一種布魯氏菌Yajc蛋白抗原表位多肽及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設及一種多膚，確切講是一種布魯氏菌化jc蛋白抗原表位多膚及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 布魯氏菌(Brucella),革蘭氏陰性兼性細胞內(nèi)寄生菌，是嚴重的人獸共患病，廣泛 感染家畜、野生動物和人，家畜動物布魯氏菌主要感染羊、牛和豬，其中對人致病的主要有 馬耳他布魯氏菌和流產(chǎn)布魯氏菌;布魯氏菌病感染家畜引起公畜的附睪炎和懷孕家畜的流 產(chǎn)、胎盤炎癥和不育;對于人類，布魯氏菌病課引起急性炎癥和許多類似流感感染的癥狀， 包括波浪熱、多汗、背疼和體質(zhì)虛弱，在一些病人身上，急性臨床癥狀可持續(xù)一年W上最終 導致慢性的持續(xù)性感染，慢性臨床癥狀包括不規(guī)則的發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼、乏力，并發(fā)引起關(guān)節(jié)炎、 區(qū)部末梢神經(jīng)炎癥、脊柱炎、骨髓炎和粘液囊炎，布魯氏菌病的流行不僅危害著畜牧業(yè)的發(fā) 展，造成了巨大的經(jīng)濟損失，而且嚴重威脅著人類的健康和公共衛(wèi)生安全。
[0003] 目前，全世界用于預防布魯氏菌病的有效疫苗均為減毒的活疫苗，各種疫苗的使 用不僅干擾著疫苗免疫和自然感染的鑒別診斷，而且所有的疫苗株不同程度的對人有致病 毒力，甚至有些疫苗對人為強致病力，安全可靠的滅活疫苗研究效果差，不能起到免疫保護 作用。基因工程疫苗的研究近幾十年來一直被全世界研究人員所關(guān)注和努力，但由于布魯 氏菌本身免疫抗原多樣化，結(jié)構(gòu)復雜，未能發(fā)現(xiàn)可用于田間試驗的疫苗抗原，尋找存在于各 種布魯氏菌種間保守存在且具有很好免疫功能的蛋白，研制預防保護力高的亞單位疫苗是 解決運一問題的有效辦法。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)中大多數(shù)表達工具只能表達一種蛋白，而布魯氏菌存在多種與免疫相關(guān) 的蛋白，研究表明單個蛋白的表達不能形成有效的保護疫苗用抗原，表達制備多個防控作 用的亞單位疫苗成本高，且組合成分復雜；而決定免疫蛋白功能的成分是位于蛋白上微小 的抗原決定簇，對免疫相關(guān)蛋白免疫抗原表位的挖掘和鑒定，可W有效的提取布魯氏菌中 有效的免疫抗原成分，同時也對蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究提供直接的指導，表位抗原成分的 確定，可為檢測、預防或治療能提供良好的抗原組分。因此篩選獲得免疫蛋白上運些抗原決 定簇多膚為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的不足提供了一種思路和途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種布魯氏菌化jc蛋白抗原表位多膚及其應用。
[0006] 本發(fā)明的布魯氏菌化jc蛋白抗原表位多膚其氨基酸序列中含有SEQ ID NO. 1或/ 和沈Q ID NO.2或/和沈Q ID NO.7或/和沈Q ID NO.8。
[0007] 本發(fā)明的布魯氏菌Yajc蛋白抗原表位多膚還可W是：其氨基酸序列為SEQ ID NO. 1或/和SEQ ID NO.2或/和沈Q ID NO.4或/和沈Q ID NO.5所示的序列經(jīng)過一個或/和幾 個氨基酸殘基的取代和/或缺失形成的序列形成的多膚，或者是其氨基酸序列為SEQ ID NO. 1或/和SEQ ID NO. 2或/和SEQ ID NO.4或/和SEQ ID NO.5所示的序列和添加有具有布 魯氏菌免疫源性功能的衍生的多膚。
[000引 由沈Q ID NO. 1或/和沈Q ID NO.2或/和沈Q ID NO.4或/和沈Q ID NO.5所構(gòu)成的 重組載體或表達盒或轉(zhuǎn)基因細胞或重組菌。
[0009] 本發(fā)明的多膚可在制備診斷或預防或治療布魯氏菌引起的疾病的試劑或藥物中 的應用。
[0010] 布魯氏菌化jc蛋白是免疫原性膜蛋白，目前功能不詳，但研究發(fā)現(xiàn)化jc能激發(fā)小 鼠產(chǎn)生強烈的免疫反應。本發(fā)明利用生物信息學的手段，對布魯氏菌化jc免疫蛋白氨基酸 的組成和功能進行分析，并模擬構(gòu)建出蛋白的高級結(jié)構(gòu)模型，綜合上述結(jié)果發(fā)掘出的蛋白 上潛在的具有免疫功能的抗原多膚，化學合成運些多膚后，通過實驗驗證手段最終獲得功 能多膚，制備出的布魯氏菌化jc免疫蛋白多膚為布魯氏菌病的檢測、疫苗、防控提供新的思 路，運也對于提高我國動物布魯氏菌病的防治技術(shù)水平，保證養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展、提供農(nóng)牧民 收入、保證公共衛(wèi)生和畜產(chǎn)品安全同樣具有重大的社會效益。
[0011] 本發(fā)明的有益效果為：1)本發(fā)明篩選多膚為化學合成，而不是活的布魯氏菌上提 取，因此在生產(chǎn)過程中完全避免了人為的制毒、散毒等安全隱患。2)本發(fā)明采用生物信息學 工具與試驗驗證相結(jié)合篩選抗原多膚，縮小的篩選抗原多膚的范圍，提高了篩選效率。3)本 發(fā)明在樹突狀細胞上篩選抗原多膚，由于樹突狀細胞具有強大的抗原加工和遞呈能力，結(jié) 果更為接近于動物模型。4)本發(fā)明所獲得的多膚能與布魯氏菌病陽性血清發(fā)生反應，故該 重組蛋白可作為目的抗原檢測檢測布魯氏菌病感染的血清，如化ISA方法等。5)本發(fā)明所表 達的目的蛋白，可直接用于制備化jc蛋白單克隆抗體的抗原。
【附圖說明】
[0012]圖1是本發(fā)明實施例的DC培養(yǎng)圖。
[0013]圖視本發(fā)明流式細胞儀檢測DC的表型結(jié)果。
[0014] 圖3是本發(fā)明多膚作用DC后IL-2的分泌量;樣本依次為1-5多膚，6為已知抗原表位 對照;7為陰性對照。
[0015] 圖4是本發(fā)明多膚作用DC后IL-4分泌量;樣本依次為1-5多膚，6為已知抗原表位對 照;7為陰性對照。
[0016] 圖5是本發(fā)明多膚作用DC后IFN-y分泌量;樣本依次為1-5:多膚，6:已知抗原表位 對照;7:陰性對照。
【具體實施方式】
[0017] 本發(fā)明W下結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的說明。一、實驗材料的制備 1)抗原表位多膚的獲得 用生物信息學軟件對布魯氏菌化jc蛋白氨基酸的組成、性質(zhì)W及其高級結(jié)構(gòu)進行分 析，結(jié)合所有結(jié)果，挖掘獲得可能具有免疫原性的五個多膚片段，并委托南京金斯瑞生物科 技有限公司合成，得到各多膚序列如下： IJtPAFAQASGSVVGPDML(沈Q ID NO. 1在后述的內(nèi)容中為多膚樣本1); 戀RGDTWTGGGIVGKVLKVVD(SEQ ID N0.2在后述的內(nèi)容中為多膚樣本2); |||QRTQMKKRQEMLNSVR(SEQ ID N0.4在后述的內(nèi)容中為多膚樣本3); 壬MSILPFILIFVIMYFLIIRP(SEQ ID N0.5在后述的內(nèi)容中為多膚樣本4); 這)IADGVRIRVVRATLMDVRVKGE(沈Q ID N0.3在后述的內(nèi)容中為多膚樣本5)。
[0018] 2 )小鼠骨髓源樹突狀細胞(DC)的培養(yǎng) 頸椎脫位法處死Ba化/c小鼠，無菌狀態(tài)下取股骨和腔骨，浸泡在RPMI-1640培養(yǎng)基中。 用1ml注射器吸取RPMI-1640培養(yǎng)液，從骨干的一端刺入骨髓腔，將骨髓沖洗到一無菌培養(yǎng) 皿中，每根骨頭反復4~6遍，收集培養(yǎng)皿中的骨髓細胞懸液，離屯、，1500巧mXlO min。棄去 上清，加入5 ml無菌化iS-N也Cl溶液懸浮細胞溶解紅細胞，于室溫下靜置2分鐘溶解紅細胞 后，再次離屯、，1500 rpmX5 min,棄上清。用RPMI-1640培養(yǎng)液洗涂后將細胞用完全培養(yǎng)基 懸浮，分至6孔培養(yǎng)板中，并在每孔中加入完全培養(yǎng)基至4 ml，再加入rmGM-CSF至終濃度10 ng/ml，化-4終濃度lOng/ml。將細胞培養(yǎng)板放入37°C，含5% C〇2的解箱中培養(yǎng)48~72小時。 輕輕吹打細胞后，連同培養(yǎng)液一起吸去懸浮細胞，僅保留貼壁細胞。加入新鮮的完全培養(yǎng)基 及相同濃度的rmGM-CSF，繼續(xù)培養(yǎng)至第5天。半量換液，并補足rmGM-CSF;盡量保留懸浮細 胞。繼續(xù)培養(yǎng)至第7天，用吸管輕輕吹打后收集所有懸浮細胞，即為富集的小鼠骨髓來源的 樹突狀細胞(Bone marrow-derived den化itic cell, BMDC)，細胞在顯微鏡下觀察期形態(tài) 符合骨髓源樹突狀細胞的特征，參見圖1，經(jīng)流式細胞儀檢測表明細胞表面CDiic抗體達到 70%W上，證明培養(yǎng)樹突狀細胞高達70%W上，能滿足實驗要求;檢測其表型，結(jié)果如，參見圖 2所示。
[0019] 3)多膚與DC的相互作用 收集培養(yǎng)7天的DC，計數(shù)，調(diào)整到1 X 105細胞/ml濃度，將細胞按每孔500ul接種培養(yǎng)與 48孔細胞培養(yǎng)板，細胞培養(yǎng)體系中加入合成的多膚，終濃度為lOng/ml。每個多膚做3個平行 對照，同時用已經(jīng)鑒定的多膚刺激細胞培作為陽性對照，W沒刺激的細胞培養(yǎng)為空白對照， 作用30小時后，收集細胞培養(yǎng)上清，-80°C保存，W備做忍片檢測。
[0020] 4)忍片操作流程(操作由試劑盒完成） ;:D每個孔中加 10化L的樣品稀釋液，室溫搖床上解育30min，封閉定量抗體忍片。抽去 每個孔中的緩沖液，添加 10化L的標準液和樣品到孔中，4°C過夜解育。
[00別]參清洗 抽去每個孔中的標準品或樣品，IX洗液I清洗3次，每次lOmin室溫搖床震蕩，每孔15化 L的1 X洗液I，每次清洗要抽干凈洗液，用去離子水稀釋20 X洗液I。抽去每個孔中的1 X洗 液I，加入1 X洗液II清洗3次，每次5min室溫搖床震蕩，每孔15化L的1 X洗液II，每次清洗 要抽干凈洗液，用去離子水稀釋20X洗液11(所有試劑由試劑盒提供）。
[0022] g檢測抗體混合物的解育 離屯、檢測抗體混合物小管，然后加入1.4ml的樣品稀釋液，混合均勻后再次快速離屯、。 添加 8化L的檢測抗體到每個孔中，RT搖床上解育1.5小時。抽去每個孔中的檢測抗體