專利名稱：水稻rr17啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水稻RR17啟動(dòng)子及其應(yīng)用，尤其涉及一種具有特異表達(dá)啟動(dòng)子 功能的DNA片段及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物的根有兩個(gè)主要的基本功能從土壤中吸收水份、營(yíng)養(yǎng)和固定作用。通過對(duì)擬 南芥模式植物的研究，人們對(duì)調(diào)控?cái)M南芥等雙子葉植物根的遺傳因子有了深入的了解。但 水稻等單子葉植物的根系與擬南芥有著本質(zhì)的區(qū)別。雙子葉植物的生命中起主要作用的是 由胚胎發(fā)育來的主根。而對(duì)于水稻，胚胎發(fā)育來的主根只在早期起到重要的作用，種子發(fā)芽 后的幾個(gè)星期，莖生根將代替胚胎發(fā)育來的主根起主要作用。從起始的機(jī)制來講，莖生根是 胚胎后發(fā)育來的，因此不能通過同源比對(duì)的方式從擬南芥中找到莖生根起始需要的基因。細(xì)胞分裂素是植物的五大經(jīng)典激素之一，它調(diào)控了植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)方面。 主要通過對(duì)模式植物擬南芥的研究，對(duì)細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑已有了部分了解。細(xì) 胞分裂素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是由一種類似于細(xì)菌和酵母中的雙元組份系統(tǒng)(two-component system)介導(dǎo)的，這個(gè)系統(tǒng)包括組氨酸激酶(Histidine Kinases, HKs)，磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (Histidine-Phosphotransfer proteins, HPs)禾口反應(yīng)調(diào)節(jié)因子(Response Regulators, RRs)。在模式植物擬南芥中，ARR(Arabidopsis Response Regulators)是雙元組分系統(tǒng) 的最下游因子，也是其主要功能行使元件。現(xiàn)在已知的擬南芥ARR基因共有24個(gè)。根據(jù) 它們序列的相似程度，功能結(jié)構(gòu)域以及對(duì)細(xì)胞分裂素的反應(yīng)，可以將ARR大致分為三類即 A 型(10 個(gè)，包括 ARR3-ARR9, ARR15-ARR17)、B 型(12 個(gè)，包括 ARRl，ARR2, ARR10-ARR14， ARR18-ARR21 和 ARR23)以及非典型的 ARR22 和 ARR24。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有特異表達(dá)啟動(dòng)子功能的DNA片段及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的DNA片段(OsRRl7基因啟動(dòng)子OsRRl7p)，來源于水稻(Oryza sativaL. japonica. cv Nipponbare)，為如下 1)-3)中任一所述的 DNA 分子1)序列表的序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)所述DNA序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；3)與1)中所述DNA序列具有90%以上同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子。序 列1由2455個(gè)核苷酸組成。上述嚴(yán)格條件可為在6 X SSC, 0. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2 X SSC, 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。含有以上任一所述DNA片段的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于 本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組載體具體為將0SRR17P插入在pC1300-GUS_N0S的PstI和SalI識(shí)別位 點(diǎn)間獲得的重組載體，所述PC1300-GUS-N0S為將pBI121經(jīng)SmaI和EcoRI酶切后得到的小片段插入PCAMBIA1300雙元載體的SmaI和EcoRI識(shí)別位點(diǎn)得到的載體。擴(kuò)增以上任一所述DNA片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述引物對(duì)中的一條引物的序列為序列2，另一條引物的序列為序列3。上述DNA片段在使目的基因在植物莖基部節(jié)中的表達(dá)中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù) 的范圍。上述應(yīng)用中，所述植物莖基部節(jié)為莖生根的起始部位。上述應(yīng)用中，所述植物為單子葉植物。上述應(yīng)用中，所述單子葉植物為水稻。上述DNA片段在植物的遺傳育種中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述植物為單子葉植物；所述單子葉植物優(yōu)選為水稻。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，0sRR17基因啟動(dòng)子0sRR17p可以在水稻莖生根起始特異性表 達(dá)，可以用來研究及改善植物根系的發(fā)育和對(duì)不同土壤環(huán)境的適應(yīng)，最終達(dá)到提高產(chǎn)量的 目的。對(duì)于一些易倒伏的水稻品種，也可以用莖生根特異性表達(dá)的啟動(dòng)子來調(diào)控抗倒伏基 因的表達(dá)，增加水稻的抗倒伏能力，然而對(duì)水稻的葉片和種子品質(zhì)沒有影響。啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn) 和其表達(dá)模式及功能的闡明，在植物發(fā)育調(diào)控和生物技術(shù)育種中均具有重要意義，為今后 在植物莖基部節(jié)中特異性表達(dá)外源基因提供了新型有效的啟動(dòng)子或順式元件。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明細(xì)胞分裂素抑制了莖生根的起始，由于A型ARR基因家族 的功能特異性可能決定了細(xì)胞分裂素調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育信號(hào)途徑的專一性，因此通過檢測(cè) 水稻細(xì)胞分裂素反應(yīng)調(diào)節(jié)因子OsRR的時(shí)空表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)0sRR17是水稻莖基部節(jié)特異表 達(dá)的基因，因此從水稻中克隆出0sRR17基因的啟動(dòng)子，并通過⑶S報(bào)告基因檢測(cè)了該啟動(dòng) 子的時(shí)空表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子在水稻莖生根起始的部位(即莖基部節(jié))特異性表達(dá)，因 此該啟動(dòng)子將為植物代謝的精細(xì)調(diào)控和生物工程提供強(qiáng)有力的工具，具有重要的理論及現(xiàn)
眉、ο


圖1為細(xì)胞分裂素抑制莖生根的起始圖 2 為 OsRRl7 的 RT-PCR 結(jié)果圖 3 為 pC1300_0SRR17p: GUS-NOS 質(zhì)粒圖譜圖4為0sRR17p: :GUS轉(zhuǎn)基因植物的GUS活性
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。在本發(fā)明的實(shí)施例中所用到的材料包括大腸桿菌(Escherichia coli)株系 DH5a ；農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株 EAH105 ；克隆載體 pGEM-T Easy 和連接 酶(Promega)；限制性內(nèi)切酶(NEW ENGLAND BioLabs)；質(zhì)粒 pBI121 (Clontech)，雙元載體 pCAMBIA 1300 (Cambia,在T-DNA左右邊界區(qū)內(nèi)帶有可供植物選擇用潮霉素抗性基因)；水 fSnnft H^Hh (Oryza sativa L. japonica. cv Nipponbare)。實(shí)施例1、轉(zhuǎn)0sRR17p水稻的構(gòu)建
1、細(xì)胞分裂素抑制水稻莖生根的起始/K禾S 品禾中日本晴(Oryza sativa L. japonica. cv Nipponbare ；Fang J. , Chai C. , Qian Q. , Li C. , Tang J. , Sun L. , Huang Ζ. , Guo Χ. , Sun C. , Liu Μ. , Zhang Y. , Lu Q. , Wang Y. , Lu, C, Han B. , Chen F. , Cheng Ζ. , Chu C. (2008)Mutations of genes in synthesis of the carotenoid precursors of ABA lead to preharvest sprouting and photo-oxidation in rice,Plant Journal, 54 177-189.公眾可從中國(guó)科院遺傳與發(fā)育生 物學(xué)研究所獲得。)用20%漂白水滅菌20分鐘后，用無(wú)菌水沖洗3遍。然后在含有蔗 糖的V2MS培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich公司，Cat# :M5524)上發(fā)芽，植物生長(zhǎng)條件為28°C，連 續(xù)光照，光照強(qiáng)度為80-120陽(yáng)ol ·πΓ2. sec—1。4天后觀察莖生根的生長(zhǎng)(圖1A)。通過解剖 發(fā)現(xiàn)莖生根起始于莖基部的節(jié)(Basal node)(圖IB)。當(dāng)外源施加1 μ M的6-ΒΑ (—種常用 的人工合成細(xì)胞分裂素)，可見的莖生根明顯減少(圖1C)，在含有5μΜ 6-ΒΑ的V2MS培 養(yǎng)基上，完全觀察不到莖生根(圖1D)。為了檢測(cè)細(xì)胞分裂素是否抑制了莖生根的起始，對(duì) 莖基部做了半薄切片。在沒有細(xì)胞分裂素處理的水稻中，能夠清晰可見莖生根的起始(圖 IF和G中的紅色箭頭)，然而5 μ M細(xì)胞分裂素處理后，完全沒有莖生根的起始(圖1Η、I和 J)。圖1為細(xì)胞分裂素抑制莖生根的起始，其中解剖圖片中的標(biāo)尺為0. 5mm，半薄切片中的 標(biāo)尺為100 μ m。半薄切片水稻的莖基部固定在含有4%戊二醛的PBS過夜，用Leica historesin 包埋后，使用Leica RM6625切片機(jī)得到4 μ m的半薄切片，然后通過甲苯胺蘭(0. 1% w/v) 染色，在光學(xué)顯微鏡(Olympus BX51)下觀察。2、篩選在莖基部節(jié)中特異表達(dá)的細(xì)胞分裂素反應(yīng)調(diào)節(jié)因子OsRR引物序列NameIDPrimer sequenceOsRRl7-F L0C_0s04g28120 AGTTCCTCGAAGCTGCAAGAGTGAOsRRl7-RL0C_0s04g28120 AGGCACTACATGACCATCACCACTRNA 提取TRIzol法參照廠商(Invitrogen)提供的使用說明進(jìn)行。首先預(yù)冷研缽、研杵、 1. 5ml離心管和TRIzoI試劑。分別取水稻品種日本晴葉子、主根、側(cè)根和莖基部節(jié)組織各 lOOmg，用液氮快速粉碎，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管。加入Iml TRIzol試劑，振蕩混勻。室溫放置 5分鐘，4°C 12000g離心10分鐘。取上清移入新離心管，加入200μ 1氯仿，輕搖混勻。室溫 放置3分鐘，4°C 12000g離心10分鐘。取上層水相移入新管，加入250 μ 1異丙醇和250 μ 1 高鹽沉淀劑(0. 8Μ檸檬酸鈉，1. 2Μ氯化鈉)，室溫放置3分鐘，4°C 12000g離心10分鐘，去除 上清。沉淀用Iml 75%乙醇洗滌，4°C 7500g離心5分鐘，去除上清。沉淀于室溫干燥5_10 分鐘，加入適量(50 μ 1左右)DEPC水溶解(為了有利于RNA溶解，可置于50°C水浴10-30 分鐘)獲得RNA。cDNA 反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈的合成(1)取上述提取的RNA 1-2 μ g,加DEPC水至10 μ 1 ；(2)加入 1 μ 1 (0. 5g) Oligo (dT) 15 禾口 1 μ 1 IOmM dNTP,混勻；(3)65 °C，5分鐘，然后放在冰上，快速加入5Xbuffer 4 μ 1，RNAseinhibitor 1 μ 1,0. IM DTT 2μ l,5U/y 1 反轉(zhuǎn)錄酶 H 0. 5 μ 1 ；(4)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(cDNA第一鏈合成)在PCR儀上進(jìn)行，使用如下程序先42°C，50 分鐘；再 45°C，10 分鐘；再 50°C，10 分鐘；再 70°C，15 分鐘；(5)反應(yīng)結(jié)束之后快速取出，冰上加入10mg/ml 1μ 1 RNase，然后在37°C放置 30-60分鐘，獲得cDNA。PCR 擴(kuò)增PCR 反應(yīng)體系(20μ 1)模板 DNA 1 μ 1 ； 10Xbuffer 2μ 1 ；2. 5mM dNTP 2μ 1 ； 10 μ M primers 2 μ 1 ；超純水 12. 8μ 1 ； 5U/y 1 Taq DNA 聚合酶 0· 2 μ 1。PCR擴(kuò)增程序?yàn)橄?4°C預(yù)變性2min ；再94°C變性30s，58 °C退火30s，72 °C延長(zhǎng) lmin，循環(huán)數(shù)從22到34不等；然后再72°C延長(zhǎng)IOmin ；4°C保存。所用PCR 儀型號(hào)為 Whatman Biometra T Gradient 96 禾口 MJ PTC-200。結(jié)果見圖2，可以看出0SRR17p特異的在莖基部節(jié)中表達(dá)。3、轉(zhuǎn)0SRR17p水稻的獲得提取水稻日本晴幼苗的基因組DNA作為模板，用引物OsRRl7p_F (ctgcagGTGA ATCTCCATCCGTAGTTG,小寫字母為 PstI 酶切位點(diǎn)，序列 2)和 0sRR17p-R (gtcgacGTGTCC TACCCTTTGAGCCA，小寫字母為SalI酶切位點(diǎn)，序列3)PCR擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物連接到 中間載體PGEM-T Easy上，獲得pT_0sRRl7p，經(jīng)測(cè)序，結(jié)果為該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中 序列1的核苷酸，大小為2455bp，該P(yáng)CR產(chǎn)物的基因命名為0sRR17p。同時(shí)，用SmaI和 EcoRI對(duì)pBI121 (Clontech)雙酶切得到的小片段插入pCAMBIA1300 (Cambia)雙元載體 的SmaI和EcoRI識(shí)別位點(diǎn)間得到pC1300-GUS_N0S。然后用PstI和SalI雙酶切上述獲 得的pT-0SRR17p得到的小片段插入pC1300-GUS-N0S的PstI和SalI識(shí)別位點(diǎn)間，得到 pC1300-0SRR17p: :GUS_N0S，其質(zhì)粒結(jié)構(gòu)模式如圖3所示，其中35S_pro指35S CaMV啟動(dòng)子； Nos-ter為NOS終止子；Hygromycin為潮霉素篩選抗性基因；⑶S為E. coli β -葡萄糖苷酸 酶報(bào)告基因。將質(zhì)粒pC1300-0SRR17p ⑶S-N0S 導(dǎo)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) 菌株EAH105 (上海鼎國(guó)生物)中，再進(jìn)行PCR鑒定，引物OsRRl7p_F和OsRRl7p-R，得到 大小為2455bp的片段為含有質(zhì)粒pC1300-0SRR17p: GUS-NOS的農(nóng)桿菌，命名為EAH105/ pC1300-0SRR17p: GUS-NOS ；再將 EAH105/pC1300_0SRR17p GUS-NOS 與野生型日本晴的愈 傷組織在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上28°C共培養(yǎng)2天后，愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有50mg/l的潮霉素抗性篩 選培養(yǎng)基中，28°C暗培養(yǎng)14天后，轉(zhuǎn)到新鮮配制的篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選14天。經(jīng)兩輪篩 選后長(zhǎng)出的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)至含有50mg/l潮霉素的分化培養(yǎng)基上，先暗培養(yǎng)3天，然后轉(zhuǎn) 至15h光照條件下培養(yǎng)，30-40天后分化出小苗。將小苗移到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩周左右移 土繼續(xù)生長(zhǎng)，此轉(zhuǎn)化共獲得5株TO代轉(zhuǎn)0SRR17p:⑶S水稻。以上涉及的培養(yǎng)基配方如下(I)NB基本培養(yǎng)基 (2)水稻愈傷誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)基 (3)共培養(yǎng)培養(yǎng)基 (4)抗性篩選培養(yǎng)基 (5)水稻分化培養(yǎng)基
(6)水稻生根培養(yǎng)基 5、鑒定經(jīng)過抗性篩選，鑒定了 5株陽(yáng)性TO代轉(zhuǎn)0SRR17p:⑶S水稻。然后對(duì)上述獲得的5 株陽(yáng)性 TO 代轉(zhuǎn) 0SRR17p: :GUS 水稻進(jìn)行 PCR 鑒定，引物為 pl300F (5 ‘ATCGGTGCGGGCCTCTTC) 和 0sRR17p-R(5 ‘gtcgacGTGTCCTACCCTTTGAGCCA)，模板為 5 株陽(yáng)性 TO 代轉(zhuǎn) 0SRR17p: :GUS 水稻的葉的基因組DNA，得到PCR產(chǎn)物大小為2575bp為陽(yáng)性植株，又將PCR產(chǎn)物測(cè)序分析， 具有序列表中序列1的核苷酸，因此進(jìn)一步確認(rèn)獲得5株陽(yáng)性TO代轉(zhuǎn)0SRR17p:⑶S水稻。從陽(yáng)性TO代轉(zhuǎn)0SRR17p:⑶S水稻收獲種子，播種后獲得Tl代轉(zhuǎn)0SRR17p:⑶S 水稻，從Tl代轉(zhuǎn)0SRR17P:⑶S水稻上收獲種子，播種后獲得T2代轉(zhuǎn)0SRR17p:⑶S水稻純 合系，從T2代轉(zhuǎn)0SRR17p:⑶S水稻上收獲種子，播種后獲得T3代轉(zhuǎn)0SRR17p:⑶S水稻純 合系。采用同樣的方法將空載體pC1300-GUS-N0S導(dǎo)入野生型日本晴中，獲得TO代轉(zhuǎn)空 載體水稻，用上述同樣的方法獲得T3代轉(zhuǎn)pC1300-GUS-N0S水稻。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)OSRRl7p:⑶S水稻⑶S染色分析⑶S染色把10天大小的日本晴和編號(hào)為5的T3代轉(zhuǎn)0SRR17p:⑶S水稻純合株 系的整個(gè)幼苗浸泡在⑶S染色液中37°C放置6-12小時(shí)，70%乙醇脫色后用體視鏡(Olympus SZX12)進(jìn)行拍照。以T3代轉(zhuǎn)pC1300-GUS-N0S水稻水稻和野生型日本晴為對(duì)照。GUS 染色液IOOmM 磷酸緩沖液(pH 7. 0)，IOmM EDTA, ImM K4Fe6, ImM K3 (FeCN)6, 0. 1% (v/v) Triton X-100, ImM X-gluc。
結(jié)果如圖4所示，通過對(duì)10天大小的T3代轉(zhuǎn)0SRR17p:⑶S水稻的⑶S染色發(fā)現(xiàn)， 只有莖基部節(jié)能被GUS染色(圖4A和B)；進(jìn)一步徒手解剖發(fā)現(xiàn)GUS染色主要在節(jié)的下部， 即莖生根起始的部位(圖4C)；當(dāng)從節(jié)上分離一個(gè)莖生根時(shí)，分離下來莖生根起始部位是能 被⑶S染色的(圖4D)。圖4為轉(zhuǎn)0sRR17p: :GUS植物的⑶S活性，其中箭頭表示有⑶S活 性的部位。圖中白色標(biāo)尺為1mm。對(duì)野生型日本晴⑶S染色發(fā)現(xiàn)，植株各個(gè)組織器官均不能被⑶S染色。綜合以上的結(jié)果，說明0sRR17的啟動(dòng)子能特異的在莖生根起始的部位中表達(dá)，并 調(diào)控了根的發(fā)育。實(shí)施例3、0sRR17啟動(dòng)子順式作用元件的分析為了更好的了解OsRRl7的啟動(dòng)子功能，將OsRRl7的啟動(dòng)子OsRRl7p在PLACE (aDatabase of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements) ±JJ ζ#fflW析。表2 :0sRR17啟動(dòng)子順式作用元件。

權(quán)利要求
DNA片段，為如下1) 3)中任一所述的DNA分子1)序列表的序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)所述DNA序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；3)與1)中所述DNA序列具有90％以上同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子。
2.含有權(quán)利要求1中所述DNA片段的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
3.擴(kuò)增權(quán)利要求1中所述DNA片段的引物對(duì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的引物對(duì)，其特征在于所述引物對(duì)中的一條引物的序列為序 列2，另一條引物的序列為序列3。
5.權(quán)利要求1所述DNA片段在使目的基因在植物莖基部節(jié)中的表達(dá)中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5中所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物莖基部節(jié)為莖生根的起始部位。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6中所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為單子葉植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述單子葉植物為水稻。
9.權(quán)利要求1中所述DNA片段在植物的遺傳育種中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為單子葉植物；所述單子葉植 物優(yōu)選為水稻。全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻RR17啟動(dòng)子及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的DNA片段，為如下1)-3)中任一所述的DNA分子1)序列表的序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)所述DNA序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；3)與1)所述DNA序列具有90％以上同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，OsRR17基因啟動(dòng)子OsRR17p可以在水稻莖生根起始特異性表達(dá)可以用來研究及改善植物根系的發(fā)育和對(duì)不同土壤環(huán)境的適應(yīng)，最終達(dá)到提高產(chǎn)量的目的。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101899442SQ20101023015
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月13日
發(fā)明者左建儒, 張健, 梁巖, 謝慶軍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所