用于蛋白質(zhì)表達(dá)的酵母啟動子的制作方法
【專利說明】用于蛋白質(zhì)表達(dá)的酵母啟動子
[0001] 與相關(guān)申請的交叉引用 本申請要求于2013年3月8日提交的美國臨時申請序列號61/775,029的優(yōu)先權(quán)，該 臨時申請通過引用結(jié)合到本文中。
[0002] 公開內(nèi)容領(lǐng)域 本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)和多肽的分離核酸、表達(dá)方法、宿主細(xì)胞、表達(dá)載體和DNA構(gòu)建體，并且涉及使用所述表達(dá)方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)和多肽。更特別地，本發(fā)明涉及從巴斯德 畢赤酵母分離的核酸，其中所述核酸具有啟動子活性。本發(fā)明還涉及 用于使用巴斯德畢赤酵母啟動子生產(chǎn)蛋白質(zhì)和多肽的表達(dá)方法、宿主細(xì)胞、表達(dá)載體和DNA 構(gòu)建體，并涉及使用所述表達(dá)方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)和多肽。
[0003] 發(fā)明背景和概述 酵母表達(dá)系統(tǒng)可用于有效地生產(chǎn)蛋白質(zhì)，例如酶、激素和疫苗蛋白質(zhì)，部分上是因?yàn)橐?些酵母迅速生產(chǎn)至高細(xì)胞密度，在簡單和廉價的介質(zhì)中生長，并且為真核生物因此可以以 與哺乳動物中天然蛋白質(zhì)相似的方式修飾蛋白質(zhì)。此外，用合適的信號序列，表達(dá)的蛋白質(zhì) 可被分泌入培養(yǎng)基中以方便分離和純化。一些酵母表達(dá)系統(tǒng)還為食品和制藥工業(yè)所接受， 因?yàn)槠鋵τ谒幬锖褪澄锂a(chǎn)品的生產(chǎn)是安全的，不像真菌和細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)，它們可能在一些 情況下，例如，對人食品制造，是不安全的。
[0004] 因此，開發(fā)或改善可用于表達(dá)高水平蛋白質(zhì)以增加產(chǎn)率、減少蛋白質(zhì)分離和純化 費(fèi)用以及降低人和動物健康產(chǎn)品和食物產(chǎn)品的成本的酵母表達(dá)系統(tǒng)，對多種工業(yè)，例如食 品和動物飼料工業(yè)、人和動物健康工業(yè)等是有益的。
[0005] 已經(jīng)開發(fā)了多種類型的酵母表達(dá)系統(tǒng)，包括使用編碼同源或異源蛋白質(zhì)的核酸在 酵母啟動子控制下的誘導(dǎo)性或組成型蛋白質(zhì)表達(dá)。啟動子為連接編碼蛋白質(zhì)的核酸的5' 末端的調(diào)節(jié)元件，并且可與宿主細(xì)胞（例如，酵母宿主細(xì)胞）中的多種調(diào)節(jié)因子相互作用以 控制RNA從DNA轉(zhuǎn)錄。啟動子還可控制RNA從DNA轉(zhuǎn)錄的時間。例如，在酵母菌巴斯德畢 赤酵母中已經(jīng)鑒定出Α0Χ1啟動子，并通常用于酵母表達(dá)系統(tǒng)中，因?yàn)槠錇榫o密調(diào)節(jié)的強(qiáng)啟 動子。
[0006] 由于酵母表達(dá)系統(tǒng)對多種工業(yè)，包括人類制藥工業(yè)以及人食品和動物飼料工業(yè)的 重要性，酵母表達(dá)系統(tǒng)的改善為許多研究和開發(fā)的焦點(diǎn)。因此，本發(fā)明人從巴斯德畢赤酵母 中鑒定了對用于蛋白質(zhì)在酵母中表達(dá)特別有效的啟動子。本文所述啟動子可用在，例如，甲 醇-誘導(dǎo)性酵母表達(dá)系統(tǒng)中或用在用于蛋白質(zhì)組成型表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)中。
[0007] 在本發(fā)明一個說明性實(shí)施方案中，提供了一種分離核酸，其中所述分離核酸的序 列包含，例如，與選自如本文所述的SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDΝ0:4、 SEQIDN0:5和SEQID勵:6的序列具有至少90%、95%或98%同一性，或與其片段具有至 少90%、95%或98%同一性的序列，其中所述分離核酸包含甲醇-誘導(dǎo)性的巴斯德畢赤酵母 啟動子序列。在其它實(shí)施方案中，提供包含這些啟動子序列的表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和DNA構(gòu) 建體。
[0008] 在另一個實(shí)施方案中，提供使用這些啟動子序列生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法。所述方法包 括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有包含任何上述啟動子序列與編碼蛋白質(zhì)的異源編碼序列操作性連 接的第一個表達(dá)盒的宿主細(xì)胞的步驟，其中所述培養(yǎng)在允許該蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下進(jìn)行。 在另一個說明性實(shí)施方案中，提供根據(jù)該方法生產(chǎn)的分離蛋白質(zhì)。
[0009] 在本發(fā)明的一個說明性實(shí)施方案中，提供一種分離核酸，其中所述分離核酸的 序列包含，例如，與選自如本文所述的SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQID N0:10、SEQIDN0:11、SEQIDN0:12、SEQIDN0:13和SEQIDN0:14的序列具有至少90%、 95%或98%同一性，或與其片段具有至少90%、95%或98%同一性的序列，其中所述分離核酸 包含組成型巴斯德畢赤酵母啟動子序列。在其它實(shí)施方案中，提供包含這些啟動子序列的 表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和DNA構(gòu)建體。
[0010] 在另一個實(shí)施方案中，提供使用這些啟動子序列生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法。所述方法包 括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有包含任何上述啟動子序列與編碼蛋白質(zhì)的異源編碼序列操作性連 接的第一個表達(dá)盒的宿主細(xì)胞的步驟，其中所述培養(yǎng)在允許該蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下進(jìn)行。 在另一個說明性實(shí)施方案中，提供根據(jù)該方法生產(chǎn)的分離蛋白質(zhì)。
[0011] 下列條款清單中描述的所有實(shí)施方案也被考慮為按照本發(fā)明使用。對于下列條款 中所述的所有實(shí)施方案，認(rèn)為實(shí)施方案的任何可應(yīng)用的組合均與本發(fā)明一致。
[0012] 1. -種分離核酸，其中所述分離核酸的序列包含與選自SEQIDN0:1、SEQID N0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5 和SEQIDN0:6 的序列具有至少 90% 同一 性，或與其片段具有至少90%同一性的序列，其中所述分離核酸包含甲醇-誘導(dǎo)性巴斯德畢 赤酵母啟動子序列。
[0013] 2.條款1的分離核酸，其中所述分離核酸的序列與選自SEQIDN0:1、SEQID N0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5 和SEQIDN0:6 的序列具有至少 95% 同一 性，或與其片段具有至少95%同一性。
[0014] 3.條款1的分離核酸，其中所述分離核酸的序列與選自SEQIDN0:1、SEQID N0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5 和SEQIDN0:6 的序列具有至少 98% 同一 性，或與其片段具有至少98%同一性。
[0015] 4.條款1的分離核酸序列，其中所述分離核酸的序列為選自SEQIDN0:1、SEQID N0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5 和SEQIDN0:6 的序列，或其片段。
[0016] 5.條款1-4中任一項(xiàng)的分離核酸，與異源編碼序列操作性連接。
[0017] 6.條款5的分離核酸，其中所述異源編碼序列編碼選自毒素、抗體、激素、酶、生 長因子、細(xì)胞因子、結(jié)構(gòu)蛋白、免疫原性蛋白和細(xì)胞信號傳導(dǎo)蛋白的蛋白質(zhì)。
[0018] 7.條款6的分離核酸，其中所述蛋白質(zhì)為用于動物飼料的酶。
[0019] 8.條款7的分離核酸，其中所述蛋白質(zhì)選自植酸酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、淀 粉酶、葡聚糖酶、蛋白酶、纖維素酶和木聚糖酶。
[0020] 9.條款8的分離核酸，其中所述蛋白質(zhì)為植酸酶。
[0021] 10.條款8的分離核酸，其中所述蛋白質(zhì)為半乳糖苷酶。
[0022] 11.包含條款1-10中任一項(xiàng)的分離核酸的表達(dá)載體。
[0023] 12.包含條款11的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0024] 13.包含條款1-10中任一項(xiàng)的分離核酸的宿主細(xì)胞。
[0025] 14.條款12或13中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母屬物種。
[0026] 15.條款14的宿主細(xì)胞，其中所述畢赤酵母屬物種為巴斯德畢赤酵母。
[0027] 16.包含條款1-10中任一項(xiàng)的分離核酸的DNA構(gòu)建體。
[0028] 17.生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括步驟 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有包含條款1-4中任一項(xiàng)的分離核酸與編碼蛋白質(zhì)的異源編碼序 列操作性連接的第一個表達(dá)盒的宿主細(xì)胞，其中所述培養(yǎng)在允許該蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下進(jìn) 行。
[0029] 18.條款17的方法，其中所述蛋白質(zhì)選自毒素、抗體、激素、酶、生長因子、細(xì)胞因 子、結(jié)構(gòu)蛋白、免疫原性蛋白和細(xì)胞信號傳導(dǎo)蛋白。
[0030] 19.條款18的方法，其中所述蛋白質(zhì)為用于動物飼料的酶。
[0031] 20.條款19的方法，其中所述蛋白質(zhì)選自植酸酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、淀粉 酶、葡聚糖酶、纖維素酶、蛋白酶和木聚糖酶。
[0032] 21.條款20的方法，其中所述蛋白質(zhì)為植酸酶。
[0033] 22.條款20的方法，其中所述蛋白質(zhì)為半乳糖苷酶。
[0034] 23.條款17-22中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白質(zhì)使用第一個表達(dá)盒與第二個表 達(dá)盒組合表達(dá)。
[0035] 24.條款23的方法，其中所述第二個表達(dá)盒包含編碼蛋白質(zhì)的異源編碼序列與 具有包含SEQIDN0:15或SEQIDN0:16的序列或任何其它A0X1或A0X2啟動子序列的序 列的分離核酸操作性連接，其中SEQIDN0:15和SEQIDN0:16具有啟動子活性。
[0036] 25.條款24的方法，其中所述蛋白質(zhì)使用第一個表達(dá)盒、第二個表達(dá)盒和第三個 表達(dá)盒表達(dá)。
[0037] 26.條款25的方法，其中所述第三個表達(dá)盒包含編碼蛋白質(zhì)的異源編碼序列與 具有與選自SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5 和SEQ IDNO: 6的序列具有至少90%同一"性，或與其片段具有至少90%同一"性的序列的分離核酸操 作性連接。
[0038] 27.條款23的方法，其中所述第二個表達(dá)盒包含編碼蛋白質(zhì)的異源編碼序列與 具有與選自SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5 和SEQ IDNO: 6的序列具有至少90%同一"性，或與其片段具有至少90%同一"性的序列的分離核酸操 作性連接。
[0039] 28.根據(jù)條款17-27中任一項(xiàng)的方法生產(chǎn)的分離蛋白質(zhì)。
[0040] 29. -種分離核酸，其中所述分離核酸的序列包含與選自SEQIDN0:7、SEQID N0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:11、SEQIDN0:12、SEQIDN0:13和SEQID NO: 14的序列具有至少90%同一性，或與其片段具有至少90%同一性的序列，其中所述核酸 包含組成型巴斯德畢赤酵母啟動子的序列。
[0041] 30.條款29的分離核酸，其中所述分離核酸的序列與選自SEQIDN0:7、SEQID N0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:11、SEQIDN0:12、SEQIDN0:13和SEQID NO: 14的序列具有至少95%同一性，或與其片段具有至少95%同一性。
[0042] 31.條款29的分離核酸，其中所述分離核酸的序列與選自SEQIDN0:7、SEQID N0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:11、SEQIDN0:12、SEQIDN0:13和SEQID NO: 14的序列具有至少98%同一性，或與其片段具有至少98%同一性。
[0043] 32.條款29的分離核酸序列，其中所述分離核酸的序列為選自SEQIDN0:7、SEQ IDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:11、SEQIDN0:12、SEQIDN0:13和SEQ IDNO: 14的序列，或其片段。
[0044] 33.條款29-32中任一項(xiàng)的分離核酸，與異源編碼序列操作性連接。
[0045] 34.條款33的分離核酸，其中所述異源編碼序列編碼選自毒素、抗體、激素、酶、 生長因子、細(xì)胞因子、結(jié)構(gòu)蛋白、免疫原性蛋白和細(xì)胞信號傳導(dǎo)蛋白的蛋白質(zhì)。
[0046] 35.條款34的分離核酸，其中所述蛋白質(zhì)為用于動物飼料的酶。
[0047] 36.條款35的分離核酸，其中所述蛋白質(zhì)選自植酸酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、 淀粉酶、葡聚糖酶、纖維素酶、蛋白酶和木聚糖酶。
[0048] 37.條款36的分離核酸，其中所述蛋白質(zhì)為植酸酶。
[0049] 38.條款36的分離核酸，其中所述蛋白質(zhì)為半乳糖苷酶。
[0050] 39.包含條款29-38中任一項(xiàng)的分離核酸的表達(dá)載體。
[0051] 40.包含條款39的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0052] 41.包含條款29-38中任一項(xiàng)的分離核酸的宿主細(xì)胞。
[0053] 42.條款40或41中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母屬物種。
[0054] 43.條款42的宿主細(xì)胞，其中所述畢赤酵母屬物種為巴斯德畢赤酵母。
[0055] 44.包含條款29-38中任一項(xiàng)的分離核酸的DNA構(gòu)建體。
[0056] 45.生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有包含條款29-38中任 一項(xiàng)的分離核酸與編碼蛋白質(zhì)的異源編碼序列操作性連接的第一個表達(dá)盒的宿主細(xì)胞的 步驟，其中所述培養(yǎng)在允許該蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下進(jìn)行。
[0057] 46.條款45的方法，其中所述蛋白質(zhì)選自毒素、抗體、激素、酶、生長因子、細(xì)胞因 子、結(jié)構(gòu)蛋白、免疫原性蛋白和細(xì)胞信號傳導(dǎo)蛋白。
[0058] 47.條款46的方法，其中所述蛋白質(zhì)為用于動物飼料的酶。
[0059] 48.條款47的方法，其中所述蛋白質(zhì)選自植酸酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶、淀粉 酶、葡聚糖酶、纖維素酶、蛋白酶和木聚糖酶。
[0060] 49.條款48的方法，其中所述蛋白質(zhì)為植酸酶。
[0061] 50.條款48的方法，其中所述蛋白質(zhì)為半乳糖苷酶。
[0062] 51.條款45-50中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白質(zhì)使用第一個表達(dá)盒與第二個表 達(dá)盒組合表達(dá)。
[0063] 52.條款51的方法，其中所述第二個表達(dá)盒包含編碼蛋白質(zhì)的異源編碼序列與 具有包含SEQIDN0:15或SEQIDN0:16的序列或任何其它A0X1或A0X2啟動子序列的序 列的分離核酸操作性連接，其中SEQIDN0:15和SEQIDN0:16具有啟動子活性。
[0064] 53.條款51的方法，其中所述蛋白質(zhì)使用第一個表達(dá)盒、第二個表達(dá)盒和第三個 表達(dá)盒表達(dá)。
[0065] 54.條款53的方法，其中所述第三個表達(dá)盒包含編碼蛋白質(zhì)的異源編碼序列與 具有與選自SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:11、SEQ IDNO: 12、SEQIDNO: 13的序列具有至少90%同一性，或與其片段具有至少90%同一性的 序列的分離核酸操作性連接。
[0066] 55.條款51的方法，其中所述第二個表達(dá)盒包含編碼蛋白質(zhì)的異源編碼序列與 具有與選自SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:11、SEQ IDNO: 12、SEQIDNO: 13的序列具有至少90%同一性，或與其片段具有至少90%同一性的 序列的分離核酸操作性連接。
[0067] 56.根據(jù)條款45-55中任一項(xiàng)的方法生產(chǎn)的分離蛋白質(zhì)。
[0068] 57.條款40或41中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞選自漢遜酵母屬 物種、畢赤酵母屬（/YcAia)物種、酵母菌屬物種、裂殖 酵母屬（物種、有孢圓酵母屬（物種、假絲酵母屬 物種、耶氏酵母屬（/arroria)物種和克魯維酵母屬物種。 [0069] 58.包含條款44的DNA構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞選自漢遜酵母屬 物種、畢赤酵母屬物種、酵母菌屬物種、裂殖