǎo)致過(guò)快吸收，使得 其不能在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)作為有效的屏障防止粘連。
[0010] 同時(shí)，在專利號(hào)為4,141，973的美國(guó)專利中公開(kāi)的透明質(zhì)酸是由交替連接的β-D-N-乙酰葡糖胺和β-D-葡萄糖醛酸組成的線性大分子多糖，并且已知即使當(dāng)其被植入或注入 體內(nèi)時(shí)，其仍具有優(yōu)異的生物相容性。然而，還由于在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)在體內(nèi)的分解和吸 收，其在作為抗粘連劑的性能方面仍存在限制。為了嘗試改善這些缺點(diǎn)，專利號(hào)為6,387， 413 B1的美國(guó)專利公開(kāi)了通過(guò)添加例如為羧甲基纖維素的聚合物化合物而制備透明質(zhì)酸 凝膠組合物，以實(shí)現(xiàn)對(duì)透明質(zhì)酸凝膠在物理性質(zhì)方面進(jìn)行補(bǔ)充的目的。迄今為止，由此開(kāi)發(fā) 的材料顯示出了預(yù)防粘連的潛力，但是由于主要采用化學(xué)交聯(lián)方法，仍然存在有與不便于 除去交聯(lián)劑或添加劑和方法復(fù)雜相關(guān)的問(wèn)題以及毒性和安全性的問(wèn)題。
[0011]另外，膠原蛋白是世界上最豐富的蛋白之一，幾乎可從所有的生命體中提取得到。 在組織工程中主要采用的膠原蛋白是從牛的皮或肌肉或者豬皮中提取的。然而，據(jù)報(bào)道膠 原蛋白本身是一種參與免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)，通過(guò)除去表現(xiàn)主要免疫功能的端肽進(jìn)行免疫應(yīng) 答最小化的膠原蛋白還具有螺旋結(jié)構(gòu)，但膠原蛋白表面的氨基酸序列等可能會(huì)引起免疫應(yīng) 答。尤其，針對(duì)牛中提取的膠原蛋白來(lái)說(shuō)，沒(méi)有充分的科學(xué)依據(jù)證明百分百可以確保瘋牛病 (BSE)因子的安全性。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0012] 技術(shù)問(wèn)題
[0013] 作為為開(kāi)發(fā)一種可以替代高價(jià)膠原材料(其在慶大霉素膠原植入物中起到載體作 用）的物質(zhì)、以及為開(kāi)發(fā)一種多功能性材料(其實(shí)現(xiàn)手術(shù)后傷口愈合和防止粘連的目的）而 進(jìn)行深入研究的結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過(guò)采用以透明質(zhì)酸為基礎(chǔ)的生物聚合物，可 以制備具有抑制傷口感染和防止粘連的效果，并具有柔和質(zhì)感和均勻表面的傷口敷料。
[0014] 技術(shù)方案
[0015] 根據(jù)第一實(shí)施例，公開(kāi)一種傷口敷料的制備方法，其包括以下步驟:使用抗生素和 透明質(zhì)酸或其鹽來(lái)制備溶液;將所制備的溶液在旋轉(zhuǎn)下進(jìn)行冷凍；以及將所述冷凍溶液進(jìn) 行干燥。
[0016] 根據(jù)第二實(shí)施例，公開(kāi)一種傷口敷料的制備方法，其包括以下步驟:i)使用抗生素 和透明質(zhì)酸或其鹽來(lái)制備溶液;ii)將所制備的溶液進(jìn)行冷凍；iii)將所述冷凍溶液進(jìn)行解 凍；iv)將所述解凍溶液重新進(jìn)行冷凍；以及v)將所述重新冷凍的溶液進(jìn)行干燥。在所述實(shí) 施例中，步驟ii)至iii)可重復(fù)進(jìn)行2~6次。
[0017] 根據(jù)第三實(shí)施例，公開(kāi)一種傷口敷料的制備方法，其包括以下步驟:i)使用抗生素 和透明質(zhì)酸或其鹽來(lái)制備溶液；ii)將所制備的溶液低溫放置8小時(shí)以上；iii)將所述低溫 放置溶液進(jìn)行冷凍；以及iv)將所述冷凍溶液進(jìn)行干燥。根據(jù)所述實(shí)施例，低溫可以為0~10 Γ。
[0018] 技術(shù)效果
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的方法制備的透明質(zhì)酸傷口敷料具有柔和質(zhì)感和均勻表面形態(tài)，因此 可以替代膠原蛋白。并且，根據(jù)本發(fā)明的方法制備的透明質(zhì)酸傷口敷料具有抑制傷口感染 和防止粘連的優(yōu)異效果。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1示出根據(jù)實(shí)施例1制備的傷口敷料的照片。
[0021] 圖2示出根據(jù)實(shí)施例2制備的傷口敷料的照片。
[0022] 圖3示出根據(jù)實(shí)施例3制備的傷口敷料的照片。
[0023] 圖4示出根據(jù)實(shí)施例4制備的傷口敷料的照片。
[0024] 圖5示出根據(jù)實(shí)施例5制備的傷口敷料的照片。
[0025] 圖6和圖7示出根據(jù)比較例1制備的傷口敷料的照片。
[0026] 圖8示出根據(jù)比較例2制備的傷口敷料的照片。
[0027] 圖9示出基于實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1的使用對(duì)照組敷料的大鼠的粘連照片。
[0028] 圖10示出基于實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1的使用實(shí)施例5的敷料的大鼠的粘連照片。
[0029] 圖11示出基于實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2的在腸道感染模型中進(jìn)行抑制感染試驗(yàn)的結(jié)果。
[0030] 最佳的【具體實(shí)施方式】
[0031] 本文所使用的術(shù)語(yǔ)僅僅用于描述特定實(shí)施例，而不是意在限制本發(fā)明的范圍。除 非在文脈上明確表示不同的含義，單數(shù)的表達(dá)包括復(fù)數(shù)的表達(dá)。在本申請(qǐng)中，"包括"或"具 有"等術(shù)語(yǔ)用于指定說(shuō)明書(shū)中記載的特征、數(shù)字、步驟、動(dòng)作、構(gòu)成要素、部件或這些組合的 存在，而應(yīng)當(dāng)理解為，并不預(yù)先排除一個(gè)或一個(gè)以上的其他特征或數(shù)字、步驟、動(dòng)作、構(gòu)成要 素、部件或這些組合的存在或附加可能性。
[0032] 除非另有定義，本說(shuō)明書(shū)中所使用的所有術(shù)語(yǔ)包括技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)，具有與本發(fā) 明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。諸如在通常使用的詞典中定義的 此類術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)被解釋成具有與相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域中的上下文含義相同的含義，并且不應(yīng)當(dāng)被解 釋成具有理想或過(guò)度正式的含義。
[0033] 本發(fā)明的目的是提供一種使用透明質(zhì)酸作為生物聚合物來(lái)制備傷口敷料的方法 及由此制備的傷口敷料。
[0034]本說(shuō)明書(shū)中所使用的術(shù)語(yǔ)"透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid)"是指以N-乙酰葡糖胺 (N-acetyl glucosamin)和葡萄糖醛栓(glucuronic acid)為基本單位組成的線性聚合物， 發(fā)現(xiàn)它在分子量達(dá)數(shù)百萬(wàn)的幾乎所有的生物有機(jī)體中結(jié)構(gòu)相同，主要作為細(xì)胞外基質(zhì) (Extracellular Matrix)的成分。由于透明質(zhì)酸不管物種之間差異都具有相同的結(jié)構(gòu)，因 此它被稱為是一個(gè)沒(méi)有免疫應(yīng)答的聚合物，與提取源并不相關(guān)。并且迄今為止，它被使用在 諸如退行性關(guān)節(jié)炎、白內(nèi)障、皺紋改善、藥物遞送(drug delivery)、干細(xì)胞領(lǐng)域的支架載 體、化妝品的保濕維持成分等許多領(lǐng)域，是一種安全的天然多糖類。
[0035] 最初，透明質(zhì)酸是從家畜中提取的，如?；螂u，但如今通過(guò)微生物的發(fā)酵而生產(chǎn)。 因此，可確保不受對(duì)人體有害的如瘋牛病或禽流感等因子的感染，并且可替代相對(duì)高價(jià)的 膠原蛋白。
[0036] 然而，當(dāng)使用透明質(zhì)酸制造產(chǎn)品時(shí)，例如一般的墊、貼片和片材，在執(zhí)行冷凍干燥 工序后疏松易碎，并且在冷凍過(guò)程中生成帶紋理或具有粗糙表面的干燥物，由此存在問(wèn)題， 如不可能制備與現(xiàn)有Jj父原蛋白廣品質(zhì)感相同的廣品。
[0037] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，提供一種傷口敷料的制備方法，其包括以下步驟:使用抗生素和 透明質(zhì)酸或其鹽來(lái)制備溶液;將所制備的溶液在旋轉(zhuǎn)下進(jìn)行冷凍；以及將所述冷凍溶液進(jìn) 行干燥。
[0038] 在所述實(shí)施例中，所述抗生素可以是至少一種選自頭孢菌素、β-內(nèi)酰胺、氨基糖苷 類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類和四環(huán)素類的抗生素，但并不限定于此。
[0039] 在所述實(shí)施例中，所述透明質(zhì)酸鹽可以是至少一種選自透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀、 透明質(zhì)酸鈣、透明質(zhì)酸鎂、透明質(zhì)酸鋅、透明質(zhì)酸鈷和透明質(zhì)酸四丁基銨的透明質(zhì)酸鹽，但 并不限定于此。
[0040] 在所述實(shí)施例中，所述透明質(zhì)酸的分子量可以為10,000~3,000,000道爾頓。
[0041 ]在所述實(shí)施例中，所述透明質(zhì)酸的濃度可以為0.1~5% (w/v)。
[0042] 在所述實(shí)施例中，所述抗生素與透明質(zhì)酸的濃度比為2:1至1:10。
[0043] 在所述實(shí)施例中，所述溶液的pH值可以為4.0~8.0。
[0044] 根據(jù)另一實(shí)施例，公開(kāi)一種傷口敷料的制備方法，其包括以下步驟:i)使用抗生素 和透明質(zhì)酸或其鹽來(lái)制備溶液;ii)將所制備的溶液進(jìn)行冷凍；iii)將所述冷凍溶液進(jìn)行解 凍;iv)將所述解凍溶液重新進(jìn)行冷凍；以及v)將所述重新冷凍的溶液進(jìn)行干燥。
[0045] 在所述實(shí)施例中，步驟ii)至iii)可重復(fù)進(jìn)行2~6次。
[0046] 在所述實(shí)施例中，所述抗生素可以是至少一種選自頭孢菌素、β-內(nèi)酰胺、氨基糖苷 類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類和四環(huán)素類的抗生素，但并不限定于此。
[0047] 在所述實(shí)施例中，所述透明質(zhì)酸鹽可以是至少一種選自透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀、 透明質(zhì)酸鈣、透明質(zhì)酸鎂、透明質(zhì)酸鋅、透明質(zhì)酸鈷和透明質(zhì)酸四丁基銨的透明質(zhì)酸鹽，但 并不限定于此。
[0048] 在所述實(shí)施例中，所述透明質(zhì)酸的分子量可以為10,000~3,000,000道爾頓。
[0049] 在所述實(shí)施例中，所述透明質(zhì)酸的濃度可以為0.1~5% (w/v)。
[0050] 在所述實(shí)施例中，所述抗生素與透明質(zhì)酸的濃度比為2:1至1:10。
[0051 ]在所述實(shí)施例中，所述溶液的pH值可以為4.0~8.0。
[0052]根據(jù)另一實(shí)施例，提供一種傷口敷料的制備方法，其包括以下步驟:i)使用抗生素 和透明質(zhì)酸或其鹽來(lái)制備溶液；ii)將所制備的溶液低溫放置8小時(shí)以上；iii)將所述低溫 放置溶液進(jìn)行冷凍；以及iv)將所述冷凍溶液進(jìn)行干燥。
[0053] 在所述實(shí)施例中，所述低溫可以為0~10°C。
[0054] 在所述實(shí)施例中，所述抗生素可以是至少一種選自頭孢菌素、β_內(nèi)酰胺、氨基糖苷 類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類和四環(huán)素類的抗生素，但并不限定于此。
[0055] 在所述實(shí)施例中，所述透明質(zhì)酸鹽可以是至少一種選自透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀、 透明質(zhì)酸鈣、透明質(zhì)酸鎂、透明質(zhì)酸鋅、透明質(zhì)酸鈷和透明質(zhì)酸四丁基銨的透明質(zhì)酸鹽，但 并不限定于此。
[0056] 在所述實(shí)施例中，所述透明質(zhì)酸的分子量可以為10,000~3,000,000道爾頓。
[0057] 在所述實(shí)施例中，所述透明質(zhì)酸的濃度可以為0.1~5% (w/v)。
[0058] 在所述實(shí)施例中，所述抗生素與透明質(zhì)酸的濃度比為2:1至1:10。
[0059] 在所述實(shí)施例中，所述溶液的pH值可以為4.0~8.0。
[0060] 根據(jù)本發(fā)明的方法制備的透明質(zhì)酸傷口敷料具有柔和質(zhì)感和均勻型表面，因而有 望替代膠原蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0061] 下面，根據(jù)實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。這些實(shí)施例僅僅是用于具體說(shuō)明本發(fā)明， 本發(fā)明的范圍不局限于這些實(shí)施例，這對(duì)于本發(fā)明所屬的的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn) 的。
[0062] <實(shí)施例>
[0063] 實(shí)施例1:制備含有慶大霉素的透明質(zhì)酸傷口敷料(旋轉(zhuǎn)式冷凍)
[0064] 將0.6%的慶大霉素(Gentamicin)和0.9%的NaCl溶解在0.3% (w/v)透明質(zhì)酸鈉 溶液中，用稀NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.5。然后，將該溶液倒入圓筒形燒杯浸漬于-20°C水池中， 在lOOrpm下旋轉(zhuǎn)并進(jìn)行冷凍。冷凍結(jié)束后，使用冷凍干燥機(jī)干燥72小時(shí)（圖1)。其結(jié)果，從圖 1可知，獲得了柔軟及表面光滑的傷口敷料。
[0065] 實(shí)施例2:制備含有慶大霉素的透明質(zhì)酸傷口敷料(旋轉(zhuǎn)式冷凍)
[0066]通過(guò)與上述實(shí)施例1相同的方法制備含有慶大霉素的透明質(zhì)酸傷口敷料（圖2)，不 同的是，所加入的透明質(zhì)酸鈉的濃度為〇.5%(w/v)。其結(jié)果，從圖2可知，獲得了柔軟及表面 光滑的傷口敷料。
[0067] 實(shí)施例3:制備含有慶大霉素的透明質(zhì)酸傷口敷料(旋轉(zhuǎn)式冷凍)
[0068] 通過(guò)與上述實(shí)施例1相同的方法制備含有慶大霉素的透明質(zhì)酸傷口敷料（圖3)，不 同的是，所加入的透明質(zhì)酸鈉的濃度為〇.8%(w/v)。其結(jié)果，從圖3可知，獲得了柔軟及表面 光滑的傷口敷料。
[0069] 實(shí)施例4:制備含有慶大霉素的透明質(zhì)酸傷口敷料(冷凍/解凍)
[0070] 將0.6%的慶大霉素和0.9%的NaCl溶解在0.8% (w/v)透明質(zhì)酸鈉溶液中，用稀 NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.5。然后，取50ml該溶液放入正方形培養(yǎng)皿，-20°C下進(jìn)行第一次冷凍5 小時(shí)，然后在室溫下進(jìn)行解凍。解凍結(jié)束后，在與第一次冷凍溫度相同的條件下進(jìn)行第二次 冷凍5小時(shí)，然后在冷凍干燥機(jī)中干燥72小時(shí)（圖4)。其結(jié)果，從圖4可知，獲得了柔軟及表面 光滑的傷口敷料。
[0071] 實(shí)施例5:制備含有慶大霉素的透明質(zhì)酸傷口敷料(低溫放置)
[0072] 將0.6%的慶大霉素和0.9%的NaCl溶解在1.0% (w/v)透明質(zhì)酸鈉溶液中，用稀 NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.5。然后，取50ml該溶液放入培養(yǎng)皿，置于10 °C環(huán)境下放置8小時(shí)，在-20 °C下進(jìn)行冷凍后，在冷凍干燥機(jī)中干燥72小時(shí)（圖5)。其結(jié)果，從圖5可知，獲得了柔軟及表 面光滑的傷口敷料。
[0073] 比較例1:制備含有慶大霉素的透明質(zhì)酸傷口敷料(通常的方法)
[0074] 將0.6%的慶大霉素和0.9%的NaCl溶解在0.8% (w/v)透明質(zhì)酸鈉溶液中，用稀 NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.5。取50ml該溶液放入正方形培養(yǎng)皿，在-20 °C下冷凍5小時(shí)后（圖6 )，在 冷凍干燥機(jī)中干燥72小時(shí)（圖7)。
[0075]從圖6和圖7可知，冷凍溶液表面生成紋理，或者表面產(chǎn)生不均勻，由此確認(rèn)干燥物 在使用過(guò)程中易碎或?qū)诓课皇褂美щy。
[0076] 比較例2:制備含有慶大霉素的透明質(zhì)酸傷口敷料Π
[0077] 將0.6%的慶大霉素和0.9%的NaCl溶解在0.8% (w/v)透明質(zhì)酸鈉溶液中，沒(méi)有調(diào) 節(jié)pH，并取50ml該溶液放入正方形培養(yǎng)皿，在-20°C下進(jìn)行第一次冷凍5小時(shí)后，將所述培養(yǎng) 皿置于室溫下進(jìn)行解凍。然后，所述解凍結(jié)束后，在與第一次冷凍溫度相同的條件下進(jìn)行第 二次冷凍5小時(shí)，其后在冷凍干燥機(jī)中干燥72小時(shí)（圖8)。其結(jié)果，從圖8可知，確認(rèn)了傷口敷 料表面不均勻，且易碎。
[0078] <實(shí)驗(yàn)實(shí)施例>
[0079] 實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1:在大鼠盲腸/腹腔壁磨損模型中進(jìn)行抗粘連試驗(yàn) [0080]采用大鼠盲腸/腹腔壁磨損模型評(píng)價(jià)上述實(shí)施例中制備的傷口敷料的抗粘連性 能。作為試驗(yàn)動(dòng)物，采用7周Sparague-Dawley雄性大鼠（SLC，日本)并對(duì)其進(jìn)行分組(n = 5/ 組）。為了誘導(dǎo)粘連，通過(guò)腹腔注射Ketamin · KCL(0 . lml/100g)對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行麻醉，然后 腹部剃毛并用70%乙醇消毒，其后在腹部的中線做4~5cm切口。從切開(kāi)的部位取出盲腸，用 滅菌的紗布摩擦所述盲腸的漿膜(1.2cmX 1.2cm)直到發(fā)生出血，采用試劑勺使相對(duì)的腹膜 損傷（1.2cmX 1.2cm)。用5-0尼龍縫線固定與所述摩擦損傷區(qū)域lcm遠(yuǎn)的兩個(gè)點(diǎn)，使得兩個(gè) 損傷的表面接觸，從而促使粘連的形成。
[0081 ] 將生理鹽水注入空白對(duì)照組。對(duì)于實(shí)驗(yàn)組，將通過(guò)實(shí)施例1~5以及比較例1和2中 制備的敷料（lcmX lcm)敷貼于磨損部位，然后，縫合腹膜和皮膚。在手術(shù)結(jié)束后，在一周內(nèi) 隨意給動(dòng)物喂食飼料和水，然后處死，并評(píng)價(jià)粘連。采用粘連評(píng)價(jià)系統(tǒng)，得到的分?jǐn)?shù)計(jì)算總 和以及求平均值(Am.J.Obstet.Gynecol.，146，88-92,1983)。結(jié)果示于表 1。
[0082] 根據(jù)以下分為0至5等級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)粘連的程度(0:無(wú)粘連，1: 一個(gè)薄膜狀粘連，2: 兩個(gè)或兩個(gè)以上薄膜狀粘連，3:病灶局部厚粘連，4:片狀局部粘連，5:伴隨有血管形成或一 個(gè)或一個(gè)以上片狀密集粘連的非常厚的粘連）。
[0083] 根據(jù)以下分為1至4等級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)粘連的強(qiáng)度(1:容易被非常弱的力釋放的薄膜 狀的粘連，2:需要適當(dāng)?shù)牧?lái)釋放粘連，3:采用相當(dāng)大的壓力釋放的粘連，4:難于釋放的或 者需要非常高的壓力來(lái)釋放的非常強(qiáng)的粘連）。
[0084] [表1]
[0085]
[0086] 數(shù)據(jù)由平均值土S.D(n = 5)表示
[0087] *:與無(wú)（陰性對(duì)照）比較，p < 0.05，#:與無(wú)（陰性對(duì)照）比較，p < 0.05
[0088] 如表1所示，與對(duì)照組相比較，根據(jù)本發(fā)明的制備方法制備的實(shí)施例1至實(shí)施例5的 敷料使用組顯示出顯著的組織粘連減少。這也可從圖9和圖10中確認(rèn)得到，圖9示出使用對(duì) 照組敷料的粘連結(jié)果照片，圖10示出使用實(shí)施例5的敷料的粘連結(jié)果照片。
[0089] 另外，與對(duì)照組相比較，根據(jù)通常的制備方法制備的比較例1和2的敷料使用組顯 示出輕微的組織粘連減少效果，但由于敷料的組織不均勻，因而確認(rèn)到與實(shí)施例1至實(shí)施例 5的敷料使用組相比較，粘連減少率明顯較低。
[0090] 實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2:在小鼠腸道感染模型中進(jìn)行抑制感染試驗(yàn)
[0091] 采用Balb/C雄性小鼠腸道感染模型評(píng)價(jià)上述實(shí)施例5中制備的傷口敷料的抑制感 染性能。抑制感染試驗(yàn)組分為Control試驗(yàn)組、CLP試驗(yàn)組、以及實(shí)施例5的傷口敷料使用組， 每組使用10只Balb/C雄性小鼠（其中，Control試驗(yàn)組使用6只），并將所述傷口敷料（IX lcm 2)插入在小鼠體內(nèi)。具體地說(shuō)，試驗(yàn)前一天將小鼠腹部毛剃除，試驗(yàn)當(dāng)天通過(guò)腹腔注射 麻醉劑阿佛丁（ 300mg/kg)對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉大約20分鐘。輪流使用聚維酮和70 %乙醇，將被 麻醉的小鼠腹部消毒3次。然后，在腹部離中線靠左lcm的部位做2~3cm切口。從切開(kāi)的部位 取出盲腸，用黑絲(Black silk)扎好距底部3/4處后，使用21G注射針穿出一個(gè)孔，從盲腸中 擠出少量的內(nèi)容物。對(duì)于CLP試驗(yàn)組，將盲腸重新放回腹部后進(jìn)行縫合。對(duì)于實(shí)施例5中制備 的傷口敷料使用組，將盲腸放回腹部后，在腹中放入傷口敷料（IX lcm2)后進(jìn)行縫合。關(guān)于 感染菌數(shù)量，通過(guò)以下方法進(jìn)行測(cè)定:從手術(shù)結(jié)束6小時(shí)和12小時(shí)后的小鼠中采取腹中產(chǎn)生 的腹水，將其放入LB Plate中培養(yǎng)大約18小時(shí)，然后測(cè)定Colony數(shù)量。結(jié)果示于圖11。
[0092]如圖11所示，對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的制備方法制備的實(shí)施例5的傷口敷料使用組來(lái)說(shuō)， 當(dāng)培養(yǎng)手術(shù)結(jié)束6小時(shí)后采取的腹水時(shí)，沒(méi)有生成菌落(colony)，相反地，在CLP試驗(yàn)組中測(cè) 出1.5 X 103cfu/ml。對(duì)于手術(shù)結(jié)束12小時(shí)后的腹水，確認(rèn)到:在Control試驗(yàn)組和CLP試驗(yàn)組 中，分別測(cè)出1.5 X 103cfu/ml和1.5 X 107cfu/ml，相反地，在根據(jù)本發(fā)明的制備方法制備的 實(shí)施例5的傷口敷料使用組中沒(méi)有生成菌落。
[0093]特定結(jié)構(gòu)以及功能性說(shuō)明僅僅是用于說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施例而示例的，本發(fā)明的實(shí) 施例可以以各種形式實(shí)施，應(yīng)當(dāng)理解為包含本發(fā)明的思想和技術(shù)范圍所包含的所有變更、 等同物以及替代物。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于抑制傷口感染和防止粘連的敷料的制備方法，其包括以下步驟： 使用抗生素和透明質(zhì)酸或其鹽來(lái)制備溶液；以及 將所制備的溶液在旋轉(zhuǎn)下進(jìn)行冷凍。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于抑制傷口感染和防止粘連的敷料的制備方法，其中，所述 溶液的pH為4.0~8.0。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于抑制傷口感染和防止粘連的敷料的制備方法，其中，所述 透明質(zhì)酸鹽是至少一種選自透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀、透明質(zhì)酸鈣、透明質(zhì)酸鎂、透明質(zhì)酸 鋅、透明質(zhì)酸鈷和透明質(zhì)酸四丁基銨的透明質(zhì)酸鹽。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于抑制傷口感染和防止粘連的敷料的制備方法，其中，所述 透明質(zhì)酸的分子量為10, 〇〇〇~3，000,000道爾頓。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于抑制傷口感染和防止粘連的敷料的制備方法，其中，所述 透明質(zhì)酸的濃度為〇. 1~5% (w/v)。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于抑制傷口感染和防止粘連的敷料的制備方法，其中，所述 抗生素是至少一種選自頭孢菌素系、β-內(nèi)酰胺系、氨基糖苷系、大環(huán)內(nèi)酯系、喹諾酮系和四 環(huán)素系的抗生素。7. -種用于抑制傷口感染和防止粘連的敷料的制備方法，其包括以下步驟： i) 使用抗生素和透明質(zhì)酸或其鹽來(lái)制備溶液； ii) 將所制備的溶液進(jìn)行冷凍； i i i)將所述冷凍溶液進(jìn)行解凍； iv) 將所述解凍溶液重新進(jìn)行冷凍；以及 v) 將所述重新冷凍的溶液進(jìn)行干燥。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于抑制傷口感染和防止粘連的敷料的制備方法，其中，所述 溶液的pH為4.0~8.0。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于抑制傷口感染和防止粘連的敷料的制備方法，其中，所述 透明質(zhì)酸鹽是至少一種選自透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀、透明質(zhì)酸鈣、透明質(zhì)酸鎂、透明質(zhì)酸 鋅、透明質(zhì)酸鈷和透明質(zhì)酸四丁基銨的透明質(zhì)酸鹽。10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于抑制傷口感染和防止粘連的敷料的制備方法，其中，所 述透明質(zhì)酸的分子量為10, 〇〇〇~3，000,000道爾頓。11. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于抑制傷口感染和防止粘連的敷料的制備方法，其中，所 述透明質(zhì)酸的濃度為〇. 1~5% (w/v)。12. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于抑制傷口感染和防止粘連的敷料的制備方法，其中，所 述抗生素是至少一種選自頭孢菌素系、β-內(nèi)酰胺系、氨基糖苷系、大環(huán)內(nèi)酯系、喹諾酮系和 四環(huán)素系的抗生素。13. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于抑制傷口感染和防止粘連的敷料的制備方法，其中，所 述步驟i i)至i i i)重復(fù)進(jìn)行2~6次。14. 一種用于抑制傷口感染和防止粘連的敷料的制備方法，其包括以下步驟： i)使用抗生素和透明質(zhì)酸或其鹽來(lái)制備溶液； i i)將所制備的溶液低溫放置8小時(shí)以上； i i i)將所述低溫放置的溶液進(jìn)行冷凍；以及 iv)將所述冷凍溶液進(jìn)行干燥。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的用于抑制傷口感染和防止粘連的敷料的制備方法，其中，所 述溶液的pH為4.0~8.0。16. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的用于抑制傷口感染和防止粘連的敷料的制備方法，其中，所 述透明質(zhì)酸鹽是至少一種選自透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀、透明質(zhì)酸鈣、透明質(zhì)酸鎂、透明質(zhì) 酸鋅、透明質(zhì)酸鈷和透明質(zhì)酸四丁基銨的透明質(zhì)酸鹽。17. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的用于抑制傷口感染和防止粘連的敷料的制備方法，其中，所 述透明質(zhì)酸的分子量為10, 〇〇〇~3，000,000道爾頓。18. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的用于抑制傷口感染和防止粘連的敷料的制備方法，其中，所 述透明質(zhì)酸的濃度為〇. 1~5% (w/v)。19. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的用于抑制傷口感染和防止粘連的敷料的制備方法，其中，所 述抗生素是至少一種選自頭孢菌素系、β-內(nèi)酰胺系、氨基糖苷系、大環(huán)內(nèi)酯系、喹諾酮系和 四環(huán)素系的抗生素。20. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的用于抑制傷口感染和防止粘連的敷料的制備方法，其中，所 述低溫為0~l〇°C。
【文檔編號(hào)】A61L31/04GK106068133SQ201680000369
【公開(kāi)日】2016年11月2日
【申請(qǐng)日】2016年1月22日
【發(fā)明人】柳廷熙
【申請(qǐng)人】株式會(huì)社Meditip