一種與橡膠樹干膠產量相關的snp標記及其應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與橡膠樹干膠產量相關的SNP標記及其應用。其中，該SNP標記為SEQIDNO：1所示核苷酸序列自5’端起第120bp位點處的堿基為C或A。本發(fā)明的SNP標記與橡膠樹的干膠產量緊密相關，能夠有效用于橡膠樹的分子標記輔助育種。
【專利說明】
一種與橡膠樹干膠產量相關的SNP標記及其應用
技術領域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種SNP標記及其應用，尤其涉及一種與橡膠樹干膠產量相關的SNP標 記及其應用。
【背景技術】
[0002] 橡膠樹是一種在世界經濟和軍事發(fā)展中扮演重要角色的熱帶樹種，其生產的天然 橡膠樹是一種重要的工業(yè)原料和戰(zhàn)略物資。目前，中國適宜種植橡膠的面積有限，實際種植 面積已達極限，已經沒有擴大種植面積來增加產量的空間，大幅度提高橡膠樹單位面積產 量是一條適合中國橡膠事業(yè)發(fā)展和緩解天然橡膠供需矛盾壓力的可行性途徑。
[0003] 橡膠樹雜交育種一直是產量育種的常規(guī)方法，然而常規(guī)育種周期長，以及種質資 源的匱乏，均制約橡膠樹良種培育和產業(yè)發(fā)展。隨著現代分子生物技術的發(fā)展，分子標記輔 助選擇育種能在一定程度上解決上述問題，推動橡膠樹育種進程。分子標記輔助選擇育種， 即分子育種，是傳統(tǒng)遺傳育種與現代分子生物學有機結合的育種方法，利用DNA分子標記對 育種材料進行選擇，綜合改良選育物種的重要經濟性狀。近年來，橡膠樹分子標記開發(fā)和利 用工作已取得了一定進展，但遠不能滿足橡膠樹分子育種的需求。
[0004] 現階段還有待挖掘有效的橡膠樹干膠產量性狀相關的分子標記，以實現早期產量 選種和提高產量育種準確性，從而取得更大產量育種及遺傳進展。
【發(fā)明內容】
[0005] 本發(fā)明在于克服現有技術中的不足，提供一種與橡膠樹干膠產量相關的，能夠有 效用于橡膠樹選育的SNP標記及其應用等。
[0006] 其中，SNP(singlenucleotidepolymorphism，SNP，即單核苷酸多態(tài)性）是1996年由 美國麻省理工學院的人類基因組研究中心學者Lander提出的一類分子遺傳標記，主要是指 基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP表現出的多態(tài)性僅涉及到 單個堿基的變異，表現是有轉換、顛換、插入和缺失等。
[0007] 本發(fā)明的第一個方面是提供一種與橡膠樹干膠產量相關的SNP標記，其特征在于， 所述SNP標記的序列如SEQIDN0:1所示，所述SEQIDN0:1所示序列自5'端起第120bp位點處的 堿基是C或A。根據本發(fā)明，SEQIDN0:1所示核苷酸序列如下：
[0008] AGTTATCATAATGGAGGATCTTGGCCAGGTTTGTCCATTTTCTCTCTCTATTTAAACTGAATATCTCTCTATTAATA TGATGTTCATGCCGTTAGGATAGCATTCCTGTCATGTTTCACXAGAGGTCTTAGAACATTATTTGGTGTTATTTTGT TGAATAGAGGCTATTGATGAATTATACATAAAATTTATTGTATTCAGCCTAGTTATACCCTAGACA(SEQIDNO： 1)〇
[0009]發(fā)明人發(fā)現，該SNP標記的位點處基因型為雜合CA的橡膠樹的干膠產量顯著高于 此處基因型為純合CC和純合AA的橡膠樹。進而，根據本發(fā)明，通過檢測橡膠樹的上述SNPJg 夠有效地確定其干膠產量性狀，具體地，如前所述，該SNP位點基因型為雜合CA的橡膠樹的 干膠產量顯著高于此處基因型為純合CC和純合AA的橡膠樹，例如該SNP位點的基因型為雜 合CA時，則能夠確定待測橡膠樹的屬于干膠產量高的個體。由此，發(fā)明人確定，本發(fā)明的SNP 標記與橡膠樹的干膠產量性狀緊密相關，能夠有效用于橡膠樹的分子標記輔助育種。進而 能夠根據實際育種需求對橡膠樹育種材料進行早期選擇，進一步能夠有效提高育種的效率 和準確性，提高橡膠樹繁殖群體的遺傳水平，從而能夠準確、高效地選育出橡膠樹優(yōu)良品 種。此外，利用本發(fā)明的SNP標記進行橡膠樹分子標記輔助育種，具有早期篩選、節(jié)省時間、 成本低廉、準確性高的優(yōu)點。
[0010] 本發(fā)明的第二個方面是提供一種用于檢測本發(fā)明第一個方面所述的SNP標記的引 物對，所述引物對具有SEQIDN0:2和SEQIDN0:3所示的核苷酸序列。具體地，所述引物對的序 列如下所示：
[0011] 上游引物:AGTTATCATAATGGAGGATCTTGGCC(SEQIDN0:2) ;
[0012] 下游引物：TGTCTAGGGTATAACTAGGCTGAATACAAT(SEQIDN0 :3)。
[0013] 根據本發(fā)明，利用本發(fā)明的引物對能夠有效地對待測橡膠樹的上述與干膠產量性 狀相關的SNP標記所在的片段進行PCR擴增，進而通過測序能夠有效實現對該SNP標記的檢 測，確定待測橡膠樹該SNP標記位點的基因型，進而能夠有效確定待測橡膠樹的干膠產量性 狀。具體地，該SNP標記位點處基因型為雜合CA的橡膠樹的干膠產量顯著高于此處基因型為 純合CC和純合AA的橡膠樹，例如該SNP位點的基因型為雜合CA時，則能夠確定待測橡膠樹的 屬于干膠產量高的個體。由此，用檢測前面所述的本發(fā)明的SNP標記的引物對，能夠有效用 于橡膠樹的分子標記輔助育種，進而能夠輔助早期實現短時間、低成本、高準確性地選育橡 膠樹優(yōu)良品種。
[0014] 本發(fā)明的第三個方面是提供一種用于檢測本發(fā)明第一個方面所述的SNP標記的試 劑盒，其包含本發(fā)明第二個方面所述的引物對。即本發(fā)明的試劑盒中包含具有SEQIDN0:2和 SEQIDN0:3所示的核苷酸序列的引物對。根據本發(fā)明，利用本發(fā)明的試劑盒中所包含的引物 對，能夠有效實現對待測橡膠樹的第一個方面所述的與干膠產量性狀相關的SNP標記的多 態(tài)性檢測，確定待測橡膠樹該SNP標記位點的基因型，進而能夠有效確定待測橡膠樹的干膠 產量性狀。具體地，該SNP標記位點處基因型為雜合CA的橡膠樹的干膠產量顯著高于此處基 因型為純合CC和純合AA的橡膠樹，例如該SNP位點的基因型為雜合CA時，則能夠確定待測橡 膠樹的屬于干膠產量高的個體。由此，本發(fā)明的用于檢測本發(fā)明第一個方面所述的SNP標記 的試劑盒，能夠有效用于橡膠樹的分子標記輔助育種，進而能夠輔助早期實現短時間、低成 本、高準確性地選育橡膠樹優(yōu)良品種。
[0015] 本發(fā)明的第四個方面是提供如本發(fā)明第一個方面所述的SNP標記、本發(fā)明第二個 方面所述的引物對或本發(fā)明第三個方面所述的試劑盒在橡膠樹選育中的用途。
[0016] 如前所述，通過能夠用于檢測本發(fā)明的與橡膠樹干膠產量性狀相關的SNP標記的 試劑，例如本發(fā)明第二個方面所述的引物對或包含該引物對的試劑盒等，能夠有效地檢測 確定待測橡膠樹的上述SNP標記的基因型，進而基于獲得的基因型能夠有效確定待測橡膠 樹的干膠產量性狀，從而能夠有效輔助橡膠樹選育。
[0017] 進而，本發(fā)明的第五個方面是提供一種檢測橡膠樹干膠產量性狀的方法，通過對 待測橡膠樹進行本發(fā)明第一方面所述的SNP標記的檢測，確定所述待測橡膠樹的干膠產量 性狀。
[0018] 具體地，可以通過能夠用于檢測本發(fā)明的與橡膠樹干膠產量性狀相關的SNP標記 的試劑，例如本發(fā)明第二個方面所述的引物對或包含該引物對的試劑盒等，對待測橡膠樹 進行PCR擴增、測序，以便檢測確定待測橡膠樹的上述SNP標記的基因型，進而基于獲得的基 因型能夠有效確定待測橡膠樹的干膠產量性狀。其中，如前所述，該SNP標記位點處基因型 為雜合CA的橡膠樹的干膠產量顯著高于此處基因型為純合CC和純合AA的橡膠樹，例如當該 SNP位點的基因型為雜合CA時，則待測橡膠樹的屬于干膠產量高的個體。由此，本發(fā)明的檢 測橡膠樹干膠產量性狀的方法，能夠快速、高效、準確地檢測橡膠樹干膠產量性狀，進而能 夠有效用于橡膠樹的分子標記輔助育種，從而能夠輔助早期實現短時間、低成本、高準確性 地選育橡膠樹優(yōu)良品種。
[0019] 其中，對待測橡膠樹進行SNP標記檢測的方法不受特別限制。測序、單鏈構象多態(tài) 性聚合酶鏈式反應PCRsinglestrandconformationpolymorphism，PCR_SSCP)、限制性片段 長度多態(tài)性聚合酶鏈式反應（PCR -restriTCionfragmentlength polymorphism，PCR-RFLP) 及飛行時間質譜等技術均可以實現SNP的檢測。其中，測序是一種準確性最高、靈活性強，通 量大、檢測周期短的檢測技術。只需在SNP位點的兩側設計一對引物，擴增200-1000bp的產 物，再通過測序即可直接檢測SNP位點的基因型。因而，本發(fā)明采用測序的方法進行SNP標記 檢測。根據本發(fā)明，通過對待測橡膠樹進行前面所述的SNP標記的檢測，確定所述待測橡膠 樹的干膠產量性狀，進一步包括:提取待測橡膠樹的基因組DNA;利用本發(fā)明第二個方面所 述的引物對，將所述待測橡膠樹的基因組DNA進行PCR擴增，以便獲得PCR擴增產物;對所述 PCR擴增產物進行測序，以便獲得測序結果;基于所述測序結果，確定所述待測橡膠樹的所 述SNP標記的基因型；以及基于所述待測橡膠樹的所述SNP標記的基因型，確定所述待測橡 膠樹的干膠產量性狀。由此，能夠有效提高檢測橡膠樹干膠產量性狀的效率。
[0020] 本發(fā)明中，提取待測橡膠樹的基因組DNA的方法不受特別限制，可以采用任何已知 的基因組DNA提取方法或試劑盒進行。根據本發(fā)明的一些具體示例，采用CTAB法提取待測橡 膠樹的基因組DNA。由此，能夠有效獲得質量好、純度高的基因組DNA，便于后續(xù)步驟進行。
[0021] 本發(fā)明中，將所述待測橡膠樹的基因組DNA進行PCR擴增的條件不受特別限制。根 據本發(fā)明的一些具體示例，該PCR擴增的擴增體系以25μ1計為：100-200ngAU模版DNA ΙμL， ΙΟμΜ的SEQIDN0:2和SEQIDN0:3所示的正向引物和反向引物各ΙμL，10 X PCR反應緩沖液2.5μ I，2.5mM dNTP 2. ΟμL，5UAU的TapDNA聚合酶0.2μ1，水余量。該PCR反應條件為:95 °C預變性 5min后，941€3〇8,6〇1€3〇8,72°(：11^11共30個循環(huán)，72°(：延伸51^11。由此，能夠快速、高效、準 確地擴增本發(fā)明的SNP標記所在的片段，獲得目標擴增產物，便于后續(xù)步驟的進行。
[0022] 本發(fā)明中，對所述PCR擴增產物進行測序的方法不受特別限制，只要能夠有效獲得 PCR擴增產物即SNP標記所在的片段的序列即可。根據本發(fā)明的一些具體示例，可以采用選 自HISEQ2000、S0LiD、454和單分子等測序方法的至少一種對所述PCR擴增產物進行測序。由 此，能夠高通量、快速、高效、準確地獲得測序結果。
[0023] 本發(fā)明基于測序結果，通過比對橡膠樹參考基因組序列，能夠有效確定待測橡膠 樹的所述SNP標記的基因型為CA、CC還是AA。
[0024]本發(fā)明中，所述SNP標記的CA基因型個體的干膠產量顯著高于CC和AA基因型個體。 即本發(fā)明前面所述的SNP標記與橡膠樹的干膠產量性狀緊密相關。由此，基于確定的待測橡 膠樹的該SNP標記的基因型，能夠準確有效地確定待測橡膠樹的干膠產量性狀，例如該SNP 位點的基因型為CA時，則待測橡膠樹的屬于干膠產量高的個體。進而本發(fā)明的方法能夠有 效用于橡膠樹的分子標記輔助育種，從而能夠輔助早期實現短時間、低成本、高準確性地選 育橡膠樹優(yōu)良品種。
[0025]本發(fā)明的有益效果：
[0026] (1)本發(fā)明提供的SNP標記不受橡膠樹的年齡等限制，可用于橡膠樹的早期選育， 可顯著促進橡膠樹的育種進程；
[0027] (2)檢測橡膠樹如SEQIDN0.1所示自5 '端起第120bp的SNP位點的方法，準確可靠， 操作方便；
[0028] (3)橡膠樹如SEQIDN0.1所示自5 '端起第120bp的SNP位點的檢出，為橡膠樹干膠產 量性狀的標記輔助選擇提供了科學依據。
【發(fā)明內容】
[0029]
[0030] 下面結合具體的實施例對本發(fā)明作進一步的說明，以更好地理解本發(fā)明。
[0031] 實施例1:與橡膠樹干膠產量相關的SNP標記的獲得
[0032] 1.1橡膠樹種質材料獲得
[0033]所采用的群體為橡膠樹1981'IRRDB種質，種植于中國熱帶農業(yè)科學院橡膠研究所 國家橡膠樹種質資源圃，其遺傳背景主要來源于巴西亞馬遜河流區(qū)域阿克里州(Acre)，馬 托格羅索州(Mato Grosso)和朗多尼亞州（Ronddnia)三個州。2014年6月，采集34份種質幼 嫩葉片液氮凍存帶回實驗室備用。
[0034] 1.2橡膠樹種質材料DNA提取
[0035]取冷凍保存的橡膠樹葉片，采用CTAB法提取基因組DNA: (1)稱取Ig橡膠樹嫩葉，液 氮速凍后研磨成細粉末，轉移到50ml離心管中。（2)加入10ml65°C預熱的2 XCTAB提取緩沖 液(已提前加入2%的β-巰基乙醇），輕輕轉動離心管使植物組織在抽提緩沖液中分散均勻， 65°C溫育lh，并不時輕輕轉動離心管。（3)混合物冷至室溫加入等體積的Tris-酚:氯仿：異 戊醇（25 :24:1)，然后顛倒離心管使其混勻，注意：不要振蕩，防止打斷DNA。（4)室溫， 12000rpm離心10min使其分相。（5)吸取水相至另一離心管中，加人等體積的氯仿：異戊醇 (24:1)，顛倒混勻。室溫，12000rpm離心IOmiη。（6)吸取水相至另一離心管中，加入等體積的 異丙醇，顛倒混勾，室溫放置20min。（7)室溫，HOOOrpm離心20min。棄上清，沉淀用Iml冰預 冷的75%乙醇漂洗2次。（每次漂洗時，室溫，HOOOrpm離心10min)。（8)棄上清，超凈工作臺 上晾干DNA沉淀。然后溶于200μ1 TE(pH 8.0)緩沖液或ddH20中。加人ΙμL Rnase A(10mg/ 1111)，37°(：水浴3〇1^11，-20°(：保存?zhèn)溆谩?br>[0036] 1.3采用Sanger法測序獲得橡膠樹干膠產量相關的SNP標記
[0037] 基于Sanger法測序平臺，對上述群體中9個樣本進行產量相關基因測序，分析其核 苷酸多態(tài)性位點，采用Tassel 3.0_standalone軟件分析SNP位點與已知農藝性狀的相關 性，找到一個與橡膠樹干膠產量相關的SNP位點。該位點位于SEQ ID NO: 1所示序列的120bp 位點處，在SEQ ID NO: 1序列中用X表示該處位點，且此處位點的堿基為C或A。該位點處基因 型為雜合CA的橡膠樹的干膠產量顯著高于此處基因型為純合CC或純合AA的橡膠樹。
[0038]實施例2:與橡膠樹干膠產量相關的SNP標記的測序驗證與應用
[0039] 2.1擴增含SNP位點的核苷酸片段
[0040]以前述提取獲得的各待測橡膠樹的基因組DNA為模版，利用正向引物F:5'-AGT TAT CAT AAT GGA GGA TCT TGG CC-3'（SEQ ID NO:2)和反向引物R:5'-TGT CTA GGG TAT AAC TAG GCT GAA TAC AAT-3'（SEQ ID NO: 3)，擴增出待測SNP所在的核苷酸片段。其中， PCR反應體系為25μ1:100-200ngAU模版DNA ΙμL，ΙΟμΜ引物F和R各ΙμL，10 X PCR反應緩沖液 2·5μ1，2·5πιΜ dNTP 2·0μ1，5υ/μ1 的Tap DNA聚合酶0·2μ1，水余量;PCR反應條件為:95°C預 變性 5min 后，941€3〇8,6〇1€3〇8,72°(：1111丨11共30個循環(huán)，72°(：延伸511^11。
[0041 ] 2.2測序識別SNP位點基因型
[0042]將上述步驟中獲得的PCR產物經瓊脂糖電泳檢測、回收并將其插入pMD 18-T載體 中，每個樣品選擇6個單克隆進行測序(生工生物工程上海有限公司），識別SEQ ID NO: 1序 列中120bp處（即本發(fā)明的SNP標記）的基因型。34個待測橡膠樹個體該SNP位點的基因型及 其干膠產量如下表1所示。
[0043]表1 34個待測橡膠樹個體該SNP位點的基因型及其干膠產量
[0045] 2.3SNP位點基因型與干膠產量的關聯分析
[0046] 基于表1的結果，利用Tassel 3.0_standalone軟件的一般線性模型分析SNP位點 的基因型與干膠產量的關聯性，發(fā)現該SNP位點的基因型與干膠產量的相關性達到了極顯 著水平(R2 = O. 455377，p = 0.000045)。采用DPS軟件分析SNP位點基因型頻率及干膠產量之 間的差異關系如表2,其中CA雜合型個體干膠產量均值最高，CC純合型個體干膠產量均值次 之，AA純合型干膠產量均值最低，且CA基因型個體干膠產量均值與CC基因型個體干膠產量 均值的差異達極顯著水平(P〈〇. 01)，CA基因型個體干膠產量均值與AA基因型個體干膠產量 均值的差異達極顯著水平(P〈〇.01)。進而，證明SEQ ID N0:1所示核苷酸序列自5'端起第 120bp位點處的堿基A或C與橡膠樹干膠產量性狀顯著相關，為橡膠樹產量性狀相關的SNP標 記，該SNP標記的CA基因型個體的干膠產量顯著高于CC和AA基因型個體。
[0047]表2本發(fā)明SNP位點基因型頻率及干膠產量之間的差異關系
[0049]以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限 制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和 替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應涵蓋在本發(fā)明的范圍內。
【主權項】
1. 一種與橡膠樹干膠產量相關的SNP標記，其特征在于，所述SNP標記的序列如 SEQIDNO: 1所示，所述SEQIDNO: 1所示序列自5 '端起第120bp位點處的堿基是C或A。2. 根據權利要求1所述的SNP標記，其特征在于，所述SNP標記的雜合CA基因型橡膠樹的 干膠產量顯著高于純合CC和純合AA基因型橡膠樹。3. -種用于檢測權利要求1或2所述的SNP標記的引物對，其特征在于，所述引物對的核 苷酸序列如SEQIDNO: 2和SEQIDNO: 3所示。4. 一種用于檢測權利要求1或2所述的SNP標記的試劑盒，其特征在于，其包含權利要求 3所述的引物對。5. 如權利要求1或2所述的SNP標記、權利要求3所述的引物對或權利要求4所述的試劑 盒在橡膠樹選育中的用途。6. -種檢測橡膠樹干膠產量性狀的方法，其特征在于，通過對待測橡膠樹進行權利要 求1或2所述的SNP標記的檢測，確定所述待測橡膠樹的干膠產量性狀。7. 根據權利要求6所述的方法，其特征在于，通過對待測橡膠樹進行權利要求1或2所述 的SNP標記的檢測，確定所述待測橡膠樹的干膠產量性狀，進一步包括： 提取待測橡膠樹的基因組DNA; 利用權利要求3所述的引物對，將所述待測橡膠樹的基因組DNA進行PCR擴增，以便獲得 PCR擴增產物； 對所述PCR擴增產物進行測序，以便獲得測序結果； 基于所述測序結果，確定所述待測橡膠樹的所述SNP標記的基因型；以及 基于所述待測橡膠樹的所述SNP標記的基因型，確定所述待測橡膠樹的干膠產量性狀。8. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述SNP標記的雜合CA基因型橡膠樹的干 膠產量高于純合CC和純合AA基因型橡膠樹。
【文檔編號】C12Q1/68GK105861498SQ201610335315
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月19日
【發(fā)明人】唐朝榮, 龍翔宇, 胡彥師, 秦云霞, 方永軍, 何斌, 趙慶洲
【申請人】中國熱帶農業(yè)科學院橡膠研究所