專利名稱：布魯氏菌疫苗及疫苗用抗原蛋白的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及家畜使用的抗布魯氏病的疫苗及這種疫苗所用的抗原蛋白的制 備方法。
背景技術(shù)：
家畜布魯氏菌病呈世界性分布，在五個(gè)洲的200多個(gè)國(guó)家中有170多個(gè)國(guó)
家和地區(qū)存在或爆發(fā)該病，尤其在南美洲、非洲、亞洲的許多發(fā)展中國(guó)家流行
嚴(yán)重。布魯氏菌病主要通過消化道感染， 一般只發(fā)生于動(dòng)物一動(dòng)物、動(dòng)物一人
之間的傳染,被國(guó)家列為二類傳染病。近些年來，我國(guó)布魯氏菌病的疫情明顯回
升，已波及28個(gè)省市、自治區(qū)和直轄市；家畜布魯氏菌病的爆發(fā)流行已經(jīng)給畜
牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。布魯氏菌病流行形勢(shì)十分嚴(yán)峻。人感染布魯氏菌病，
臨床主要表現(xiàn)波浪熱或馬耳他熱，關(guān)節(jié)疼痛，慢性病例長(zhǎng)期低燒，嚴(yán)重?fù)p傷身
體，使之完全或部分喪失工作能力。生物戰(zhàn)恐怖分子，歷來把培育強(qiáng)毒力布魯
氏菌作為侯選的生物武器之一。
布魯氏菌是革蘭氏陰性、兼性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，能夠感染多種動(dòng)物和人。當(dāng) 前確認(rèn)布魯氏菌屬中有6個(gè)種馬耳他布魯氏菌(&MceZ/a me//tera&)、流產(chǎn)布 魯氏菌(&.a6oW船)、豬布魯氏菌(5mm/s)、沙林鼠布魯氏菌(Smeoto附ae)、綿 羊布魯氏菌(^:ov/力和犬布魯氏菌(5/:cam's)。分類主要根據(jù)致病性和對(duì)宿主的嗜 性差異做出。從遺傳發(fā)生關(guān)系學(xué)看，布魯氏菌屬屬于根瘤菌群(Rhizobiaceae group)。 DNA-DNA雜交研究揭示6種布魯氏菌與最近分離的海洋哺乳動(dòng)物分離 株之間高度一致(>90%)。
目前，市場(chǎng)上動(dòng)物用布病疫苗全部為不同菌株的弱毒疫苗，例如，中國(guó)發(fā) 明專利申請(qǐng)200810224820.3公開一種流產(chǎn)布魯氏菌的重組菌及流產(chǎn)布魯氏菌的 重組疫苗，它是將流產(chǎn)布魯氏菌(Brucella abortus)中的冷休克蛋白的編碼基因滅 活得到的菌株。這種菌菌株的毒力比現(xiàn)行疫苗S19小，據(jù)該申請(qǐng)文件介紹，無 需滅活就可以作為疫苗免疫動(dòng)物。又如中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)200810224819.0 公開的羊種布魯氏菌的重組菌及。本發(fā)明提供的羊種布魯氏菌的重組疫苗菌， 是將羊種布魯氏菌(Brucella melitensis)中的冷休克蛋白的編碼基丙滅活得到的 菌株。與現(xiàn)有的菌株相比，該專利申請(qǐng)的菌株的毒力比現(xiàn)行疫苗M5小，據(jù)該申請(qǐng)文件介紹，同樣無需滅活就可以作為疫苗免疫動(dòng)物。中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)
200810224818.6公開了的帶有免疫標(biāo)記的流產(chǎn)布魯氏菌的重組菌是將流產(chǎn)
布魯氏菌(Brucella abortus)中的perosamine合成酶的編碼基因滅活得到的菌
株。與出發(fā)菌株相比，該專利申請(qǐng)得到的菌株的毒力更小，無需滅活就可以作
為疫苗免疫動(dòng)物。但弱毒株長(zhǎng)期使用有可能毒力返強(qiáng)。另外，布魯氏菌的培養(yǎng)
要求條件高，培養(yǎng)比較困難。另一方面，由于我國(guó)現(xiàn)用的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)不能
區(qū)分疫苗免疫抗體與野毒感染抗體。為了不干擾常規(guī)檢疫，所以現(xiàn)在我國(guó)大部
分地區(qū)的奶牛不接種疫苗，以便避免免疫抗體的干擾，進(jìn)行布病檢疫。
尋找一種可長(zhǎng)期使用而不產(chǎn)生毒力返強(qiáng)，培養(yǎng)生產(chǎn)更為容易的布魯氏菌疫
苗對(duì)維護(hù)國(guó)家安全，促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)性發(fā)展，保證食品安全、環(huán)境安全，保
護(hù)人民身體健康和維護(hù)社會(huì)穩(wěn)定具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種不存毒力返強(qiáng)，使用更 加安全的，供家畜用的抗布魯氏菌病的疫苗，以及這種疫苗用抗原蛋白的的， 制備方法，特別是一種可以大量工程化生產(chǎn)的方法。
本發(fā)明的布魯氏菌疫苗所用的抗原蛋白為布魯氏菌bcsp31蛋白，特別是布 魯氏菌bcsp31重組蛋白。
本發(fā)明的疫苗所用的用重組抗原蛋白的制備方法是以從布魯氏菌提取的細(xì) 菌總DNA為模板，根據(jù)布魯氏菌bcsp31基因的核苷酸全序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn) 行聚合酶鏈反應(yīng)，克隆獲得bcsp31蛋白基因，然后轉(zhuǎn)入酵母表達(dá)載體中，獲得 重組表達(dá)載體，將重組表達(dá)載體導(dǎo)入酵母表達(dá)細(xì)菌中，獲得重組畢赤酵母表達(dá) 菌，增殖并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)重組畢赤酵母表達(dá)菌，由于本發(fā)明所表達(dá)的蛋白為分 泌蛋白，存在于液體培養(yǎng)基中且基本沒有其他蛋白帶，純度可以達(dá)到要求，只 需要離心將細(xì)胞于液體分離即可得到所用的抗原蛋白。
本發(fā)明的制備方法中，其特征是所用的引物序列為
P1: 5' — cgcgaattcaccccacaggccagaacatttttccg—3' (含EcoRl酶切位點(diǎn))
Rl: 5, — gctgcggccgctttcagcacgcccgc —3,(含NotI酶切位點(diǎn))。
研究表明，布魯氏菌BCSP31 (Brucella Cell Surfacial Protein 3 l)存在于該菌細(xì) 胞表面，BCSP31可溶于水，能夠鹽析，推測(cè)可能是一種周質(zhì)蛋白，分子量為31kDa，是一個(gè)抗體耐受性標(biāo)記基因，研究表還表明該蛋白具有免疫作用，在感 染時(shí)能誘發(fā)免疫反應(yīng)，由于BCSP31能產(chǎn)生抗原反應(yīng)，但卻并不具有致病性， 因此采用BCSP31為亞單位疫苗可以完全克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，其使用較現(xiàn)有 技術(shù)更為安全。
本發(fā)明的蛋白采用PCR進(jìn)行克隆，再經(jīng)酵母表達(dá)的重組菌，使用其具備大 規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的條件。
本發(fā)明進(jìn)行PCR反應(yīng)所采用的引物在酶切位點(diǎn)后對(duì)應(yīng)的密碼子編碼的蛋白 包括了首個(gè)和最末端氨基酸，也就是說在2酶切位點(diǎn)之間包括了除信號(hào)肽以外 的所有蛋白序列，所表達(dá)蛋白是一完整的蛋白，在次原則下，無論引物后面序 列的后面增加或減少幾個(gè)堿基都不影響蛋白的完整性；此外試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，在5' 引入了 acccca編碼的兩個(gè)氨基酸，能形成環(huán)形結(jié)構(gòu)，從而防止了酶對(duì)表達(dá)蛋白 的降解，使蛋白保存時(shí)間更長(zhǎng)。
本發(fā)明還有如下優(yōu)點(diǎn)-
1. 本發(fā)明生產(chǎn)的疫苗抗原是免疫基因的表達(dá)產(chǎn)物，而不是活的布魯氏菌全 菌體，因此在生產(chǎn)過程中完全避免了人為的制毒、散毒等安全隱患。
2. 本發(fā)明生產(chǎn)的疫苗與傳統(tǒng)弱毒疫苗相比，抗原成分單一，在免疫家畜體 內(nèi)只產(chǎn)生單一的特異性抗體，因此可以用血清學(xué)方法有效地鑒別區(qū)分疫苗免疫
家畜和自然感染家畜。因此采用本發(fā)明的疫苗可克服現(xiàn)階段存在的無法區(qū)分疫 苗免疫抗體與野毒感染抗體的問題，為國(guó)家實(shí)施家畜布魯氏菌病根除計(jì)劃，提 供有力的技術(shù)支持。
3. 本發(fā)明涉及的疫苗用抗原是蛋白質(zhì)，與其他新型疫苗(如活載體疫苗、 核酸疫苗、基因缺失疫苗)相比不會(huì)發(fā)生可能出現(xiàn)基因重組問題，因此本發(fā)明 不存在生物安全性問題。
4. 本發(fā)明以酵母作為目的蛋白的表達(dá)載體，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，可以用發(fā)酵罐規(guī)模 化生產(chǎn)，可以實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制，保證所生產(chǎn)的疫苗安全有效。
5. 本發(fā)明以酵母作為目的蛋白的表達(dá)載體，與大腸桿菌原核表達(dá)相比，表 達(dá)量要高，且以可溶性存在，其活性要遠(yuǎn)高于包涵體蛋白。
6. 本發(fā)明所表達(dá)的目的蛋白，能與布魯氏菌病陽性血清發(fā)生反應(yīng)，故該重 組蛋白可作為目的抗原檢測(cè)檢測(cè)布魯氏菌病感染的血清，如ELISA方法等。7、 本發(fā)明所表達(dá)的目的蛋白，可直接用于制備布魯氏菌病BCSP31單克隆
抗體的抗原。
8、 本發(fā)明的方法相對(duì)現(xiàn)有的疫苗技術(shù)而言要簡(jiǎn)單。


圖1為pPIC9K-bcsp31酵母表達(dá)產(chǎn)物的電泳圖，其中M是蛋白Marker; l是空載體對(duì)照；2是96小時(shí)的產(chǎn)物；3是72小時(shí)的產(chǎn)物；4是48小時(shí)的產(chǎn) 物；5是24小時(shí)的產(chǎn)物。圖2為pPIC9K七csp31酵母表達(dá)Western-blot分析圖， 其中M是蛋白Marker; 1是表達(dá)物Western-blot; 2是去糖基化產(chǎn)物Westem-blot。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的具體實(shí)施方式
說明如下 本發(fā)明使用的主要材料
菌株流產(chǎn)布魯氏菌2型CVCC12株，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。
表達(dá)菌GS115為H的基因表達(dá)的酵母菌，用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化時(shí)須經(jīng)山梨醇處
理使其具有感受性，成為感受態(tài)細(xì)胞，該菌株可以從Invitrogen公司購(gòu)買得到。 pPIC9K載體為酵母表達(dá)載體，購(gòu)自Invitrogen公司。
布魯氏菌陽性牛血清用于表達(dá)蛋白的定性檢測(cè)，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。
辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗牛IgG:用于表達(dá)蛋白的定性檢測(cè)，購(gòu)自北京拜爾 迪生物技術(shù)公司。
引物所有基因擴(kuò)增和改造用的引物均由大連寶生物有限公司合成。
酶和試劑EcoRI、Notl、Taq酶、T4DNA連接酶均購(gòu)自Promega公司；IPTG、 SDS (十二烷基磺酸鈉)、蛋白酶K、 Rnase、溶菌酶、核酸Marker、 Agarose DNA extraction kit、 DNA快速純化冋收試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖芯?gòu)自大連寶生 物工程公司；酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)溶液產(chǎn)自美國(guó)，瓊脂糖產(chǎn)自西班牙，均 由上海生丁生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)口分裝；單核苷酸(dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP,購(gòu)自TaKaRa公司。中分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker為MBI公司產(chǎn)品； 三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、 Triton X-100為華美生物工程公司產(chǎn)品；山梨醇、甲醇等生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。 具體操作如下
1. 從選擇的流產(chǎn)布魯氏菌2型CVCC12株提取總DNA CVCC12是我國(guó)保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株(請(qǐng)?zhí)峁┚N保藏號(hào)及保藏地)。 將流產(chǎn)布魯氏菌接種布魯氏菌培養(yǎng)用胰蛋白胨瓊脂平板，在5%C02環(huán)境中，
37'C培養(yǎng)24-48小時(shí)，通過形態(tài)學(xué)和生化鑒定，確定其為布魯氏菌，然后進(jìn)行增 菌培養(yǎng)；取2mL增菌液于微量離心管，6000rpm離心5min收集沉淀；每管加入 500WNETBuffer置于8(TC水浴15min;從水浴鍋取出離心管，室溫放置2min， 而后加入12W溶菌酶，37。C消化4hr;從水浴鍋取出離心管，室溫放置2min， 加入蛋白酶K、 Rnase酶過夜消化；在離心管中加入等體積的酚氯仿異戊醇 (25:24:1)溶液抽提2次；用無水乙醇洗滌2次得布魯氏菌基因組總DNA，放 入溫箱中使離心管內(nèi)壁干燥；加入50)4無核酸酶TE Buffer溶解，貯存于-20。C 備用。)
本實(shí)施例屮選用流產(chǎn)布魯氏菌2型CVCC12株，從中提取細(xì)菌總DNA，以 該總DNA為模板，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，所用引物對(duì)為 P1: 5 ， 一 cgcgaattcaccccacaggccagaacatttttccg — 3'
: 55 — gctgcggccgctttcagcacgcccgc — 3' 擴(kuò)增片段包括bcsp31基因的閱讀框(除去了信號(hào)肽)。
2. 目的基因的克隆
首先將前述PCR產(chǎn)物和pPIC9K載體分別用EcoR I和Not I雙酶切，然后 在連接酶的作用下使兩產(chǎn)物連接，從而構(gòu)建成pPIC9K-Bcsp31表達(dá)載體。通過 PCR鑒定和酶切鑒定予以確認(rèn)。鑒定肯定陽性質(zhì)粒pPIC9K-Bcsp31為帶有完整 bcsp31基因的重組質(zhì)粒。測(cè)序結(jié)果表明，陽性質(zhì)粒pPIC9K-Bcsp31含有流產(chǎn)布 魯氏菌外膜蛋白基因bcsp31的閱讀框架。
2.1試劑的配制
10XYNB:稱取13.4gYNB(YNB為無氨基酸酵母氮源，酵母培養(yǎng)基組成成 分)溶于100ml去離子水，加熱至YNB完全溶解，過濾除菌，4。C保存，可放1年。
500XB: 20mg生物素溶于100ml去離子水，過濾除菌，4。C保存，可放1年。10XD: 200g葡萄糖溶于1000ml去離子水，高壓(12rC,0.105PKa) 15min 或過濾除菌，4。C保存，可放1年。
10XM: 5ml甲醇溶于100ml去離子水，過濾除菌,4。C保存，可保存2月。
10XGY: 10ml甘油溶于90ml去離子水，高壓(121。C,0.105PKa) 20min 滅菌，4"C保存，可放1年以上。
1M磷酸鹽緩沖液(pH6.0): lMK2HP04132ml， 1MKH2P04868ml， H3P04 調(diào)至pH6.0，高壓滅菌(121。C，0.105PKa)" 4。C保存。
YPD和YPD平板lg酵母提取物，2g蛋白胨，溶于90ml去離子水，高壓 滅菌(12rC,0.105PKa)，冷卻后加入10 ml IOXD，制板加1.5g瓊脂粉。
MD和MD平板80ml水高壓滅菌(制板加1.5g瓊脂粉)，冷卻至5(TC左 右，加入10ml IOXYNB， 0.2ml 500XB， 10ml IOXD。
BMGY: lg酵母提取物，2g蛋白胨，溶于70ml去離子水，高壓滅菌(121 。C，0.105PKa)，冷卻后加入10ml 1M磷酸鹽緩沖液，10ml IOXYNB， 0.2ml 500 XB， 10mllOXGY。
BMMY: lg酵母提取物，2g蛋白胨，溶于70ml去離子水，高壓滅菌(121 。C,0.105PKa)，冷卻后加入10ml 1M磷酸鹽緩沖液，10ml IOXYNB， 0.2ml 500 XB， 10mllOXM。
2.2將pPIC9K-Bcsp31表達(dá)載體堿裂解法小量提取質(zhì)粒。
2.3對(duì)重組質(zhì)粒pPIC9K-Bcsp31的鑒定
鑒定包括以下方面
(1) 重組質(zhì)粒pPIC9K-Bcsp31瓊脂糖凝膠電泳鑒定；
(2) 重組質(zhì)粒pPIC9K-Bcsp31的PCR擴(kuò)增；即用含有如下兩個(gè)酶切位點(diǎn)的 Pl、 Rl引物對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定；
(3) 重組質(zhì)粒pPIC9K-Bcsp31的酶切鑒定；即用EcoR I和Not I雙酶切鑒定;
(4) 重組質(zhì)粒pPIC9K-Bcsp31的測(cè)序確證；
(5) 用DNAstar軟件對(duì)序列進(jìn)行分析，并與已發(fā)表的序列進(jìn)行同源性比較。 經(jīng)以上的鑒定證明獲得的正確目的基因已準(zhǔn)確的連接到表達(dá)載體上，并成
功的構(gòu)建了 pPIC9K-Bcsp31重組表達(dá)載體。
2.4畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備、轉(zhuǎn)化和篩選
(1) 將劃線培養(yǎng)的畢赤酵母GS115單菌落接種于3mlYPD培養(yǎng)基中，28°C， 250rpm搖蕩培養(yǎng)24 28h。
(2) 取培養(yǎng)基100^1轉(zhuǎn)接與20mlYPD培養(yǎng)基中，28°C ， 250rpm振蕩培養(yǎng)過夜，OD600=1.3 1.5時(shí)，4。C1500g離心5min收獲細(xì)胞。
(3) 細(xì)胞依次用100ml、 50ml冰預(yù)冷水和20ml冰預(yù)冷的1M山梨醇洗滌，4 'Cl500g離心5min，最后用0.8ml冰預(yù)冷的1M山梨醇懸浮菌體，置冰浴。
(4) 取Sal I線形化的重組載體1(^1 (100|ig)與80|il畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞 混勻，然后轉(zhuǎn)入到冰預(yù)冷的0.2cm的電轉(zhuǎn)移杯中，冰上放置5min 。
(5) 將電轉(zhuǎn)移杯放在電穿孔儀上用脈沖電流電擊一次，電轉(zhuǎn)條件電壓 1500V，電容25F，電阻200Q，時(shí)間5ms，溫度0。C。
(6) 電擊結(jié)朿，立即加入lml冰預(yù)冷的1M山梨醇，混勻，取250(il轉(zhuǎn)化物 涂營(yíng)養(yǎng)缺陷型MD培養(yǎng)基平皿，置28t:恒溫培養(yǎng)2 4天，能在MD培養(yǎng)基上 生長(zhǎng)的菌落為His+轉(zhuǎn)化子。
(7) 將MD培養(yǎng)基平皿中長(zhǎng)出的His+轉(zhuǎn)化自用影印法依次接種到含G418濃 度梯度為0.5、 1.0、 2.0、 3.0、 4.0和5.0mg/ml的培養(yǎng)基中，28"C培養(yǎng)逐級(jí)篩選 G418高抗件菌株，獲得目的基因高拷貝重組菌株。
3. 流產(chǎn)布魯氏菌bcsp31基因在酵母表達(dá)菌中的表達(dá)
從YPD-G418平皿上挑取篩選高拷貝菌落接種于20mlBMGY培養(yǎng)基中，28 。C 30"C振蕩培養(yǎng)16 18h，當(dāng)OD600=2 6時(shí)，室溫1500g離心10min收集細(xì) 胞，將收集的細(xì)胞用30mlBMMY培養(yǎng)基懸浮于250ml的三角瓶中，三層無菌紗 布扎口，保證良好的通氣性，28'C振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)，每24h向培養(yǎng)基中補(bǔ)加 甲醇濃度至1%，并且24h取樣一次，取樣量lml以保證持續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)。
4. 重組蛋白pPIC9K-Bcsp31電泳檢測(cè) (I) SDS-PAGE溶液的配制
Tris-甘氨酸緩沖液25mmol/LTris、 250mmol/L甘氨酸(pH 8.0)、 0.1% SDS。 2XSDS 上樣buffer: 100m mol/LTris.Cl(pH8.0)、 200mmol/L巰基乙醇、
4% SDS、 0.2% 溴酚藍(lán)、20% 甘油。
氨基黑染色液(100ml): 0.5g氨基黑10B溶于60ml水、30ml乙醇、10ml冰
乙酸中。
封閉液10mlPBST+0.3gBSA。底物溶液(30ml): 30ml PBST中溶解15mg的DAB (二氨基聯(lián)苯胺)，9mg CoCl2'6H20，加入10|^30%11202混勻后立即使用。
5x核酸上樣緩沖液50%甘油(v/v)、 50mmol/LEDTApH8.0、 0.125%溴酚 藍(lán)(w/v)、 0.125%二甲苯氰(w/v)。
考馬斯亮藍(lán)染色液45ml曱醇、45ml水、10ml冰醋酸屮溶解0.25g考馬 斯亮藍(lán)R250。
脫色液30%￥醇、10%冰乙酸，蒸餾水補(bǔ)體積至100ml。 PBST溶液5.8gNa2HP04'12H20、 0.4gKCl、 0.4g KH2P04、 16gNaCl、 lml 吐溫-20，蒸餾水補(bǔ)體積至2000ml。
(II) SDS-PAGE
(1) 洗凈玻璃板，固定在電泳槽上，用2.0%瓊脂糖封邊。按分子克隆的配方 配制15。/。的分離膠20ml，迅速注入兩玻璃板之間，膠頂覆蓋lml雙蒸水。待分 離膠凝固后傾出覆蓋層液體，用去離子水沖洗凝膠頂部數(shù)次，倒置空干液體， 加入2ml5。/。的積層膠溶液，插上梳子，垂直放置電泳槽使其凝固。
(2) 小心移去梳子，在電泳裝置上、下槽間加入Tris-甘氨酸緩沖液，用注射 器沖洗加樣孔數(shù)次，將電源負(fù)極與上槽相連。
(3) 收集的菌液12000rpm離心3min，用100^1 pH7.4的PBS懸浮，超聲波裂 解到菌液呈半透明，加入等體積的2XSDS上樣buffer,混勻，水浴煮沸5min， 用微量進(jìn)樣器上樣20^1，打開電源，用80V電壓電泳至溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠，把 電壓提高到120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部。
(4) 染色取下凝膠用蒸餾水沖洗，用5倍凝膠體積的考馬斯亮藍(lán)染色液浸 泡凝膠，放在脫色搖床上室溫染色3h。
(5) 脫色用30%曱醇、10%冰乙酸的混合液，在脫色搖床上脫色過夜，其 間更換染色液3 4次。待藍(lán)色背景完全脫凈后，將凝膠浸入蒸餾水中終止脫色。
5.重組蛋白pPIC9K-Bcsp31免疫活性的檢測(cè) (I) Western-blot分析溶液的配制 洗滌液溶液150mmol/L NaC 15 0mmol/L Tris-HCl pH7 5 轉(zhuǎn)移緩沖液39mmol/L甘氨酸 48mmol/L Tris堿 0.037% SDS 20% 曱醇
氨基黑染色液(100mL): 0.5g氨基黑10B溶于40mL雙蒸水、50mL甲醇、 lOmL冰乙酸中。
封閉液10mL PBST+0.3g BSA
底物溶液(30mL):在30mLPBST中加入15mg的DAB (二氨基聯(lián)苯胺)和 9mg CoC12 6H20使其溶解，加入10|il 30% H202混勻后立即使用。 (II) ELISA試劑配制
(1) 包被液0.05mol/L碳酸鹽緩沖液 Na2C03(無水碳酸鈉)1.6 g NaHC03 (碳酸氫鈉)2.9 g 加無離子水至1000mL
(2) 洗滌液pH9.2碳酸鹽緩沖液-吐溫20 Na2HP04 12H20 2.9g
KC1 0.2g KH2P04 0.2g NaCl 18g 吐溫20 0.5mL 加無離子水至lOOOmL
(3) 甲液O.lmol/L擰檬酸4.2g/200mL
乙液0.2mol/LNa2HPO4 12H20 14.3g/200mL
取甲液24.3mL與乙液25.7mL混合，臨用前加20mg鄰苯二胺(OPD) 加過氧化氫(H202) 0.02mL。
(4) 終止液2mol/LH2S04溶液 取分析純濃硫酸U.8mL ，加無離子水至100mL。(III)重組表達(dá)蛋白的Western-blot分析
(1) .轉(zhuǎn)印剪8塊濾紙與1塊硝酸纖維素膜(NC)，大小與凝膠相等，在轉(zhuǎn) 移緩沖液中浸泡3min，在正極板上按四層濾紙、NC膜、SDS-PAGE電泳凝膠、 四層濾紙的順序疊放整齊，確定無氣泡后蓋上負(fù)極板，llOmA轉(zhuǎn)移lhr。
(2) .封閉轉(zhuǎn)移完成后，取下NC膜，切下標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker,置氨基黑染 色液中浸染5min，取出后用漂洗脫色，直至背景藍(lán)色脫盡。其余NC膜用PBS 沖洗，加入10mL封閉液，室溫輕輕振搖l-2hr。
(3) .與抗體的結(jié)合封閉結(jié)束后，用PBS沖冼NC膜4-5次，加入PBST1:50 倍稀釋的布魯氏菌陽性牛血清10mL， 37。C結(jié)合1.5hr，用PBST沖洗4-5次，每 次在搖床緩慢搖動(dòng)。加入1:400倍稀釋的兔抗牛IgG(—抗)，室溫下輕搖孵育lhr， 取出用PBST沖洗3-4次，每次10min。
(4) .底物顯色將NC膜轉(zhuǎn)移到10mL底物溶液中，室溫避光輕搖3min觀察 顯色情況，等出現(xiàn)條帶時(shí)，立即轉(zhuǎn)入PBST緩沖液中，室溫保存。
(V)重組表達(dá)蛋白的ELISA檢測(cè)
(1) 重組表達(dá)蛋白的純化將大量制備的含重組表達(dá)蛋白的重組菌菌體裂解 上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)染色后，參照Marker的大小，切下所需的51ku 的特異蛋白條帶，將其凍干后研成粉末與1XPBS等體積混合。
(2) ELISA檢測(cè)按常規(guī)方法進(jìn)行，將純化的目的蛋白IO倍稀釋后包被酶標(biāo) 板，用購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的布魯氏菌陽性牛血清1:100稀釋作為一抗，辣 根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG 1:200稀釋作為二抗。同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)陰性和標(biāo)準(zhǔn)陽 性血清作對(duì)照。
(3) 操作過程用微量移液器向每個(gè)孔內(nèi)加O.lmL包被液稀釋的蛋白樣品， 置濕盒內(nèi)于37。C恒溫培養(yǎng)箱中l(wèi)h，然后于4。C冰箱中包被過夜。次日，用洗滌 液洗滌三次，甩去洗滌液，倒置在紗布上輕輕拍扣使孔內(nèi)的液體充分流出，每 次間隔3min。向孔內(nèi)分別加入用稀釋液稀釋好的1:100陽性血清、陰性血清 O.lmL，置濕盒內(nèi)于37。C恒溫箱中反應(yīng)lhr后，甩去血清，用同法洗滌3次，再 加入稀釋好的1:200酶標(biāo)記兔抗牛IgG O.lmL，置于濕盒內(nèi)于37。C恒溫箱靜置 lhr，甩去殘留的酶標(biāo)記物溶液，以同法洗滌三次。加入底物溶液O.lmL，置濕盒內(nèi)于37'C恒溫箱中靜置30min，取出后立即向孔內(nèi)加入0.02mL終止液，終止 反應(yīng)。
(4)結(jié)果判定將培養(yǎng)板放入分光光度計(jì)讀取450吸收波的OD值。 5重組表達(dá)蛋白免疫鑒定結(jié)果
(I )重組表達(dá)蛋白的Westem-blot分析 重組pPIC9K-Bcsp31表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上進(jìn)行免疫 印跡試驗(yàn)，結(jié)果在31ku和55ku左右出現(xiàn)明顯的陽性反應(yīng)帶，說明表達(dá)產(chǎn)物能 被流產(chǎn)布魯氏菌陽性牛血清所識(shí)別，具有免疫性。 (II ) ELISA結(jié)果
用純化的pPIC9K-Bcsp31融合蛋白作為包被抗原，進(jìn)行ELISA檢測(cè)。ELISA 結(jié)果如表1，檢測(cè)說明表達(dá)產(chǎn)物pPIC9K-Bcsp31具有免疫學(xué)活性。
表1pPIC9K-Bcsp31的ELISA試驗(yàn)結(jié)果
標(biāo)準(zhǔn)陰性血清 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清
0.290 0.2560.271 1.110 1.033
0.275 0.271 0.330 .0.993 1.001
0.378 0.375 0.375 0.9850.912 ______
以上述3項(xiàng)試驗(yàn)均說明表達(dá)的bcsp31蛋白可與牛布魯氏菌陽性血清發(fā)生很 好的抗原-抗體反應(yīng)，bcsp31蛋白具有免疫活性，完全可以作為流產(chǎn)布魯氏菌疫 苗抗原蛋白。附基因序列表
<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
<120>布魯氏菌疫苗及疫苗用抗原蛋白的制備方法
<160> 2
<210> 1 <211> 35 <212> DNA <213>人工序列 <400>
cgcgaattca ccccacaggc cagaacattt ttccg 35
<210> 2 <211> 26 <212> DNA <213>人工序列 <400>
gctgcggccg ctttcagcac gcccgc 2權(quán)利要求
1、布魯氏菌疫苗，其特征在于疫苗所用的抗原蛋白為布魯氏菌bcsp31蛋白。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述布魯氏菌疫苗，其特征是疫苗所用的抗原蛋白為布 魯氏菌bcsp31重組蛋白。
3、 權(quán)利要求2所述疫苗用重組抗原蛋白的制備方法，其特征是以從布魯氏 菌提取的細(xì)菌總DNA為模板，根據(jù)布魯氏菌bcsp31基岡的核苷酸全序列設(shè)計(jì) 一對(duì)引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，克隆獲得bcsp31蛋白基因，然后轉(zhuǎn)入酵母表達(dá)載 體屮，獲得重組表達(dá)載體，將重組表達(dá)載體導(dǎo)入酵母表達(dá)細(xì)菌中，獲得重組畢 赤酵母表達(dá)菌，增殖并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)重組畢赤酵母表達(dá)菌，經(jīng)分離純化得到所 用的抗原蛋白。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗用重組抗原蛋白的制備方法，其特征是所用 的引物序列為P1: 5 ， 一 cgcgaattcaccccacaggccagaacatttttccg—3 ，(含EcoR I酉每切位點(diǎn)) Rl: 5，一gctgcggccgctttcagcacgcccgc—3，(含NotI酶切位點(diǎn))。
全文摘要
本發(fā)明公開家畜使用的抗布魯氏病的疫苗及這種疫苗所用的抗原蛋白的制備方法。本發(fā)明的布魯氏菌疫苗所用的抗原蛋白為布魯氏菌bcsp31蛋白，特別是布魯氏菌bcsp31重組蛋白。重組抗原蛋白的制備方法是以從布魯氏菌提取的細(xì)菌總DNA為模板，根據(jù)布魯氏菌bcsp31基因的核苷酸全序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，克隆獲得bcsp31蛋白基因，然后轉(zhuǎn)入酵母表達(dá)載體，獲得重組表達(dá)載體，再將其導(dǎo)入酵母表達(dá)細(xì)菌中，獲得重組畢赤酵母表達(dá)菌，增殖并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)重組畢赤酵母表達(dá)菌，經(jīng)分離純化得到所用的抗原蛋白。
文檔編號(hào)C12N15/81GK101607081SQ200910145908
公開日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2009年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月3日
發(fā)明者周繼章, 宮曉煒, 曹小安, 藺國(guó)珍, 邱昌慶, 鄭福英 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所