專利名稱：：包含結(jié)合Fc受體的多肽和抗原性多肽的用于介導(dǎo)免疫應(yīng)答的融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了用于在宿主內(nèi)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的免疫結(jié)合物(immunoconjugate)。更明確地，提供了包括結(jié)合Fc受體的多肽(其結(jié)合Fc受體)的融合蛋白，所述融合蛋白引起Fc受體和相關(guān)結(jié)合的融合蛋白的內(nèi)陷(internalisation)。所述融合蛋白在用于治療和預(yù)防由病原微生物(尤其是病毒病原體)引起的感染的方法中有特殊效用。
背景技術(shù)：
：獲得性免疫應(yīng)答通過兩種互補(bǔ)機(jī)制介導(dǎo)，包括可溶性分子尤其是免疫球蛋白的體液免疫，以及包括淋巴細(xì)胞尤其是T細(xì)胞的細(xì)胞免疫。免疫球蛋白的Fc結(jié)構(gòu)域已顯示具有效應(yīng)子功能，所述功能主要是補(bǔ)體結(jié)合和Fc受體(FcR)結(jié)合。Fc受體結(jié)合到免疫球蛋白的恒定區(qū)，并且已定義的許多受體#3人為介導(dǎo)輔助功能，包括調(diào)理作用(opsonisation)和ADCC(Daeron1997,M.AnnualReviewImmunology,15;203-234"Ravetch和Clynes,AnnualReviewofImmunology.1998.16:421-432)。當(dāng)結(jié)合不同的Fc受體時(shí)能介導(dǎo)不同的下游信號(hào)傳導(dǎo)。更具體地，當(dāng)結(jié)合一些Fc受體時(shí)顯示激活免疫應(yīng)答，而結(jié)合其他Fc受體時(shí)抑制免疫應(yīng)答。因此FcR已顯示激活或抑制免疫應(yīng)答，這取決于它們的胞質(zhì)區(qū)中存在的激活(ITAM)或承卩制(ITIM)基序(Daeron,M.AnnualReviewImmunology,15;203-234.1997)。先前的專利通過靶向抗原激活FcR的方式來尋求激活免疫應(yīng)答，所述方式通過使用含有抗FcR抗體的雙功能試劑實(shí)現(xiàn)(參閱例如WO96/40788)。這些試劑結(jié)合FcR但不誘導(dǎo)它們的內(nèi)陷，并且因此與加工和抗原遞呈有關(guān)(T.Keler等.2002JImmunol.165:6738-6742)。在結(jié)合具有充分地高度親合力情況下，F(xiàn)c受體內(nèi)陷由免疫球蛋白(通過Fc結(jié)構(gòu)域)與FcR的結(jié)合誘導(dǎo)(A.Yada等.2003CellImmunol225(1):p21-32,P.T.Harrison等.1994JBiolChem.269(39):24396-24402)。盡管這種結(jié)合相互作用能使用修飾的完整的免疫球蛋白來模擬，所述免疫球蛋白含有通過CDR-嫁接插入到可變區(qū)的外來序列(WO02/058728)，但并不清楚是否Fc結(jié)構(gòu)域是必需的和/或足以請導(dǎo)FcR的內(nèi)陷(P.T.Harrison等.1994JBiolChem.269(39):24396-24402,AYada等.2003CellImmunol225(1):p21-32)。此外，也不清楚關(guān)于是否Fc結(jié)構(gòu)域本身足以誘導(dǎo)FcR的內(nèi)陷。事實(shí)上，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域已廣泛地用于延長治療性蛋白的循環(huán)半衰期，并且關(guān)于細(xì)胞因子和其他免疫調(diào)節(jié)劑開發(fā)出多種Fc融合蛋白例如TNFR-Fc融合蛋白Etanerc印t(ENBRELTM)。繼廣泛的實(shí)驗(yàn)研究和創(chuàng)新思考之后，本發(fā)明人鑒定了在配體結(jié)合后內(nèi)陷FcR所需的因子。本發(fā)明的融合蛋白包括抗原性多肽序列和結(jié)合FcR的多肽。而且本發(fā)明的融合蛋白誘導(dǎo)針對抗原性序列的免疫應(yīng)答。選擇融合蛋白中提供的結(jié)合FcR的多肽使得它以足夠的結(jié)合親合力結(jié)合Fc受體，以至于發(fā)生Fc受體和所結(jié)合的融合蛋白的內(nèi)陷。FcR/免疫結(jié)合復(fù)合物的內(nèi)陷允許免疫結(jié)合物凈皮細(xì)胞的抗原加工途徑加工?？乖庸ひ鹈庖呓Y(jié)合物被破壞成片段，并且這些片段被遞呈到免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。當(dāng)所結(jié)合的Fc受體的內(nèi)陷沒有被誘導(dǎo)時(shí)，配體的結(jié)合僅形成通過Fc受體的胞質(zhì)部分介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。盡管這種信號(hào)傳導(dǎo)對免疫應(yīng)答有貢獻(xiàn)，但它不足以引起FcR內(nèi)陷，因此不會(huì)發(fā)生復(fù)合到FcR配體的任何抗原性肽的加工和遞呈。流感病毒是正黏病毒，其分為三種類型；A、B和C。A型流感病毒能根據(jù)它們的表面蛋白血球凝集素(HA或H)和神經(jīng)氨酸酶(NA或N)劃分為亞型。有14種已知的H亞型和9種已知的N亞型。所有H亞型已在禽中發(fā)現(xiàn)，然而僅有3種H亞型(H1、H2和H3)和2種N亞型(Nl和N2)被^Jt通常在人類中流行。人類中季節(jié)性流感流行(Seasonalinfluenzaepidemics)與血球凝集素和神經(jīng)氨酸酶蛋白中的抗原性位點(diǎn)中氨基酸改變有關(guān)，所述氨基酸改變在稱為'抗原性漂移，的過程進(jìn)行。主要的廣泛流行與引入新的血球凝集素和神經(jīng)氨酸酶基因(來自于動(dòng)物衍生的流感病毒)有關(guān)，在稱為'抗原性轉(zhuǎn)變，過程中通過再分布到達(dá)當(dāng)前流行的人類病毒的遺傳背景中。當(dāng)前，沒有針對H5N1的疫苗使用于人類。根據(jù)WHO,針對H5N1的2003抹開發(fā)的疫苗對于2004越南H5N1林不具有保護(hù)性。對于人類治療使用的疫苗的開發(fā)直到人對人可傳播林的出現(xiàn)才成為可能，并且這會(huì)花費(fèi)許多個(gè)月來準(zhǔn)備用于大范圍施用。相應(yīng)地，通過使用得自感染抹的疫苗來預(yù)防廣泛流行的流感，不是控制疾病傳播的可靠方法。因此，非常期望開發(fā)廣譜治療劑用以預(yù)防和治療多種流感抹和亞型的感染。本發(fā)明的發(fā)明人令人驚奇地提供了Fc蛋白-抗原融合蛋白免疫結(jié)合物，其能夠介導(dǎo)針對病原體(免疫結(jié)合物的抗原部分從其中衍生)的長期保護(hù)性免疫。針對病原體介導(dǎo)的免疫通過細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答誘導(dǎo)，其中所述應(yīng)答令人驚奇地在缺乏明顯的中和抗體應(yīng)答成分條件下介導(dǎo)。這是重要的，因?yàn)橥ǔＵJ(rèn)為免疫應(yīng)答的體液成分是必需的，其是為了使疫苗在施用該疫苗的受治療者中調(diào)節(jié)長期保護(hù)性免疫。本發(fā)明的融合蛋白能令人驚奇地誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答提供給受治療者不僅針對病原體的特異林，而且針對病原體的進(jìn)一步相關(guān)抹(其可以起因于例如突變或抗原性漂移)的保護(hù)性免疫。令人驚奇地，這種免疫的施與基本上在施用本發(fā)明融合蛋白免疫結(jié)合物的受治療者中沒有引起明顯的體液應(yīng)答，因此，抗體的產(chǎn)生和血清轉(zhuǎn)換基本上對于受治療者中抗病原體的長期保護(hù)性免疫沒有貢獻(xiàn)。本發(fā)明人鑒定了所述免疫結(jié)合物在針對感染性疾病、例如通過病毒病原體(例如HIV和尤其是流感病毒，其中例如抗原性轉(zhuǎn)變和抗原性漂移引起感染原變化的事件)介導(dǎo)的疾病病癥介導(dǎo)長期保護(hù)性免疫中有特殊效用。而且，所述免疫結(jié)合物在誘導(dǎo)針對病原體(顯示高度的序列突變和變化速率)的免疫應(yīng)答中也有特殊效用。
發(fā)明內(nèi)容9依照本發(fā)明的第一方面提供了一種融合蛋白，其包括一種或多種抗原性多肽序列和結(jié)合FC受體的多肽，所述結(jié)合FC受體的多肽以足以引起所結(jié)合Fc受體內(nèi)陷的結(jié)合親合力來結(jié)合Fc受體。術(shù)語"足以引起所結(jié)合Fc受體內(nèi)陷的結(jié)合親合力"是指配體以引起所結(jié)合的復(fù)合物內(nèi)陷入細(xì)胞的結(jié)合親合力來結(jié)合Fc受體。這導(dǎo)致本發(fā)明的結(jié)合的融合蛋白被細(xì)胞的抗原加工途徑加工。這又導(dǎo)致融合蛋白被破壞并且依靠主要組織相容性分子(MHC)使其陳列在細(xì)胞表面，這些MHC將肽片段遞呈到免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。如本文定義的，術(shù)語"內(nèi)陷"指細(xì)胞內(nèi)吞以及尤其是指受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞或Fc介導(dǎo)的吞噬作用。細(xì)胞內(nèi)吞是攝取大分子或顆粒到細(xì)胞中的過程。關(guān)于本發(fā)明，在Fc受體以足夠的親合力被配體結(jié)合而發(fā)生Fc受體和所結(jié)合配體內(nèi)陷的情況下，尤其發(fā)生內(nèi)陷。在一個(gè)實(shí)施方式中，為誘導(dǎo)內(nèi)陷，通常融合蛋白的結(jié)合Fc受體的多肽需要以從約10—6Kd至約10—9Kd的結(jié)合親合力解離速率常數(shù)來結(jié)合Fc受體。在另一個(gè)實(shí)施方式中結(jié)合Fc受體的多肽和Fc受體之間的結(jié)合親合力是在約1(TSKd至約10巧Kd之間。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明融合蛋白的結(jié)合Fc受體的多肽和Fc受體之間的結(jié)合速率常數(shù)，在從約lxlO6Ka至約3xl()9Ka之間。在某些實(shí)施方式中結(jié)合Fc受體的蛋白得自免疫3求蛋白(通常是人免疫球蛋白)的重鏈。通常免疫球蛋白是人免疫球蛋白IgG，而且相應(yīng)地結(jié)合Fc受體的蛋白能得自人IgG的重鏈，尤其是得自IgG亞型IgGl的重鏈或IgG亞型IgG3的重鏈。在某些另外的實(shí)施方式中，結(jié)合Fc受體的蛋白包括人免疫球蛋白IgGl的CH2恒定區(qū)或人免疫球蛋白IgG3的CH2恒定區(qū)。人IgGl或人IgG3的CH2恒定區(qū)也稱為CY2結(jié)構(gòu)域或C2結(jié)構(gòu)域，這種替代的命名得自被指定為y鏈的人IgG重鏈。在另外的實(shí)施方式中，具體而言，其中的結(jié)合Fc受體的蛋白得自人免疫球蛋白IgGl或人免疫球蛋白IgG3，存在于結(jié)合Fc受體的蛋白內(nèi)的C丫210結(jié)構(gòu)域的序列在第297位(N297)的天冬酰胺(Asn,N)殘基保有高度保守的N聯(lián)糖基化(N-linkedglycosylation)位點(diǎn)。所述殘基的糖基化在介導(dǎo)高親合力結(jié)合和激活Fc受體方面被鑒定為具有重要性。不希望受到理論限制，本發(fā)明人預(yù)測IgG重鏈C2恒定區(qū)中，在第297位殘基存在的糖基化殘基，促成了具有重要性的三級(jí)結(jié)構(gòu)，其允許結(jié)合Fc受體。具體而言，預(yù)測了更多的氨基酸殘基(其存在于CH2恒定區(qū)序列中)或其片段(其可能存在于融合蛋白的結(jié)合Fc受體的多肽內(nèi))在N297糖基化位點(diǎn)附近折疊，這引起N297殘基被局限于臨近殘基的內(nèi)部或基本上被臨近殘基包裹。這種折疊形成能被Fc受體結(jié)合的三級(jí)結(jié)構(gòu)。相應(yīng)地，在這個(gè)位置存在的糖基化殘基，在作為一種構(gòu)架中具有重要性，所述構(gòu)架允許結(jié)合Fc受體的多肽中更多氨基酸在那附近折疊。在合成序列中，在所述位置或在等同于這個(gè)位置的殘基中缺失糖基化殘基影響Fc受體結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可對編碼結(jié)合Fc受體的多肽的多核苷酸序列進(jìn)行定點(diǎn)誘變。這種誘變通過置換、添加或缺失而用以改變編碼序列。產(chǎn)生的多核苷酸序列的變化能改變結(jié)合Fc受體的親合力。本發(fā)明因此進(jìn)一步延伸至結(jié)合Fc受體的蛋白，其包括得自人免疫球蛋白IgG(通常是IgGl或IgG3亞型的IgG免疫球蛋白)的Cy2結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域在它的氨基酸序列中遭受至少一種突變。例如，所述突變可能關(guān)于在第298位絲氨酸殘基被丙氨酸殘基置換、和/或在第295位谷氨酰胺殘基被丙氨酸殘基置換。當(dāng)提供具有特異性突變的CH2結(jié)構(gòu)域序列時(shí)，可以從合成的基因構(gòu)建體編碼多核苦酸。相應(yīng)地在另外的不同的實(shí)施方式中，結(jié)合Fc受體的多肽包括CH2恒定區(qū)或其片段，所迷CH2恒定區(qū)或其片段包括在第297位的天冬酰胺殘基。所述序列可以進(jìn)一步包括在第298位的甘氨酸殘基和/或在第295位的丙氨酸殘基。所述序列可以進(jìn)一步包括在第234和235位的亮氨酸殘基。在另一個(gè)實(shí)施方式中結(jié)合Fc受體的多肽包括CH2恒定區(qū)或其片段，所述CH2恒定區(qū)或其片段包括在第297位的天冬酰胺殘基。所述序列可以進(jìn)一步包括在第298位的甘氨酸殘基和/或在第295位的丙氨酸殘基。在第234和235位的亮氨酸殘基。如本文參考和/或修飾的特異性氨基酸殘基的位置是指應(yīng)用于人IgG重鏈恒定區(qū)的殘基編號(hào)。通常，這種編號(hào)因而會(huì)涉及對氨基酸殘基規(guī)定的編號(hào)，所述氨基酸殘基存在于人免疫球蛋白IgG的CH2恒定區(qū)。應(yīng)理解本發(fā)明的結(jié)合Fc受體的蛋白可以包括CH2恒定區(qū)的片段、衍生物、類似物或變體。在這些情況下，應(yīng)用于存在于這種序列中的氨基酸殘基的編號(hào)可以改變，這取決于序列長度。相應(yīng)地，例如天冬酰胺殘基，其存在于所定義的CH2結(jié)構(gòu)域恒定區(qū)(例如得自Kabat數(shù)據(jù)庫)的第297位殘基，但所述天冬酰胺殘基可以與融合蛋白或結(jié)合Fc受體的多肽的氨基酸序列第297位殘基的位置無關(guān)。在這些情況下，應(yīng)可以理解技術(shù)人員將使用序列比對方法鑒定殘基位于結(jié)合Fc受體的多肽序列的什么位置，所述殘基等同于Kabat數(shù)據(jù)庫定義的人IgGCH2的第297位天冬酰胺殘基。如本文所應(yīng)用的，對于特定氨基酸(其是關(guān)于Fc受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域)規(guī)定的編號(hào)，M于所等同的殘基的編號(hào)，所述所等同的殘基是由得自Kabat數(shù)據(jù)庫序列的IgG重鏈恒定區(qū)定義。具體而言當(dāng)多肽是得自CH2恒定區(qū)或?yàn)槠淦螘r(shí)，相同情況作適當(dāng)變動(dòng)應(yīng)用于對于結(jié)合Fc受體的蛋白具有重要性的其他殘基，例如在第298位的絲氨酸殘基和/或在第295位的谷氨酰胺殘基。在一個(gè)實(shí)施方式中結(jié)合Fc受體的蛋白包括SEQIDNO:l的氨基酸序列。像這樣，所述實(shí)施方式的融合蛋白包括一種或多種抗原性多肽序列，連同含有SEQIDNO:l的氨基酸序列的結(jié)合Fc受體的多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合Fc受體的蛋白包括如SEQIDNO:l所顯示序列的片段、變體或衍生物，其中所述片段、變體或衍生物具有多肽(其含SEQIDNO:l的序列)的生物活性。SEQIDNO:1:EPGC[M1.1CeeCEME11CCEfA['IEEtfef[11^U-F1EB1CW"'、,'￡tE[Ee:\》:ev[c\e、t:wuef:eegwi'x.f\￡、11工tci:固w！fcp\￡:fMWEIEP1IS附KEF5EWIIEESFIEI1P、C'、5I"KIWC;FW^IME^具體而言，SEQIDNO:l詳述了一種多肽，其能結(jié)合Fc受體。所述序列能與為IgG重鏈恒定區(qū)鑒定的序列(如Kabat數(shù)據(jù)庫中SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(www.kabatdatabase.com)所定義的)的第216至447位殘基比對。以下述內(nèi)容為基礎(chǔ)SEQIDNO:l中第一氨基酸殘基被編號(hào)為第216位殘基、以及最后的殘基編號(hào)為笫447位殘基；然后可在第297位殘基提供天冬酰胺(Asn,N)殘基，其能被糖基化。SEQIDNO:l中在第415位殘基的甘氨酸殘基(G,Gly)代表了絲氨酸(S,Ser)殘基的置換，所述絲氨酸(S,Ser)殘基存在于Kabat數(shù)據(jù)庫定義的序列中。SEQIDNO:l進(jìn)一步包括了在第393位的丙氨酸(A,Ala)殘基，所述丙氨酸(A，Ala)殘基取代了在Kabat數(shù)據(jù)庫定義的序列中提供的蘇氨酸殘基(Thr,T)。SEQIDNO:l的序列可以進(jìn)一步突變使得在第298位的絲氨酸(Ser,S)殘基能被丙氨酸殘基(Ala,A)置換。此外，為了創(chuàng)造融合蛋白的突變體形式，所述融合蛋白包括SEQIDNO:l的序列(如結(jié)合Fc受體的多肽)，例如可以將SEQIDNO:l中在第234和235位殘基提供的兩個(gè)亮氨酸殘基分別突變成為如纈氨酸和丙氨酸的殘基，以削弱Fc受體結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以突變具有SEQIDNO:2序列的結(jié)合Fc受體的多肽，使得在第393位的丙氨酸(Ala,A)殘基改變?yōu)槿绱嬖谟贙abat數(shù)據(jù)庫序列中的蘇氨酸(Thr,T)殘基。SEQIDNO:2序列提供如下SEQIDNO:2:EXHm^E"'EW.:MFlPEFEEO〖、5"F"￡VLW工〖-GI附￡iK，IJEMIEP'II￡,GCfF￡K\HHE￡FCE11PKWIC:"PGEWS匸1服￡SISC:CE￡mI511EE'、IES.CGSEE工，iSM1\[FGFKCG"￡SCS\H￡MFm"I^l<￡II￡:!EI*相應(yīng)地在另一個(gè)實(shí)施方式中，結(jié)合Fc受體的蛋白包括如SEQIDNO:2顯示的序列。像這樣，所述實(shí)施方式的融合蛋白包括一種或多種抗原性多肽序列，以及含有SEQIDNO:2的氛基酸序列的結(jié)合Fc受體的多肽。仍舊在另一個(gè)實(shí)施方式中，結(jié)合Fc受體的蛋白包括如SEQIDNO:2顯示序列的片段、變體或衍生物，其具有含SEQIDNO:2的多肽的生物活性。SEQIDNO:2的序列可以進(jìn)一步突變使得在第298位的絲氨酸(Ser,S)殘基被丙氨酸殘基(Ala,A)置換。此外，為了創(chuàng)造融合蛋白的突變體形式，所述融合蛋白包括SEQIDNO:2的序列(如結(jié)合Fc受體的多肽)，例如可以將SEQIDNO:2中在第234和235位殘基提供的兩個(gè)亮氨酸殘基分別突變成為如纈氨酸和丙氨酸的殘基，以削弱Fc受體結(jié)合。圖5顯示SEQIDNO:l與人IgG重鏈恒定區(qū)的第216至447位殘基的序列比對，后者的序列稱為SEQIDNO:3。在某些另外的實(shí)施方式中，結(jié)合Fc受體的多肽包括CY2結(jié)構(gòu)域的片段、類似物或衍生物，所述CY2結(jié)構(gòu)域得自人免疫球蛋白IgG，通常是IgGl、IgG2或IgG3。在某些另外的實(shí)施方式中，結(jié)合Fc受體的多肽除了包括SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或得自人免疫球蛋白IgG的C^2結(jié)構(gòu)域外，可以進(jìn)一步包括另外的恒定區(qū)和/或4交鏈區(qū)，所述恒定區(qū)例如但不限于C/3恒定區(qū)，所述鉸鏈區(qū)例如包括存在于Cy2和Cy3恒定區(qū)之間、富含脯氨酸的氨基酸段的鉸鏈，所述鉸鏈區(qū)對結(jié)合Fc受體的多肽賦予結(jié)構(gòu)靈活性。通過共價(jià)鍵方式可以將一種或多種抗原性多肽序列連接到例如SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的結(jié)合Fc受體的多肽?？蛇x"^奪地可以使用非共價(jià)鍵。在另外的實(shí)施方式中，連接體部分或間隔區(qū)可以用于連接所述序列。通常結(jié)合Fc受體的多肽能夠結(jié)合到Fc受體FqRI(CD64)和/或結(jié)合到Fc受體FcyRII(CD32),和/或結(jié)合到Fc受體FcyRIII(CD16)。在某些實(shí)施方式中，結(jié)合Fc受體的多肽能夠結(jié)合到FcR，是通過在它的跨膜序列中的鹽橋耦合到FcR的y鏈。如本文所描述的術(shù)語"抗原性多肽序列"是指當(dāng)其被施用到受治療者時(shí)，其針對所述多肽序列誘導(dǎo)長期保護(hù)性免疫應(yīng)答的多肽?？乖远嚯目梢詮娜魏芜m合的來源得到，例如病原微生物或肺瘤特異抗原，或能從非病原性疾病得到，例如自身免疫性疾病或神經(jīng)變性疾病?？乖噪目梢缘米詢?nèi)源性正常蛋白的鑒定，所述內(nèi)源性正常蛋白與給定病癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。在這些情況下，能使用全蛋白或其片段、類似物或衍14生物。在某些另外的實(shí)施方式中，抗原性多肽序列選自由病毒多肽、細(xì)菌多肽、腫瘤特異性多肽和免疫調(diào)節(jié)性多肽組成的組。所述多肽可以是完全蛋白、其片段或類似物，或者蛋白或多肽的衍生物。適合的抗原性多肽是病毒多肽，其中所述病毒選自由mv-i、HIV-2、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和A型流感病毒組成的組。其中當(dāng)所述病毒多肽得自禽流感病毒，所述多肽可以得自A型流感病毒，所述A型流感病毒選自由H5N1、H9N2、H7N1、H7N2、H7N3和H7N7組成的組。在某些另外的實(shí)施方式中，可對編碼抗原性多肽的多核苷酸序列進(jìn)行定點(diǎn)誘變。這種方法具有引入所期望的遺傳改變的額外優(yōu)點(diǎn)，所述遺傳改變例如除去抗原性蛋白中蛋白酶切割位點(diǎn)或可變環(huán)。例如除去流感病毒HA中HA1/2切割位點(diǎn)或HIVgpl20中的環(huán)，會(huì)產(chǎn)生誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的融合蛋白，所述免疫應(yīng)答重新定向到這些抗原的較穩(wěn)定的區(qū)域。在另外的實(shí)施方式中，完全通過化學(xué)合成能生產(chǎn)引入上述突變的抗原性多肽序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中抗原性肽可以由多于一種基因的產(chǎn)物組成，例如異源融合抗原的產(chǎn)物，所述異源融合抗原例如基因融合物HIVtat/rev、流感病毒HA/NA或結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)Ag85/ESAT-6或Rvl025/1196TB。所述異源融合抗原可以進(jìn)一步通過化學(xué)合成生產(chǎn)。相應(yīng)地在另外的實(shí)施方式中抗原性多肽包括抗原性多肽片段，所述抗原性多肽片段包括含有2個(gè)或更多的抗原性多肽的融合物。所述的2個(gè)或更多的抗原性多肽可以得自相同的病原體，或得自不同的病原體。例如在某些實(shí)施方式中，抗原性多肽包括HIV的tat和rev多肽或其片段的融合物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗原性多肽包括血球凝集素(HA或H)和神經(jīng)氨酸酶(NA或N)或其片段(例如得自流感病毒)的融合物。仍舊在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗原性多肽可以包括結(jié)核病Ag85/ESAT-6或Rvl025/1196基因編碼的多肽的融合物。仍舊在另外的實(shí)施方式中，能合成地例如通過化學(xué)合成而生產(chǎn)異源的抗原性多肽。適合的化學(xué)合成技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，包括但不限于標(biāo)準(zhǔn)液相或固相肽合成方法。在另外的實(shí)施方式中，抗原性多肽是T細(xì)胞表位。所述T細(xì)胞表位可以是病原體表位或非病原體表位。在所有的實(shí)施方式中，T細(xì)胞表位應(yīng)適合于當(dāng)向受治療者施用時(shí)介導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。在某些實(shí)施方式中，融合蛋白進(jìn)一步包括一種或多種另外的異源多肽，例如免疫調(diào)節(jié)性肽(例如細(xì)胞因子)。本發(fā)明另一方面提供了一種免疫原性組合物，其包括本發(fā)明第一方面的融合蛋白。在某些另外的實(shí)施方式中，免疫原性組合物進(jìn)一步包括佐劑。在另一方面，本發(fā)明延伸至一種在受治療者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括步驟為以足以引起免疫應(yīng)答的量，向受治療者施用本發(fā)明上述方面的免疫原性組合物。通常，所述免疫應(yīng)答是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTU應(yīng)答。在另一方面，本發(fā)明提供了，編碼本發(fā)明第一方面的融合蛋白的多核苷酸序列或者編碼至少一種多肽的多核苷酸序列，所述多肽是本發(fā)明第一方面的融合蛋白的組分。在一個(gè)實(shí)施方式中，多核苷酸編碼具有SEQIDNO:l或SEQIDNO:2氨基酸序列的氨基酸。所述氨基酸能此后連接到至少一種抗原性肽片段、以形成本發(fā)明的融合蛋白。本發(fā)明的另一方面提供了一種載體，所述載體包括至少一種編碼本發(fā)明融合蛋白或其多肽的多核苷酸序列。適當(dāng)?shù)厮鲚d體包括至少一種控制序列元件，其可操作地連接到至少一種多核苷酸序列。所述控制元件通常依賴于所述載體在其中被表達(dá)的細(xì)胞系進(jìn)行選擇。仍舊在本發(fā)明的另一方面提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包括本發(fā)明的載體或多核苷酸序列或融合蛋白。仍舊在本發(fā)明的另一方面提供了依照本發(fā)明產(chǎn)生融合蛋白的方法，所述方法包括在適合于產(chǎn)生融合蛋白的條件下孵育細(xì)胞或載體的步驟，所述細(xì)胞包括多核苷酸，其編碼含有一種或多種抗原性多肽序列和結(jié)合Fc受體的多肽的融合蛋白，所述結(jié)合Fc受體的多肽以足以引起所結(jié)合Fc受體內(nèi)陷的結(jié)合親合力來結(jié)合FC受體，所述載體包括所述多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方式中所述結(jié)合Fc受體的多肽包括SEQIDNO:l的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中所述結(jié)合Fc受體的多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸序列。依照本發(fā)明的另一方面提供了在受治療者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括如下步驟-提供一種融合蛋白，所述融合蛋白包括一種或多種抗原性多肽序列和結(jié)合Fc受體的多肽，所述結(jié)合Fc受體的多肽以足以引起所結(jié)合Fc受體內(nèi)陷的結(jié)合親合力來結(jié)合Fc受體，以及-向受治療者施用治療有效量的所述融合蛋白，在所述受治療者中期望得到針對所述抗原性多肽或其片段而誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。疫應(yīng)答，所述方法進(jìn)一步包括的步驟為-獲得源自病原體的抗原性多肽序列，其是所述疾病的成因或者是得自所述病原體的產(chǎn)物。-使用所述抗原性多肽序列以形成本發(fā)明第一方面的融合蛋白，以及-向需要該治療的受治療者施用治療有效量或預(yù)防有效量的含有融合蛋白的組合物。通?？乖远嚯氖堑米约?xì)菌病原體、病毒病原體、寄生蟲病原體或原生動(dòng)物病原體。在另外的實(shí)施方式中所述方法進(jìn)一步延伸至為治療非病原性疾病病癥而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，所述方法進(jìn)一步包括的步驟為-獲得對于非病原性疾病病癥特異性的抗原性多肽序列，-使用所述抗原性多肽序列以形成融合蛋白，以及-向需要該治療的受治療者施用治療有效量或預(yù)防有效量的含有融合蛋白的組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中融合蛋白包括結(jié)合Fc受體的多肽，所迷結(jié)合Fc受17體的多肽包括SEQIDNO:l的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中結(jié)合Fc受體的多肽包括含有SEQIDNO:2的氨基酸序列的結(jié)合Fc受體的多肽。通常非病原性抗原性多肽選自由肺瘤特異性多肽、對于神經(jīng)變性疾病具有特異性的多肽和對于自身免疫性疾病具有特異性的多肽組成的組。適合的免疫應(yīng)答是細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方式中，受治療者是哺乳動(dòng)物。在另外的實(shí)施方式中所述哺乳動(dòng)物是人。通常靜脈內(nèi)、皮下或月幾內(nèi)施用融合蛋白，由于這些組織含有表達(dá)Fc受體的樹突狀細(xì)胞、并且進(jìn)一步所述組織缺乏高水平的血清IgG(其可能竟?fàn)幗Y(jié)合Fc受體)時(shí)，優(yōu)選這些途徑。依照本發(fā)明的另一方面提供了一種在受治療者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括的步驟為在允許表達(dá)所述多核苷酸并且產(chǎn)生所述融合蛋白的條件下，施用治療有效量的多核香酸或基因遞送載體到受治療者的細(xì)胞，從而激發(fā)對于所述融合蛋白的免疫應(yīng)答，所述多核苷酸或基因遞送載體編碼依照本發(fā)明第一方面的融合蛋白。適合地，免疫應(yīng)答是細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方式中，受治療者是哺乳動(dòng)物。在另一個(gè)實(shí)施方式中所述哺乳動(dòng)物是人。通常地，皮下、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)施用基因遞送載體。在某些另外的實(shí)施方式中，其中所述受治療者的細(xì)胞以多核苷酸或基因遞送載體轉(zhuǎn)染，所述轉(zhuǎn)染是間接體內(nèi)進(jìn)行并且所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞隨后再引入到受治療者中。在一種替代方式中，在體內(nèi)所述受治療者的細(xì)胞被多核苷酸或基因遞送載體轉(zhuǎn)染。仍舊在本發(fā)明的另一方面提供了一種用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的藥物組合物，其中所述藥物組合物包括融合蛋白連同藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體18或稀釋劑，所述融合蛋白包括一種或多種抗原性多肽序列和結(jié)合FC受體的多肽，所述結(jié)合Fc受體的多肽以足以引起所結(jié)合Fc受體內(nèi)陷的結(jié)合親合力來結(jié)合Fc受體。在一個(gè)實(shí)施方式中所述結(jié)合Fc受體的多肽包括SEQIDNO:l的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中所述結(jié)合Fc受體的多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸序列。本發(fā)明的另一方面提供了一種用作藥物的融合蛋白，所迷融合蛋白包括一種或多種抗原性多肽序列和結(jié)合Fc受體的多肽，所述結(jié)合Fc受體的多肽以足以引起所結(jié)合Fc受體內(nèi)陷的結(jié)合親合力來結(jié)合Fc受體。在一個(gè)實(shí)施方式中所述結(jié)合Fc受體的多肽包括SEQIDNO:l的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中所述結(jié)合Fc受體的多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸序列。仍舊在本發(fā)明的另一方面提供了融合蛋白用于制備治療和/或預(yù)防疾病的藥物的用途，所述融合蛋白包括一種或多種抗原性多肽序列和結(jié)合Fc受體的多肽，所述結(jié)合Fc受體的多肽以足以引起所結(jié)合Fc受體內(nèi)陷的結(jié)合親合力來結(jié)合Fc受體。在一個(gè)實(shí)施方式中所述結(jié)合Fc受體的多肽包括SEQIDNO:l的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中所述結(jié)合Fc受體的多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸序列。在某些實(shí)施方式中所述疾病是病原性疾病。在這些情況下，通常病原性疾病是病毒感染，例如fflV-l、HIV-2、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或流感病毒的感染。在病毒感染是A型流感病毒的情況下，亞型可以選自H5N1、H9N2、H7N1、H7N2、H7N3和H7N7。在另外的實(shí)施方式中所述疾病是非病原性疾病，例如但不限于癌性或惡性病癥、神經(jīng)變性疾病和自身免疫性疾病。通常地，所述藥物的使用產(chǎn)生了細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答的誘導(dǎo)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥物進(jìn)一步包括佐劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，以肌內(nèi)或皮內(nèi)施用而提供所述藥物。通常地，所述藥物是疫苗，其能^皮預(yù)防性地施用，以在受治療者中針對病原體(融合蛋白的抗原性多肽片段從其中衍生)介導(dǎo)長期保護(hù)性免疫。通常地，所述藥物是疫苗，其能被治療性地施用，以在受治療者中針對癌性病癥(免疫結(jié)合物的抗原性多肽片段從其中衍生，所述抗原性多肽是腫瘤特異性抗原)介導(dǎo)長期保護(hù)性免疫。在某些實(shí)施方式中，所述疾病是病毒感染，例如但不限于fflV-l、HIV-2、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或流感病毒的感染。仍舊在本發(fā)明的另一方面提供了編碼融合蛋白的多核苷酸用于制備治療和/或預(yù)防疾病的藥物的用途，所述融合蛋白包括一種或多種抗原性多肽序列和結(jié)合Fc受體的多肽，所述結(jié)合Fc受體的多肽以足以引起所結(jié)合Fc受體內(nèi)陷的結(jié)合親合力來結(jié)合Fc受體。通常地，所述藥物的使用產(chǎn)生了細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答的誘導(dǎo)。本發(fā)明人也確定，本發(fā)明的融合蛋白可以連同其他治療劑施用，以預(yù)防和/或治療疾病。例如，一種包括依照本發(fā)明的融合蛋白的組合物可以與至少一種另外的治療劑聯(lián)合施用，其中在該融合蛋白中的抗原性多肽是得自感染性病毒的病毒多肽，所述組合物進(jìn)一步包括至少一種藥學(xué)上可接受的載體，所述另外的治療劑具有對于病毒感染發(fā)生的預(yù)防和/或治療效應(yīng)。上述內(nèi)容提供了聯(lián)合治療，其關(guān)于病毒感染方面有益，所述病毒感染具有特別高的致病性。相應(yīng)地，本發(fā)明的另一方面提供了一種預(yù)防和/或治療受治療者中微生物感染的方法，所述方法包括的步驟為；-提供一種包括融合蛋白的組合物，所述融合蛋白包括一種或多種抗原性多肽序列和結(jié)合Fc受體的多肽，所述結(jié)合Fc受體的多肽以足以引起所結(jié)合Fc受體內(nèi)陷的結(jié)合親合力來結(jié)合Fc受體，-向需要該治療的受治療者施用治療有效量的所述組合物，以及-進(jìn)一步施用治療有效量的、適合的第二種抗微生物化合物(anti-microbialcompound)。在一個(gè)實(shí)施方式中，第二種抗微生物化合物是連同融合蛋白施用，然而，在另外的實(shí)施方式中，第二種抗微生物化合物可以是在施用融合蛋白之前施用或者在施用融合蛋白之后施用。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗原性多肽得自病毒病原體并且第二種化合物是抗病毒化合物。所述第二種抗病毒化合物可以選自包括利巴韋林、金剛烷胺、金剛乙胺、奧塞米韋(TAMIFLUTM)和扎那米韋的組。在一個(gè)實(shí)施方式中，多肽(抗原性多肽)得自A型流感病毒。在另外的實(shí)施方式中，A型流感病毒是H5N1、H9N2、H7N2、H7N3或H7N7的才朱。仍舊在另外的實(shí)施方式中，A型流感病毒可以包括H5、H7或H9亞型的血球凝集素連同任何神經(jīng)氨酸酶亞型。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗原性多肽得自肝炎病毒。在另外的實(shí)施方式中，肝炎病毒是乙型肝炎病毒并且優(yōu)選的抗病毒化合物是拉米夫定(lamuvidine)。仍舊在另一個(gè)實(shí)施方式中，肝炎病毒是丙型肝炎病毒并且優(yōu)選的抗病毒化合物選自利巴韋林和白細(xì)胞介素2(IL-2)或其組合。依照本發(fā)明的仍舊另一方面提供了本發(fā)明的融合蛋白和抗病毒化合物在制備用于治療或預(yù)防A型流感病毒亞型H5、H7或H9感染的聯(lián)合藥物中的用途。在一個(gè)實(shí)施方式中A型流感病毒亞型是H5N1、H9N2、H7N1、H7N2、H7N3或H7N7的抹。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，第二種抗病毒化合物可以選自包括利巴韋林、金剛烷胺、金剛乙胺、奧塞米韋(TAMIFLUTM)或扎那米韋的組。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的融合蛋白可以作為藥物施用，其在中斷性抗病毒治療進(jìn)度(interruptiveanti-viraltherapyschedule)中與抗病毒化合物聯(lián)合。仍舊在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽扼合物可以作為藥物施用，其在HIV/AIDS的中斷性抗病毒治療中與三聯(lián)療法(triple-therapy)的抗病毒化合物聯(lián)合。除非上下文另有要求，本發(fā)明每個(gè)方面和實(shí)施方式的優(yōu)選的特征，包括對其他方面根據(jù)情況作適當(dāng)變動(dòng)的每一種。圖1顯示的曲線圖顯示了關(guān)于依照實(shí)施例3的方案免疫的動(dòng)物的體重減輕數(shù)據(jù)，圖2顯示FACS分析的結(jié)果，其顯示融合蛋白與人THP-1細(xì)胞上的Fc受體的結(jié)合，圖3顯示FACS分析的結(jié)果，其顯示融合蛋白與RAW細(xì)胞(小鼠樹突狀細(xì)胞)上的Fc受體的結(jié)合，圖4顯示FACS分析的結(jié)果，其顯示融合蛋白與人THP-1細(xì)胞上的Fc受體的結(jié)合，以及圖5顯示序列比對，其顯示SEQIDNO:l的tt酸序列(*表示靠上的序列)，與如得自Kabat數(shù)據(jù)庫的IgG的重鏈恒定區(qū)的第216至447位殘基(SEQIDNO:3)("表示靠下的序列)的比較。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供融合蛋白和相關(guān)的結(jié)合的復(fù)合物，所述融合蛋白包括結(jié)合Fc受體的蛋白，所述結(jié)合Fc受體的蛋白以足以引起Fc受體內(nèi)陷的結(jié)合親合力來結(jié)合Fc受體。Fc受體內(nèi)陷允許有效的抗原遞呈以刺激T細(xì)胞應(yīng)答。與胞飲作用刺激輔助性T細(xì)胞應(yīng)答相比，F(xiàn)c受體內(nèi)陷明顯地更有效。然而，本發(fā)明人令人驚奇地顯示，F(xiàn)c受體連同相關(guān)抗原的內(nèi)陷能形成有效的抗原加工，其不僅能產(chǎn)生輔助性T細(xì)胞應(yīng)答，而且能產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)通過直接細(xì)胞毒性作用以及通過向其他免疫細(xì)胞提供特異性和非特異性輔助作用，靶向和破壞患病的或異常細(xì)胞，所迷其他免疫細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和其他類型的細(xì)胞。本發(fā)明的結(jié)合FC受體的融合蛋白的內(nèi)陷顯示激發(fā)針對所述融合蛋白內(nèi)提供的抗原或抗原性片^R的特異性CTL應(yīng)答。這因此提供了關(guān)于誘導(dǎo)長期保護(hù)性免疫應(yīng)答的有效方法，其中所述保護(hù)性免疫應(yīng)答是期望針對例如感染性疾病、癌性病癥和3申經(jīng)變性疾病的病癥。本發(fā)明的融合蛋白可以通過主要的氨基酸序列ABC定義，其中A指一種或多種抗原性多肽序列，B是任選的連接體部分并且C是結(jié)合Fc受體的多肽，所述結(jié)合Fc受體的多肽以足以引起所結(jié)合Fc受體內(nèi)陷的結(jié)合親合力來結(jié)合Fc受體。在一個(gè)實(shí)施方式中，A定義為多肽的N末端(氨基)部分并且C定義為多肽的C末端(羧基)末端。在這樣一個(gè)實(shí)施方式中，如果連接體用于結(jié)合A和C，連接體就會(huì)結(jié)合到定義為抗原性多肽片段的氨基酸序列的C末端，并且結(jié)合到定義為結(jié)合Fc受體的多肽的氨基酸序列的N末端。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，融合蛋白的結(jié)合Fc受體的多肽得自人免疫球蛋白的Fc部分的至少一種恒定區(qū)，通常是CH2結(jié)構(gòu)域或其變體。特別優(yōu)選得自人免疫球蛋白的恒定區(qū)。不同種類的人免疫球蛋白適合于提供免疫結(jié)合物的結(jié)合Fc受體的多肽?？贵w的種類或"同種型"通過其重鏈定義。具體而言，最優(yōu)選IgG同種型的免疫球蛋白，然而IgA、IgM、IgE和IgD同種型的抗體在本發(fā)明的各種另外的實(shí)施方式中也可以應(yīng)用。通常，融合蛋白的結(jié)合Fc受體的多肽得自人抗體，通常是IgG同種型的抗體。IgG有許多亞類，例如IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3。每種IgG亞類均具有很高水平的同源性的恒定區(qū)，然而在鉸鏈區(qū)每種同種型有明顯區(qū)別。適當(dāng)?shù)?，使用得自人免疫球蛋白IgGl重鏈的Oy2恒定區(qū)，或其片段、類似物或衍生物。盡管IgG的任何亞類在本發(fā)明中均可應(yīng)用，然而，通常使用得自IgG亞類IgG3的序列，所述序列編碼至少一種恒定區(qū)或其片段。本發(fā)明人也鑒定IgG3抗體的結(jié)構(gòu)也特別適合于本發(fā)明，其是由于擴(kuò)展的鉸鏈區(qū)的存在?？贵w的4交鏈區(qū)通常位于CH1恒定區(qū)和CH2恒定區(qū)之間，并且^皮認(rèn)為提供給抗體結(jié)構(gòu)的靈活性，以促進(jìn)被抗體的Fab部分結(jié)合?？贵w的恒定區(qū)在指導(dǎo)免疫應(yīng)答，以及具體而言在效應(yīng)子功能的募集中具有重要性，所述效應(yīng)子功能在抗體結(jié)合之后介導(dǎo)免疫應(yīng)答。結(jié)合抗體之后誘導(dǎo)的效應(yīng)子功能的類型取決于重鏈的恒定區(qū)，尤其是CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。在抗病原體的持續(xù)保護(hù)中，從免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)應(yīng)答以提供長期保護(hù)性免疫的能力具有重要性。這種應(yīng)答的一種固有的部分是結(jié)合和激活FcR。FcR存在于免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞，例如抗原遞呈細(xì)胞，以及具體而言巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、NK細(xì)胞和小結(jié)樹突細(xì)胞。配體結(jié)合到FcR產(chǎn)生許多效應(yīng)子機(jī)理的激活，例如補(bǔ)體激活、ADCC(抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)和免疫介質(zhì)(例如細(xì)胞因子)的釋放。Fc受體具有抗體類型特異性和同種型選擇性。本發(fā)明的實(shí)效在于本發(fā)明的融合蛋白以足夠高的結(jié)合親合力結(jié)合FcR的能力，以誘導(dǎo)所結(jié)合的FcR內(nèi)陷入表達(dá)所述FcR的細(xì)胞。這種結(jié)合產(chǎn)生了許多效應(yīng)子機(jī)理的激活，例如釋;^文免疫介質(zhì)例如趨化因子和細(xì)胞因子。如在上文中討論的，在FcR以足夠高的結(jié)合親合力(結(jié)合親和力)被配體結(jié)合的情況下，F(xiàn)cR的結(jié)合也能產(chǎn)生FcR的內(nèi)陷。也能夠上調(diào)抗原遞呈，這樣產(chǎn)生了細(xì)胞對于融合蛋白增強(qiáng)的攝取和遞呈，所述細(xì)胞表達(dá)Fc受體。已知有三類FcR具有對于IgG的結(jié)合特異性，每一種均具有歸于此的(ascribedthereto)特殊功能。FcyRI(也稱為CD64)存在于巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞表面。FcyRII(CD32)在B細(xì)胞、巨虔細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞表面表達(dá)。最后地，F(xiàn)cyRIII(CD16)由巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表達(dá)。對于其他抗體同種型具有特異性的FcR包括FceRI和FcsRII，其由B細(xì)胞、單核細(xì)胞和小結(jié)樹突細(xì)胞表達(dá)，并且其具有對于lgEFc部分的特異性；FcoR，其具有對于IgAFc部分的特異性，以及FcpR，其具有對于IgMFc結(jié)構(gòu)域的特異性。相應(yīng)地，在一個(gè)實(shí)施方式中，免疫結(jié)合物的結(jié)合Fc受體的多肽部分能夠結(jié)合至少一種Fc受體，所述Fc受體選自包括FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)或FcyRIII(CD16)的組。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，結(jié)合Fc受體的24多肽能夠結(jié)合FcyRI(CD64)和FcyRIII(CD16)。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，結(jié)合Fc受體的多肽能夠結(jié)合FcR，這是通過它們的跨膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)的鹽橋耦合到FcRy鏈。通常，本發(fā)明的免疫結(jié)合物的Fc部分主要包括(iscomprisedof)定義為IgGl抗體的CH2恒定區(qū)的氨基酸序列或其變體或片段。具體而言，CH2恒定區(qū)或其變體或片段(也指的是作為CH2恒定區(qū)),可以得自人IgGl抗體的重鏈?？蛇x擇地，本發(fā)明的融合蛋白的Fc部分主要包括定義為IgG3抗體的CH2恒定區(qū)的氨基酸序列或其變體或片段。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，CH2恒定區(qū)(也指的是作為C2恒定區(qū))，得自人IgG3抗體的重鏈。在某些另外的實(shí)施方式中，結(jié)合Fc受體的多肽包括SEQIDNO:l的氨基酸序列。仍舊在另一個(gè)實(shí)施方式中，結(jié)合Fc受體的多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸序列。多肽(編碼結(jié)合Fc受體的多肽)可以通過重組方法獲得，或者可選擇地可以合成地生產(chǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，免疫球蛋白分子經(jīng)蛋白酶水解之后可以獲得結(jié)合Fc受體的結(jié)構(gòu)域，例如通過木瓜蛋白酶水解免疫球蛋白。通過本領(lǐng)域已知的任何方法包括化學(xué)鍵，抗原性肽可以任何方法耦合到Fc。例如，結(jié)合能包括使用化學(xué)交聯(lián)分子，例如使用異雙功能交聯(lián)劑(heterobifunctionalcrosslinkingagent)，例如琥珀酰亞胺酯，例如3-(2-二硫代吡咬基)丙酸酯或者琥珀酰亞胺硫代乙酰乙酸酯(succinimidy1acetylthioacetate)(MolecularProbesInc.Handbook,第5章，第5,3部分)。通過與其他化學(xué)部分形成共價(jià)的或聚集的結(jié)合物，抗原性多肽片段可被修飾以產(chǎn)生衍生物，所述其他化學(xué)部分例如糖基基團(tuán)、聚乙二醇(PEG)基團(tuán)、脂質(zhì)、磷酸酯和乙酰基及類似物。通過連接化學(xué)部分到氨基酸側(cè)鏈或者在抗原性多肽的N末端或C末端的官能團(tuán)，能夠制備本發(fā)明的多肽的共價(jià)衍生物。適合地，抗原性多肽A得自病原微生物。可選擇地，抗原性多肽A得自負(fù)責(zé)病原性加工的蛋白質(zhì)，所述病原性加工引起宿主的疾病或病變(illnessordisease)。抗原性多肽A可以進(jìn)一步得自病原體，所述病原體是感染性疾病的成因?？蛇x擇地，抗原性多肽A得自負(fù)責(zé)病原性加工的蛋白質(zhì)，所述病原性加工引起宿主的疾病或病變。此外，抗原性多肽A可以得自分泌的產(chǎn)物或其他感染原，所述分泌的產(chǎn)物或其他感染原得自病原微生物。抗原性多肽可以進(jìn)一步是合成的。關(guān)于產(chǎn)生這種合成的蛋白質(zhì)的技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是廣泛知曉的。在另外的實(shí)施方式中，抗原性多肽可以是病毒肽、細(xì)菌多肽、腫瘤特異性多肽、對于神經(jīng)變性疾病具有特異性的多肽、對于自身免疫性疾病具在另外的實(shí)施方式中，抗原性肽或其片段是T細(xì)胞表位。T細(xì)胞表位能夠使用已知算法預(yù)測或者作為肽合成，并且能夠使用標(biāo)準(zhǔn)T細(xì)胞測定而篩選。鑒定的T細(xì)胞表位可以是細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位，并且可以具有優(yōu)選的從9至20個(gè)氨基酸的氨基酸長度。仍舊在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗原性多肽得自分泌的產(chǎn)物或其他感染原，所述分泌的產(chǎn)物或其他感染原得自病原微生物。具體而言，分泌的產(chǎn)物可以得自細(xì)菌病原體，并且分泌的產(chǎn)物選自由殺白細(xì)胞素、鏈球菌溶血素S、鏈球菌溶血素O、NAD酶、透明質(zhì)酸酶、鏈激酶和致熱性外毒素組成的組。在一個(gè)實(shí)施方式中，感染性疾病由微生物病原體引起。在另一個(gè)實(shí)施方式中，感染性疾病由細(xì)菌病原體引起。在另一個(gè)實(shí)施方式中，感染性疾病由真菌病原體引起。在另一個(gè)實(shí)施方式中，感染性疾病由病毒病原體引起。在另一個(gè)實(shí)施方式中，感染性疾病由肺瘤特異性病原體引起。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗原性片段是病毒多肽。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗原性多肽片段得自流感病毒的抹，其能在人類中引起感染。通常，抗原性片段是血球凝集素(HA或H)或其片段，其得自A型流感病毒的感染性抹。可選擇地，抗原性片段是A型流感病毒的HA3組分。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗原性多肽可以得自A型禽流感病毒。通過H5、H7或H9亞型的血球凝集素的存在，可以確定A型禽流感病毒。在另外的實(shí)施方式中，A型流感病毒是H5N1、H9N2、H7N1、H7N2、H7N3或H7N7的抹。仍舊在另外的實(shí)施方式中，A型流感病毒可以包括H5、H7或H9亞型的血球凝集素連同任何神經(jīng)氨酸酶亞型。在另一個(gè)實(shí)施方式中感染性疾病是肝炎，具體而言其是由丙型肝炎病毒引起。仍舊在另一個(gè)實(shí)施方式中感染性疾病是肝炎，具體而言其是由乙型肝炎病毒引起。仍舊在另一個(gè)實(shí)施方式中感染性疾病是HIV,其是由HIV-1或HIV-2逆轉(zhuǎn)錄病毒引起。在另外的實(shí)施方式中，抗原性多肽可以得自任何病原體，宿主被所述病原體感染后其中至少一種抗原介導(dǎo)免疫應(yīng)答。這種病原體具體而言指的是作為'感染原，或'感染性疾病，的組，并且可以是病毒感染性疾病，其選自但不限于包括流感、鼻病毒(普通感冒)、冠狀病毒(例如嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(SARS)冠狀病毒)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如HIV)、人乳頭瘤病毒、天花、狂犬病、風(fēng)滲、肝炎、單純皰滲病毒、帶狀皰滲病毒、病毒性腦膜炎、黃熱病、西尼羅病、雞痘(水痘)和口^帝疫病毒(FMDV)的組?？乖远嚯目梢赃M(jìn)一步得自細(xì)菌感染性疾病，其選自但不限于由結(jié)核病、傷寒、炭疽、細(xì)菌性腦膜炎、霍亂、白喉、淋病、軍團(tuán)桿菌病、鉤端螺旋體病(leptispirosis)、李斯特菌病、MRSA感染和百日咳組成的組?？乖远嚯目梢赃M(jìn)一步得自寄生蟲感染性疾病，其選自但不限于由利什曼病、癥疾和錐蟲病、真菌感染性疾病例如腳褲和念珠菌病、朊病毒感染性疾病例如牛海綿樣腦病和Creutzfeldt-Jakob病(CJD)組成的組。仍舊在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗原性片段可以得自負(fù)責(zé)發(fā)病機(jī)制的宿主蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)包括但不限于，在Alzheimer's病中引起發(fā)病機(jī)制的淀粉狀蛋白質(zhì)、牽涉在煙堿成癮性中的煙酸受體和牽涉在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中的膽固醇轉(zhuǎn)移酶CTEP。本發(fā)明的融合蛋白在治療癌性或惡性病癥中有進(jìn)一步的效用。施用給受治療者本發(fā)明的包括肺瘤特異性抗原的融合蛋白之后產(chǎn)生的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答的誘導(dǎo)，提供了一種治療方法，當(dāng)以治療有效量施用給需要這種治療的受治療者時(shí)，所述治療方法能夠明顯地抑制腫瘤細(xì)胞的生長。融合蛋白、編碼融合蛋白的多肽或者包含編碼融合蛋白的多肽的載體，可以連同佐劑向受治療者施用。佐劑可以與融合蛋白同時(shí)施用，或者與融合蛋白依序地施用。佐劑的作用是非特異地刺激受治療者的免疫系統(tǒng)。依照本發(fā)明的方法可以提供的佐劑，包括但不限于明礬、MF59、QUIL-A(QuilA皂苷)、解毒物(detox)、ISCOM、細(xì)胞因子、鯊烯、多元醇、多聚陰離子、肽、蛋白質(zhì)、氫氧化鋁、普盧蘭尼克(pluronic)、油脂和乳劑?？乖远嚯目梢栽谒腘-(氛基)末端或C-(羧基)末端與結(jié)合Fc受體(FcR)的多肽結(jié)合。然而通常地是，編碼抗原性多肽的氨基酸序列設(shè)在免疫結(jié)合物的氨基(N)末端區(qū)域，而關(guān)于編碼結(jié)合FcR的多肽的氨基酸序列設(shè)在免疫結(jié)合物的羧基末端。上述表示為A和C的第一和第二序列，可以通過任何適當(dāng)?shù)募夹g(shù)結(jié)合，但是通常通過共價(jià)鍵連接。然而也可以使用非共價(jià)鍵?？蛇x擇地，能夠直接結(jié)合或能通過連接部分或間隔區(qū)的方式結(jié)合多肽序列?？梢允褂眠B接體部分例如得自免疫球蛋白的4交鏈區(qū)。鉸鏈區(qū)作用不僅是連接定義為抗原性多肽的氨基酸、與定義為免疫結(jié)合物的結(jié)合FcR的多肽的氨基酸，而且提供給免疫結(jié)合物增加的靈活性，靈活性能夠給予改善的結(jié)合特異性。通常，連接體主要充當(dāng)間隔區(qū)。通常連接體主要包括通過肽鍵連接在一起的氨基酸。連接體例如可以包括1至20個(gè)氨基酸。適當(dāng)?shù)剡B接體可以包括空間上無阻隔的氨基酸殘基，例如甘氨酸和丙氨酸。連接體部分的適合的形式在下文中描述。定義免疫結(jié)合物的抗原性片段的tt酸，可以以它的N-(氛基)末端或C-(羧基)末端連接到連接體部分。適合的結(jié)合和連接技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是廣泛知曉的，并且可以包括例如，利用Fc多肽的半胱氨酸殘基通過硫代酸酯交聯(lián)的結(jié)合?？蛇x擇地，所述結(jié)合能包括化學(xué)交聯(lián)分子的使用，例如使用異雙功能交聯(lián)劑，例如琥珀酰亞胺酯，例如3-(2-二硫代吡咬基)丙酸酯或者琥珀酰亞胺硫代乙酰乙酸酯(MolecularProbesInc.Handbook,第5章，第5.3部分)。在抗原性片段與結(jié)合Fc的多肽的結(jié)合中可具有效用的進(jìn)一步的技術(shù)包括，已公布的國際專利申請第WO94/04690和WO96/27011號(hào)中描述的技術(shù)。以遺傳方法通過重組DNA技術(shù)的使用可進(jìn)一步獲得結(jié)合，所述方法和技術(shù)是本領(lǐng)域廣泛知曉的，例如那些在Sambrook等的教導(dǎo)中闡述的。在MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版.第1巻，第1.101-104頁，ColdSpringHarborLaboratoryPress,(1989)和F,M.Ausubel等.CurrentProtocolsinMolecularBiology,編輯.J.WileyPress(2006)中，其相關(guān)部分通過引用并入本文。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過使用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中的抗原性區(qū)域和結(jié)合Fc的多肽的、連續(xù)的基因融合體(contiguousgenefusion)，產(chǎn)生融合蛋白。在某些實(shí)施方式中，基因可以包括編碼包括SEQIDNO:l的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。在另外的實(shí)施方式中，基因可以編碼包括SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽序列?，F(xiàn)已確定結(jié)合Fc受體的多肽的糖基化具有重要性，以促進(jìn)Fc受體的結(jié)合，其結(jié)合是以足夠的結(jié)合親合力誘導(dǎo)Fc受體內(nèi)陷。具體而言，如在上文中提及的，其中結(jié)合Fc受體的多肽得自人IgGl，優(yōu)選具有Cy2恒定區(qū)第297位的天冬酰胺(ASN,N)殘基的N-連接的糖基化(如參考IgG的重鏈恒定區(qū)的序列所定義的，所述IgG從Kabat數(shù)據(jù)庫中定義)，如在上文中描述的，因?yàn)檫@個(gè)殘基的糖基化已知在介導(dǎo)高親合力結(jié)合和Fc受體的激活中具有重要性。像這樣，本發(fā)明另外的方面延伸至在一種細(xì)胞類型中產(chǎn)生結(jié)合Fc受體的多肽，其允許所述多肽經(jīng)過翻譯后修飾使得其被糖基化。在某些實(shí)施方式中，結(jié)合Fc受體的蛋白可此后結(jié)合到連接體部分和/或至少一種抗原性多肽片段，或者可選擇地，融合蛋白可以在糖基化的細(xì)胞中完整的表達(dá)。相應(yīng)地，仍舊在本發(fā)明的另一方面^是供了產(chǎn)生融合蛋白的方法，所述方法包括的步驟為-在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)結(jié)合Fc受體的多肽，其以足以引起所結(jié)合Fc受體內(nèi)陷的結(jié)合親合力來結(jié)合FC受體，所述細(xì)胞能糖基化其表達(dá)的多肽，以及-在所述細(xì)胞中進(jìn)一步表達(dá)至少一種抗原性多肽或其片段。在一個(gè)實(shí)施方式中結(jié)合Fc受體的多肽包括SEQIDNO:l的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中結(jié)合Fc受體的多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，從連續(xù)的多核苷酸序列(核酸序列)表達(dá)結(jié)合Fc受體的蛋白和抗原性片段，所述連續(xù)的多核苷酸序列可以描述為融合基因。從框架內(nèi)編碼結(jié)合Fc受體的蛋白的多核苦酸序列中除去終止密碼子，并且結(jié)合編碼抗原性多肽或其片段的多核苷酸序列，可以形成融合基因。多核苷酸可以在載體中提供，其中多核苷酸序列的表達(dá)可操作地與控制元件連接，在細(xì)胞中所述控制元件具有表達(dá)的相容性。所述方法可進(jìn)一步包括在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)多核苷酸的步驟，所述多核苷酸定義為連接體部分或間隔區(qū)，其中所述連接體部分或間隔區(qū)連接結(jié)合Fc受體的多肽和抗原性多肽。盡管本發(fā)明的融合蛋白以單體形式提供，在另外的實(shí)施方式中，可以以二聚體融合分子提供融合蛋白，這由兩種融合蛋白的二聚作用形成。產(chǎn)生的二聚體可以是同源二聚體，其包括具有完全相同的抗原性多肽的2種融合蛋白?？蛇x擇地，二聚體可以是異源二聚體，其通過結(jié)合具有不同的抗原性多肽的2種融合蛋白形成。在融合蛋白顯示不同的抗原性多肽的情況下，所述抗原性多肽可得自不同的病原微生物，或者可以得自相同的病原微生物或病原性產(chǎn)物的不同耙位點(diǎn)?？蛇x擇地，除病原微生物外，抗原性多肽可以得自例如如本文描述的非病原性疾病病癥和癌性病癥的來源。在本發(fā)明的另外的實(shí)施方式中，可以以多聚體分子提供融合蛋白。這種多價(jià)體融合蛋白可以使用結(jié)合Fc的區(qū)域形成，所述結(jié)合Fc的區(qū)域得自抗體的Fc區(qū)域或其部分，所述抗體通常呈現(xiàn)多價(jià)體形式，例如IgM(五聚體結(jié)構(gòu))或IgA(二聚體結(jié)構(gòu))類的抗體。在多價(jià)體融合蛋白分子形成的情況下，所述融合蛋白可以包括相似的或不同的抗原性多肽。仍舊在另外的實(shí)施方式中，融合蛋白可以由此進(jìn)一步結(jié)合分子或化合物，所述分子或化合物可以在介導(dǎo)或增強(qiáng)免疫應(yīng)答中具有效用。被配體結(jié)合后監(jiān)控Fc受體是否內(nèi)陷的方法和技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是廣泛知曉的。例如，可以獲得Fc受體/融合蛋白結(jié)合的復(fù)合物的內(nèi)陷的顯像，其是通過使用例如細(xì)胞的免疫熒光或免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記的技術(shù)實(shí)現(xiàn)，所述技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是廣泛知曉的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，熒光蛋白區(qū)域融合到結(jié)合Fc的多肽，以顯像結(jié)合并且鑒定適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合Fc受體的肽。這樣的內(nèi)陷篩選可用于鑒定結(jié)合Fc受體的蛋白，其以引起Fc受體/結(jié)合Fc受體的多肽的復(fù)合物內(nèi)陷的足夠的親合力來結(jié)合Fc受體。盡管可以使用任何適合的抗原遞呈細(xì)胞進(jìn)行這種研究，但是優(yōu)選使用樹突狀細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，熒光蛋白區(qū)域融合到Fc結(jié)構(gòu)域序列中，以顯像結(jié)合并且鑒定適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合FcR的片段，所述適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合FcR的片段對于多肽免疫結(jié)合物具有效用。施用本發(fā)明的融合蛋白可以單獨(dú)施用但優(yōu)選作為藥物組合物施用，所迷藥物組合物通常包括適合的藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體，其取決于預(yù)期的給藥途徑進(jìn)行選擇。適合的藥學(xué)載體的例子包括水、甘油、乙醇及類似物。經(jīng)由任何適合的途徑本發(fā)明的融合蛋白可以向需要該治療的患者施用。如本文詳述的，優(yōu)選通過皮下的、皮內(nèi)的或肌內(nèi)的途徑的方式腸胃外地施用組合物，以加強(qiáng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答的發(fā)展。施用的途徑可以進(jìn)一步包括粘膜(包括肺)和口腔。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合物是作為可注射的組合物遞送。對于靜脈內(nèi)注射，有效成分為腸胃外可接受的水溶液形式，其是無熱原的并且具有適合的pH、等滲性和穩(wěn)定性。使用例如等滲賦形劑例如，氯化鈉注射液、Ringer's注射液或乳酸鹽Ringer's注射液，本領(lǐng)域相關(guān)的技術(shù)人員能夠制備適合的溶液。如果需要，可以包括防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其他添加劑。用于治療或預(yù)防疾病的有效量的組合物，可以在單次劑量方案(singledosageregimen)或多次劑量方案(multi-doseregimen)中提供。施用組合物也可以經(jīng)由微球、脂質(zhì)體、其他的微粒給藥系統(tǒng)或持續(xù)釋放制劑，其置于某些組織中包括血液。上文提及的技術(shù)和方案以及依照本發(fā)明可以使用的其他技術(shù)和方案的例子,能在Remington'sPharmaceuticalSciences,第18片反，Gennaro,A.R.,LippincottWilliams&Wilkins;第20版ISBN0-912734-04-3和PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems;Ansel,H.C.等.第7版ISBN0-683305-72-7中發(fā)現(xiàn)，其公開的全部內(nèi)容通過引用并入本文。劑量和劑量方案優(yōu)選以"治療有效量"施用組合物到個(gè)體，這足以對施用該組合物的個(gè)體顯示益處。實(shí)際施用的劑量、施用的速度和時(shí)程將取決于，并且能參考后述的因素而決定被治療病癥的性質(zhì)和嚴(yán)重度，以及因素例如被治療患者的年齡、性別和體重以及施用的途徑。進(jìn)一步應(yīng)考慮的是關(guān)于組合物的性質(zhì)，例如其結(jié)合活性和在體內(nèi)血漿中的壽命，制劑中融合蛋白的濃度，以及遞送的途徑、位點(diǎn)和速度。劑量方案能包括本發(fā)明組合物單次施用的劑量，或組合物多次施用的劑量。組合物能進(jìn)一步地與其他治療劑和藥物依序地或單獨(dú)地施用，所述其他治療劑和藥物用于治療施用本發(fā)明的融合蛋白所治療的病癥。當(dāng)施用本發(fā)明的融合蛋白時(shí)，適當(dāng)?shù)?，可以利用從約10ng/kg/天至1mg/kg/天的劑量范圍。優(yōu)選以"治療有效量"施用本發(fā)明的融合蛋白到個(gè)體，這足以顯示對個(gè)體的益處。在感染性疾病的情況下，益處會(huì)包括減少感染或疾病癥狀。在其他疾病情況下，益處會(huì)包括減少疾病癥狀。實(shí)際施用的量，以及施用的速度和時(shí)程，取決于被治療病癥的性質(zhì)和嚴(yán)重度。治療的處方例如劑量的確定等，最終由全科醫(yī)師和其他醫(yī)生負(fù)責(zé)并酌情處理，而且通?？紤]被治療的疾病、患者個(gè)體的情況、遞送的部位、施用的方法和執(zhí)業(yè)醫(yī)生已知的其他因素。32融合蛋白的一個(gè)例子是通過重組方法從2種或更多的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。通常，這可通過產(chǎn)生融合基因，在框架內(nèi)從編碼第一個(gè)蛋白質(zhì)的DNA序列中除去終止密碼子，并且添加第二個(gè)蛋白質(zhì)的DNA序列而獲得。如果需要能加入進(jìn)一步的蛋白質(zhì)。然后細(xì)胞表達(dá)DNA序列為單獨(dú)的蛋白質(zhì)。在另外的實(shí)施方式中，融合蛋白的多肽能彼此獨(dú)立地表達(dá)，并隨后結(jié)合形成融合蛋白。例如，融合蛋白的抗原性多肽組分可以直接得自病原微生物、癌性細(xì)胞或類似物，并且這種多肽被結(jié)合到融合蛋白的結(jié)合Fc受體的多肽。在另外的實(shí)施方式中，抗原性多肽片段是較大的多肽的片段，其得自病原微生物或癌性細(xì)胞，或此外其可從熱休克蛋白中分離，其中抗原性肽片段結(jié)合到熱休克蛋白中，形成熱休克蛋白-抗原性肽片段復(fù)合物。在本發(fā)明的融合蛋白或肽(其有助于在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生)通過重組或另外的方式產(chǎn)生的情況下，優(yōu)選以分離的和純化的形式提供肽或融合蛋白。所述分離的和純化的形式通常包括，融合蛋白或肽是游離的或基本上從物質(zhì)中游離出來，所述物質(zhì)與融合蛋白或肽在其產(chǎn)生的細(xì)胞中相關(guān)。當(dāng)通過重組方法制備時(shí)，為促進(jìn)融合蛋白的純化，融合蛋白可進(jìn)一步含有結(jié)合配體的序列，例如His-標(biāo)記、FLAG-標(biāo)記或GST-標(biāo)記，其可以通過連接體的方式結(jié)合，所述連接體包括蛋白酶或化學(xué)試劑的切割位點(diǎn)，其能夠釋放2個(gè)獨(dú)立的蛋白質(zhì)實(shí)體。本發(fā)明融合蛋白的產(chǎn)生表達(dá)、分離和純化本發(fā)明的多肽，可以通過任何適當(dāng)?shù)募夹g(shù)完成，包括但不限于下述內(nèi)容包含DNA的表達(dá)載體可用于制備本發(fā)明的融合蛋白或融合蛋白的至少一種肽組分。產(chǎn)生融合蛋白或肽的方法包括，在促進(jìn)肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞然后從培養(yǎng)物中回收所表達(dá)的肽，所述重組表達(dá)載體編碼本發(fā)明的融合蛋白或肽組分。技術(shù)人員已知純化所表達(dá)的多肽的方法可根據(jù)一些因素變化，這些因素例如所使用的宿主細(xì)胞的類型，以及被宿主細(xì)胞分泌的肽是否是細(xì)胞內(nèi)、膜結(jié)合或可溶性的形式。33可以使用任何適合的表達(dá)系統(tǒng)。載體包括編碼本發(fā)明的融合蛋白或肽的DNA(多核苷酸序列)，其可操作地連接到適合的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)性的核苷酸序列，所述調(diào)節(jié)性的核苷酸序列例如得自哺乳動(dòng)物、禽、微生物、病毒或昆蟲基因的序列。調(diào)節(jié)性序列的例子包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、操縱基因或增強(qiáng)子，mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)，以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始和終止的適當(dāng)?shù)男蛄小．?dāng)調(diào)節(jié)性序列的功能涉及DNA序列時(shí)可操作地連接核苷酸序列。因此，如果啟動(dòng)子核苷酸序列控制DNA序列的轉(zhuǎn)錄，就可操作地將啟動(dòng)子核苷酸序列連接到DNA序列。復(fù)制起點(diǎn)和選擇基因通常整合到表達(dá)載體中，所述復(fù)制起點(diǎn)在期望的(大腸桿菌)宿主細(xì)胞中賦予復(fù)制的能力，所述選擇基因可用于鑒定轉(zhuǎn)化體。此外，編碼適當(dāng)信號(hào)肽的序列(天然的或異源的)能整合到表達(dá)載體中。關(guān)于信號(hào)肽的DNA序列(分泌性導(dǎo)引部分)在框架內(nèi)可以融合到本發(fā)明的核酸序列中，使得所述DNA起始轉(zhuǎn)錄和mRNA翻譯，形成包括信號(hào)肽的融合蛋白。信號(hào)肽在預(yù)期的宿主細(xì)胞中具有促進(jìn)肽的細(xì)胞外分泌的功能。在翻譯過程中信號(hào)肽從肽中切除，但允許從細(xì)胞分泌融合蛋白或肽。本發(fā)明肽表達(dá)的適合的宿主細(xì)胞包括原核生物、高等的真核細(xì)胞和酵母。原核細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞，以及尤其是CHO細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和COS細(xì)胞被特別優(yōu)選用作宿主細(xì)胞。描述了對于哺乳動(dòng)物、酵母、真菌、原核和昆蟲細(xì)胞宿主而使用的、適當(dāng)?shù)目寺『捅磉_(dá)載體，例如在Pouwels等.CloningVectors:ALab.Manual,Elsevier,NewYork,(1986)(ISBN0444904018)和CurrentProtocolsinMolecularBiology,編輯.F.M.Ausubel等，J.WileyPress(2006)，其公開的內(nèi)容通過引用并入本文。相應(yīng)地，能獲得本發(fā)明的融合蛋白，其通過轉(zhuǎn)化載體(其包括編碼融合蛋白的多核苷酸序列)到宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)宿主細(xì)胞使得多肽(其被多核苷酸編碼)被表達(dá)并且從宿主細(xì)胞回收多肽，或者在分泌信號(hào)附加到蛋白質(zhì)的情況下在周圍的培養(yǎng)基中回收。用于產(chǎn)生本發(fā)明的融合蛋白的、關(guān)于適合的宿主細(xì)胞的進(jìn)一步的詳細(xì)內(nèi)容在下文提供。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性微生物。用于轉(zhuǎn)化的適合的原核宿主細(xì)胞包括例如，大腸桿菌、枯草桿菌、鼠傷寒沙門氏菌，以及在假單胞菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬內(nèi)的各種其他種類。在原核宿主細(xì)胞中例如大腸桿菌，多肽可包括N-末端甲硫氨酸(met)殘基，以促進(jìn)在原核宿主細(xì)胞中重組多肽的表達(dá)。N-末端Met可以從所表達(dá)的重組多肽中切除。在原核宿主細(xì)胞中使用的表達(dá)載體通常包括一種或多種表型上可選擇的才示i己基因(phenotypicselectablemarkergene)。表型上可選擇的才示i己基因例如是，編碼賦予抗生素抗性的蛋白質(zhì)的基因或編碼提供自養(yǎng)需求的蛋白質(zhì)的基因。編碼本發(fā)明的多肽免疫結(jié)合物的DNA,可以克隆到框架內(nèi)普通的細(xì)菌表達(dá)載體的多個(gè)克隆位點(diǎn)。理想地，所述載體含有在克隆位點(diǎn)上游的可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，以使誘導(dǎo)物的加入導(dǎo)致在期望時(shí)間產(chǎn)生高水平的重組蛋白。關(guān)于重組蛋白的表達(dá)，細(xì)菌細(xì)胞在生長培養(yǎng)基中繁殖，直到達(dá)到預(yù)定的吸光度。然后誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)。然后進(jìn)行純化和再折疊，其使用本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛知曉的技術(shù)。也可使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲宿主細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)表達(dá)重組多肽。這些系統(tǒng)具有的優(yōu)點(diǎn)是，其產(chǎn)生的多肽會(huì)經(jīng)受翻譯后修飾例如糖基化，并且當(dāng)其4皮施用時(shí)其可產(chǎn)生蛋白質(zhì)的更高的生物穩(wěn)定性。關(guān)于在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的桿狀病毒系統(tǒng)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是廣泛知曉的。此外，也已知建立了哺乳動(dòng)物來源的細(xì)胞系，例如猴腎細(xì)胞的COS-7細(xì)胞系和中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。描述了關(guān)于引入DNA到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的已建立的方法。用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)載體的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列能從病毒基因組切除。也可以使用另外的控制序列，其顯示改善了哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中外源基因的表達(dá)。本發(fā)明的融合蛋白可進(jìn)一步在酵母宿主細(xì)胞中表達(dá)，優(yōu)選地從酵母菌屬(例如啤酒酵母)，Hansuela或畢赤酵母屬，或者在其他的真菌表達(dá)系統(tǒng)例如曲霉中表達(dá)。酵母轉(zhuǎn)化方案對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。一個(gè)這樣的方案在Hinnen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1929,1978.中描述。35關(guān)于宿主細(xì)胞的任何類型對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，純化重組多肽或片段的方法會(huì)不同，其根據(jù)因素例如所使用的宿主細(xì)胞的類型，以及是否重組多肽或片段^皮分泌到培養(yǎng)基中。通過測定其"同一性百分比"能對比兩種或多種多核苷酸序列。同樣地，通過測定其"同一性百分比"能對比兩種或多種多肽序列。兩種氨基酸序列或兩種核酸序列的同一性百分比，可以通過為最佳對比目的而進(jìn)行的序列比對(例如為了序列的最佳比對，在第一個(gè)序列中引入間隙)來測定，和可以通過對比在相應(yīng)位置的氨基酸殘基或核苷酸來測定。"最佳的比對"是形成最高同一性百分比的兩種序列的序列比對。通過在^皮對比的序列中同一性氨基酸殘基或核苷酸的數(shù)量，確定同一性百分比(即同一性％=同一性位置的數(shù)量/位置的總數(shù)量x100)。本發(fā)明進(jìn)一步延伸至依照本發(fā)明的融合蛋白，其中的結(jié)合Fc受體的蛋白含有氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:1或2的氨基酸序列具有至少90%同一性、至少95%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、或至少98%同一性、至少99%同一性、至少99.5%同一性或者至少99.9%同一性。通常所述同源性序列顯示多肽的生物功能，所述多肽具有SEQIDNO:l或2的氨基酸序列。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的數(shù)學(xué)算法能完成兩種序列間的同一性百分比的測定。NBLAST和XBLAST程序是執(zhí)行這種算法的計(jì)算機(jī)程序的例子。核苷酸BLAST搜索能以NBLAST程序進(jìn)行，以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列。蛋白質(zhì)BLAST搜索能以XBLAST程序進(jìn)行，以獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了對比目的能利用GappedBLAST以獲得帶間隙的序列比對。可選擇地，能使用PSI-Blast進(jìn)行迭代搜索，其檢測分子間的遠(yuǎn)緣關(guān)系(distantrelationship)(Idem.)。在使用BLAST、GappedBLAST和PSI-Blast程序情況下，能使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。參閱URLhttp:〃www.ncbi.nlm.nih.gov。能利用進(jìn)一步的適合的基于計(jì)算機(jī)的算法程序，并且其對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。由于遺傳密碼已知的簡并性，其中多于一種密碼子能夠編碼相同的氨基酸，編碼本發(fā)明的融合蛋白或多肽組分的多核苦酸序列可在其序列中產(chǎn)生變化，并且仍然編碼具有相同氨基酸序列的多肽，如未改變的多核苷酸序列編碼的一樣。這種變體DNA序列能從同義突變產(chǎn)生(例如發(fā)生在PCR擴(kuò)增期間)，或者能是天然序列準(zhǔn)確誘變(deliberatemutagenesis)的產(chǎn)物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸分子還包括與天然序列具有至少80%同一性的核香酸序列，所述天然序列編碼本發(fā)明的融合蛋白或其多肽組分，例如含有SEQIDNO:l或2的氨基酸結(jié)合序列的、結(jié)合Fc受體的多肽。同樣包括一些實(shí)施方式，其中的核苷酸分子包括與融合蛋白或多肽組分具有至少90%同一性、至少95%同一性、至少98%同一性、至少99%同一性或至少99.9%同一性的序列。除非另有說明，本文使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語，在本發(fā)明的
技術(shù)領(lǐng)域：
中通常具有可被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的含義。貫穿本發(fā)明說明書，除非上下文另有說明，術(shù)語"包括(comprise)"或"包含(include)，，或者變體例如'包含(comprises)，或'含有(comprising)'，'包括(includes)，或'包含(including)，可理解為，指含有陳述的整體或者整體的組，但不排除任何其他的整體或整體的組。除非上下文清楚地另有說明，如本文使用的術(shù)語"一種(a)"、"一個(gè)(an)"和"所述(the)"包括單數(shù)和復(fù)數(shù)。因此，例如，所提及的"一種活性劑"或"一種藥學(xué)上的活性劑"包括一種活性劑以及二種或更多的不同的活性劑的組合，以及當(dāng)提及"一種載體"時(shí)，其包括二種或更多的載體的混合物，也包括一種載體，等等。用以描述本發(fā)明的融合蛋白的多肽組分的命名，按照常規(guī)慣例進(jìn)行，其中在每個(gè)氨基酸殘基中氨基(N)出現(xiàn)在左端，羧基在右端。如使用于本文的表述"氨基酸"預(yù)期包括天然的和合成的氨基酸，以及D和L氨基酸。合成的氨基酸還包括化學(xué)修飾的氨基酸，包括但不限于鹽以及tt酸衍生物例如酰胺。存在于本發(fā)明多肽內(nèi)的氨基酸能被曱基化、酰胺化和乙酰化修飾，或者能用其他的化學(xué)基團(tuán)取代，所述化學(xué)基團(tuán)能改變循環(huán)半衰期而無不利地影響其生物活性。本文使用的術(shù)語"肽"、"多肽"和"蛋白質(zhì)"可互換地描述了一系列的至少二個(gè)氨基酸，其通過肽鍵或修飾的肽鍵例如電子等排體共價(jià)連接。氨基酸的最大數(shù)量沒有設(shè)置限制，其可包括肽或蛋白質(zhì)。術(shù)語"寡聚體"和"寡肽"也預(yù)期用來指本文描述的肽。此外，術(shù)語多肽延伸至肽的片段、類似物和衍生物，其中所迷片段、類似物或衍生物保持了和該片段、類似物或衍生物衍生來源的肽相同的生物功能活性。此外如本文使用的術(shù)語"融合蛋白"也能用來指融合多肽、融合肽或類似物，或者也可以指免疫結(jié)合物。術(shù)語"融合蛋白，，指一種分子，其中二種或更多的亞基分子(通常是多肽)被共價(jià)或非共價(jià)的連接。如本文使用的術(shù)語"治療有效量"指本發(fā)明融合蛋白降低下述疾病嚴(yán)重程度和/或緩解下述疾病所需的量病原性疾病、癌性病癥、或者例如疾病——自身免疫性疾病或神經(jīng)變性疾病或其至少一種癥狀；或者用于預(yù)防下述疾病的發(fā)展所需的量病原性疾病、癌性病癥、或者例如疾病——自身免疫性疾病或神經(jīng)變性疾病或一種或多種與其相關(guān)的癥狀。如本文使用的術(shù)語"預(yù)防有效量"涉及組合物的量，所述量是用于在施用本發(fā)明的化合物后，在受治療者中預(yù)防下述疾病的初發(fā)、發(fā)展或復(fù)發(fā)所需的量病原性疾病、癌性病癥、或者例如疾病——自身免疫性疾病或神經(jīng)變性疾病或其至少一種癥狀。如本文4吏用的術(shù)語"治療(treatment)"和相關(guān)的術(shù)語例如"治療(treat)"和"療法(treating)，，指減弱下述疾病的發(fā)展、嚴(yán)重度和/或持續(xù)時(shí)間，或改善其至少一種癥狀病原性疾病、癌性病癥、或者例如疾病——自身免疫性疾病或神經(jīng)變性疾病，其中所述減少或改善是施用本發(fā)明融合蛋白的結(jié)果。術(shù)語"治療"因此指能有益于受治療者的任何方案。治療可以是關(guān)于現(xiàn)有病癥或可以是預(yù)防性的(預(yù)防治療)。治療可以包括治愈、緩解或預(yù)防效果。本文涉及的"治療性"和"預(yù)防性"治療要考慮其最廣泛的范圍。術(shù)語"治療性"不是必須指受治療者被治療到完全康復(fù)。相似地，"預(yù)防性，，不是必須指受治療者最終不會(huì)感染疾病病癥。如本文使用的術(shù)語"受治療者"指動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物并且尤其是人。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，受治療者是哺乳動(dòng)物尤其是人，其已經(jīng)或?qū)⒁┞队诜派?，例如放射治療例如化學(xué)療法或放射療法。術(shù)語"受治療者"與如本文使用的術(shù)語"患者"可互換。如本文定義的融合蛋白或多肽的片段通常指一段序列，其包括至少5至7個(gè)連續(xù)的氨基酸，經(jīng)常包括至少約7至9個(gè)連續(xù)的氨基酸，通常包括至少約9至13個(gè)連續(xù)的氣基酸，更優(yōu)選包括至少約20至30或更多連續(xù)的氨基酸，并且最優(yōu)選包括至少約30至40或更多連續(xù)的氨基酸。如本文定義的多肽的"衍生物"或"變體"，例如SEQIDNO:l、SEQIDNO:3或定義本發(fā)明融合蛋白的那些，指通過改變多肽的氨基酸序列而修飾的多肽，例如通過操縱編碼多肽的核酸或通過改變多肽自身。天然氨基酸序列的這種衍生物可以包括插入、添力口、缺失和/或置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸，優(yōu)選地同時(shí)提供具有千擾素a結(jié)合活性的肽。通常這種衍生物包括插入、添加、缺失和/或置換25個(gè)或更少的氨基酸，更優(yōu)選15個(gè)或更少，甚至更優(yōu)選10個(gè)或更少，仍舊更優(yōu)選4個(gè)或更少并且最優(yōu)選僅1個(gè)或2個(gè)氨基酸。如廣泛理解的是，氨基酸水平的同源性通常是指氨基酸的相似性或同一性。相似性允許'保守性變異，，例如置換一個(gè)疏水性殘基，例如用異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或曱硫氨酸置換另一殘基，或者用一個(gè)極性殘基置換另一殘基，例如用賴氨酸和谷氨酸置換天冬氨酸，或者用谷氨酰胺置換天冬酰胺。在本發(fā)明的范圍內(nèi)進(jìn)一步提供非模擬肽(Non-peptidemimetic)。相應(yīng)地，變體與未改變的多肽序列相比優(yōu)選具有至少80%同一性，最優(yōu)選至少90%同一性的氨基酸序列。例如通過使用GAP計(jì)算機(jī)程序(6.0版)對比序列信息，可以測定同一性百分比，所述GAP計(jì)算機(jī)程序由Devereux等.(Nucl.AcidsRes.12:387,1984)描述，并且能從UniversityofWisconsinGeneticsComputerGroup(UWGCG)獲得。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，融合蛋白的結(jié)合Fc受體的多肽的衍生物，能結(jié)合FcR并且足以誘導(dǎo)其內(nèi)陷。如果需要純化多肽，融合蛋白可以進(jìn)一步含有Fc結(jié)構(gòu)域的結(jié)合A蛋白和G蛋白的區(qū)域，或者結(jié)合其他配體的序列，例如His-標(biāo)記或GST-標(biāo)記。參照下述實(shí)施例現(xiàn)在描述本發(fā)明，實(shí)施例的提供是為了說明的目的，39而不是預(yù)期不當(dāng)?shù)叵拗票景l(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1-免疫結(jié)合物的產(chǎn)生對于含有流感病毒血球凝集素(HA)作為抗原性片段的、免疫結(jié)合物(融合蛋白)的產(chǎn)生，HA基因從病毒標(biāo)準(zhǔn)品(viralstandard)中使用PCR擴(kuò)增，并且克隆到含有Fc基因片段的適合的表達(dá)載體作為融合蛋白，所述病毒標(biāo)準(zhǔn)品從NationalInstituteofBiologicalStandardsandControl,PottersBar(NIBSC)中獲得。在puc-基礎(chǔ)的載體pAcVSVTMSfi中擴(kuò)增后，HA3基因的夕卜部區(qū)域使用正向引物5'-GCGCGGCCATTATGGCCCAAAACCTTCCCGGAAATG-3'和反向引物5'-GCGCGGCCGAGGCGGCCCCAGTCTTTGTATCCTGAC-3'，從A/Bangkok/1/79(BK79)擴(kuò)增并且純化擴(kuò)增的片段，以Sfi(下劃線位點(diǎn))切割并且克隆到Fc融合蛋白載體pAc3cFcHis，其含有人IgGlFc結(jié)構(gòu)域(SDChappie和IMJonesJ.Biotech.(2002)第95巻，第269-27頁和YaoYY.JInfectDisease(2004)第190巻，第91-98頁)。免疫結(jié)合物因此含有BK79HA3的第17至第530位氨基酸和人IgGlC2/3區(qū)域，并且通過最后質(zhì)粒的測序復(fù)檢。通過構(gòu)建重組的桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白，其是使用質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的快速重組方法，所述質(zhì)粒含有線性桿狀病毒AcMNPVDNA(YaoYYJ.Infect.Disease(2004)第190巻，第91-98頁)。重組的桿狀病毒在多孔板的Sf9細(xì)胞上被滴定，并且在靜置培養(yǎng)中使用無血清昆蟲表達(dá)培養(yǎng)基(Invitrogen)大量制備。來自這些靜置培養(yǎng)物的免疫結(jié)合物(融合蛋白)也用于檢測蛋白的表達(dá)以及FcR的結(jié)合和內(nèi)陷，其是使用HA抗血清的免疫組化染色進(jìn)行，所述HA抗血清得自NIBSC。可選擇地，也可使用商業(yè)的BAC墨TO陽BAC系統(tǒng)(Invitrogen)。使用5LWaveBioreactor容器(www.wavebiotech.com)，免疫結(jié)合物在HIGHFIVEtm或Sf9細(xì)胞中表達(dá)，并且純化用于制備關(guān)于效力試驗(yàn)的疫苗，純化使用標(biāo)準(zhǔn)的親合層析方法和層析柱(GEHealthcare,UK)。相似地，含有HA(得自H5禽流感病毒A/Vietnam/1194/04)的免疫結(jié)合物通過下述過程產(chǎn)生使用下述正向引物5'誦GCGCGGCCATTATGGCCAAGATCAGATTTGCATTGG-3'和反向引物5'國GCGCGGCCGAGGCGGCCTTGGTAAATTCCTATTG-3'PCR擴(kuò)增外部區(qū)域，并且克隆到FcR載體用于大量制備，其是通過上文描述的Sf9細(xì)胞中桿狀病毒的表達(dá)。免疫結(jié)合物含有H5HA的第17至第530位的氨基酸和人IgGlC2/3區(qū)域，并且通過最后質(zhì)粒的測序復(fù)檢。使用合成的基因構(gòu)建體也可產(chǎn)生免疫結(jié)合物。這種方法有額外的優(yōu)點(diǎn)，其可引入期望的基因改變，例如除去蛋白酶切割位點(diǎn)或者流感病毒HA或HIVgpl20基因的可變環(huán)，或者產(chǎn)生異源融合抗原例如Ag85/ESAT-6或Rvl025/1196TB基因融合體。此外合成的基因被用于產(chǎn)生結(jié)合FcR的突變體，其通過在Fc結(jié)構(gòu)域內(nèi)的序列改變實(shí)現(xiàn)，例如用纈氨酸殘基和丙氨酸殘基分別替代在234和235位的兩個(gè)亮氨酸殘基。實(shí)施例2-結(jié)合和內(nèi)陷的篩選通過其結(jié)合并且誘導(dǎo)FcR內(nèi)陷的能力進(jìn)一步選擇免疫結(jié)合物。使用商業(yè)上的血液DC-純化試劑盒(MiltenyiBiotec)從外周血分離表達(dá)CD32和CD64的樹突狀細(xì)胞(DC)。在補(bǔ)充有2%胎牛血清的RPMI中室溫下孵育免疫結(jié)合物和DC15-30分鐘。細(xì)胞在0.1%的戊二醛中固定并且使用0.3-0.5%的非離子型去污劑例如TritonxlOO或NonidetP40滲透，并且通過免疫熒光顯像免疫結(jié)合物，其是使用抗適當(dāng)HA分子的兔抗血清然后使用第二層FITC-標(biāo)記的羊抗-兔實(shí)現(xiàn)。通過流式細(xì)胞儀(FACS分析)評估結(jié)合，其是使用THP-1細(xì)胞觀察與人Fc受體的結(jié)合，以及用RAW細(xì)胞(小鼠樹突狀細(xì)胞)確認(rèn)與小鼠FcR的結(jié)合，并且確保關(guān)于免疫原性研究的動(dòng)物模型的有效性。用Nikon共聚焦顯微鏡通過觀察細(xì)胞內(nèi)嚢泡(vesicle)評估內(nèi)陷。獲得的數(shù)據(jù)的說明顯示在圖2、3和4中，其證明了區(qū)分兩種Fc變體免疫結(jié)合物的能力，所述Fc變體免疫結(jié)合物使用RAW和THP-1細(xì)胞以實(shí)施例1詳述方式產(chǎn)生，并且LL變體顯示FcR的結(jié)合，而VA變體不結(jié)合FcR或者不引起FcR的內(nèi)陷。具體地，圖2顯示人THP-1上的Fc受體與融合蛋白結(jié)合的、FACS示蹤說明。中心的(中間的)峰涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括作為抗原性肽的得自流感病毒的血球凝集素，如實(shí)施例1所描述，以及包括結(jié)合Fc受體的區(qū)域，其中結(jié)合Fc的多肽區(qū)域(未改變時(shí)包括SEQIDNO:1的氨基酸序列)的氨基酸序列被突變而形成變體("LL"變體)，其中在234和235位存在的兩個(gè)亮氨酸殘基被纈氨酸和丙氨酸替代。所述峰說明這種變體融合蛋白沒有結(jié)合存在于THP-1細(xì)胞上的Fc受體。圖2中顯示的3個(gè)峰中最右側(cè)的峰顯示結(jié)合了依照本發(fā)明的融合蛋白，所述融合蛋白包括血球凝集素抗原性多肽和結(jié)合Fc受體的多肽，所述結(jié)合Fc受體的多肽包括SEQIDNO:l的氨基酸序列。這個(gè)峰的位置說明，這種融合蛋白與存在于THP-1細(xì)胞上的Fc受體結(jié)合。圖3顯示上文描述的2種融合蛋白與RAW細(xì)胞上存在的Fc受體的結(jié)合。變體融合蛋白的結(jié)合由中間的峰說明，這顯示沒有變體融合蛋白的結(jié)合(具有亮氨酸置換，其存在于結(jié)合Fc受體的多肽的序列內(nèi))。由未突變?nèi)诤系鞍捉閷?dǎo)的結(jié)合由右側(cè)的峰說明，這確認(rèn)了融合蛋白沒有結(jié)合到存在于鼠RAW細(xì)胞上的Fc受體。圖4顯示替代的融合蛋白與人THP-1細(xì)胞上存在的Fc受體的結(jié)合。圖4左側(cè)的峰涉及變體融合蛋白的結(jié)合，所述變體融合蛋白包括得自HIVgpl20的抗原性多肽，而且進(jìn)一步其中的結(jié)合Fc受體的多肽包括SEQIDNO:l的氨基酸序列，如上文所描述所迷氨基酸序列經(jīng)過雙亮氨酸突變。這個(gè)峰的位置顯示，沒有發(fā)生Fc受體與這種變體的結(jié)合。右側(cè)的峰涉及融合蛋白，其包括得自HIVgpl20的抗原性多肽和結(jié)合Fc受體的多肽，所迷結(jié)合Fc受體的多肽包括SEQIDNO:l的氨基酸序列。這個(gè)峰的位置說明，這種融合蛋白結(jié)合到存在于THP-1細(xì)胞中的Fc受體。實(shí)施例3-針對異源性病毒的保護(hù)作用(遺傳突變產(chǎn)生的病毒序列的漂移)HA3(得自A/Bangkok/1/79病毒)耦合到Fc結(jié)構(gòu)域(得自IgGl)的免疫結(jié)合物用于免疫balbc鼠，所述balbc鼠然后用異源性病毒A/Victoria/75(H3N2)攻擊，A/Victoria/75(H3N2)含有林突變，所述林突變從疫苗林產(chǎn)生3種漂移分離事件(drifteventseparation)。使用雛雞和火雞紅細(xì)胞，測定免疫動(dòng)物中抗血清誘導(dǎo)的、血球凝集素抑制(HAI)的滴定度。免疫結(jié)合物疫苗防止體重減輕和降低肺中病毒載量的能力用于評估免疫動(dòng)物中保護(hù)作用的水平。動(dòng)物在第0、13和27天用5ug的免疫結(jié)合物(不含任何佐劑)接種疫苗，并且在第41天用非致死劑量的感染性外源病毒攻擊。免疫的動(dòng)物顯示了體重減輕的顯著下降(圖1)并且肺中病毒滴定度下降到1/3(3-foldreduction)，這顯示免疫結(jié)合物疫苗保護(hù)動(dòng)物對抗異源病毒的病毒感染。含有VA變體的免疫結(jié)合物顯示無保護(hù)作用，即是觀察到肺中的病毒滴定度沒有下降。然而，顯示免疫動(dòng)物攻擊前或攻擊后均沒有檢測到HAI滴定度，即使在使用火雞紅細(xì)胞改善HAI靈敏度情況下。這些結(jié)果尤其令人驚奇，因?yàn)镠AI滴定度被廣泛認(rèn)為對于保護(hù)作用具有指示性，并且HAI滴定度的誘導(dǎo)事實(shí)上是用于批準(zhǔn)年度性流感疫苗(annualinfluenzavaccine)的主要標(biāo)準(zhǔn)之一。因此顯現(xiàn)了，F(xiàn)c-免疫結(jié)合物誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力足以產(chǎn)生針對流感病毒的保護(hù)，即使在缺乏強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答的情況下。由本發(fā)明免疫結(jié)合物激發(fā)的免疫甚至更令人驚奇，因?yàn)樗粌H在對抗異源林(其具有3種漂移分離事件(drifteventsapart))中給予保護(hù)，而且在年度性流感疫苗中的同源林方面，當(dāng)施用常用劑量的三分之一時(shí)它能起相同作用，激發(fā)出針對同源林的保護(hù)作用。實(shí)施例4-針對廣泛流行病毒(禽流感)的保護(hù)作用HA5(得自A/Vietnam/1194/2004(H5N1)禽流感病毒)耦合到Fc結(jié)構(gòu)域(得自IgGl)的免疫結(jié)合物用于免疫balbc鼠，所述balbc鼠然后用同源病毒攻擊，所述同源病毒含有A/Vietnam/1194/2004HA5與PR8病毒(NIBRG-14)的基因纟且合。對這種鼠模型先前的工作已顯示，HA5亞基疫苗在對抗感染中，除非使用高劑量并且在佐劑存在下才有保護(hù)作用。使用雛雞紅細(xì)胞測定免疫動(dòng)物中抗血清誘導(dǎo)的、血球凝集素抑制(HAI)的滴定度。免疫結(jié)合物疫苗防止體重減輕和降低肺中病毒載量的能力用于評估免疫動(dòng)物中保護(hù)作用的水平。動(dòng)物在第0、14和28天用15ug的免疫結(jié)合物(不含任何佐劑)接種疫苗，并且在第43天用致死劑量的感染性病毒攻擊，所述感染性病毒攜帶得自禽流感廣泛流行;昧的H5基因。免疫的動(dòng)物顯示了對抗感染的顯著的保護(hù)作用，具有67%的存活率并且免疫動(dòng)物的肺中病毒滴定度顯著下降，包括在一些存活動(dòng)物中沒有可^r測的病毒。此外，在攻擊前免疫動(dòng)物顯示檢測不到HAI滴定度，^旦在病毒攻擊后免疫動(dòng)物確實(shí)顯示針對H5的HAI滴定度，雖然其低于批準(zhǔn)的年度性流感疫苗所要求的滴定度的4倍增加。因此顯現(xiàn)了，F(xiàn)c免疫結(jié)合物誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力足以產(chǎn)生針對禽流感的保護(hù)，并且使用快速重組DNA技術(shù)產(chǎn)生免疫結(jié)合物，在對抗突然出現(xiàn)的廣泛流行病毒的疫苗的生產(chǎn)中，應(yīng)具有特殊效用。所有涉及本發(fā)明說明書的文獻(xiàn)通過引用并入本文。對于本發(fā)明描述的實(shí)施方式的各種修改和變化，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯可知的，不脫離本發(fā)明的范圍。盡管本發(fā)明已聯(lián)系特定優(yōu)選的實(shí)施方式進(jìn)行描述，也應(yīng)理解如權(quán)利要求所述，本發(fā)明不應(yīng)不當(dāng)?shù)厥芟抻谶@些特定實(shí)施方式。實(shí)際上，執(zhí)行本發(fā)明所描述方式的各種修改方案(其對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯可知的)都預(yù)期包括在本發(fā)明中。權(quán)利要求1.一種融合蛋白，所述融合蛋白包括一種或多種抗原性多肽序列和結(jié)合Fc受體的多肽，所述結(jié)合Fc受體的多肽以足以引起所結(jié)合Fc受體內(nèi)陷的結(jié)合親合力來結(jié)合Fc受體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中所述結(jié)合Fc受體的多肽得自恒定區(qū)，所述恒定區(qū)得自IgG亞型的人免疫球蛋白的重鏈。3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其中Fc受體多肽包括人IgG免疫球蛋白CH2恒定區(qū)或者其片段，所述片段與所述CH2恒定區(qū)顯示相同生物功能。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的融合蛋白，其中所述人IgG免疫球蛋白是IgGl或lgG3。5.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的融合蛋白，其中所述CH2序列在等同于人IgG免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)CH2序列第297位殘基含有天冬酰胺殘基。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中所述結(jié)合Fc受體的多肽包括SEQIDNO:1的氣基酸序列。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中所述結(jié)合Fc受體的多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸序列。8.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的融合蛋白，其中所述結(jié)合Fc受體的多肽以從約10《Kd至約10一Kd的解離速率常數(shù)結(jié)合Fc受體。9.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其中所述結(jié)合Fc受體的多肽以從約lxl06Ka至約3xl09Ka的結(jié)合速率常數(shù)結(jié)合Fc受體。10.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的融合蛋白，其中所述Fc受體多肽和所述抗原性多肽通過共價(jià)鍵方式連接。11.根據(jù)權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其中所述Fc受體多肽和所述抗原性多肽通過非共價(jià)《睫方式連接。12.根據(jù)權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其中所述Fc受體多肽和所述抗原性多肽通過連接體部分或間隔區(qū)序列的方式連接。13.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的融合蛋白，其中所迷抗原性多肽序列選自由病毒多肽、細(xì)菌多肽、真菌多肽和得自寄生蟲的多肽組成的組。14.根據(jù)權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其中所述抗原性多狀得自非病原性疾病，所述非病原性疾病選自由腫瘤特異抗原、自身免疫性疾病和神經(jīng)變性疾病組成的組。15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的融合蛋白，其中所述多肽是病毒多肽，并且所述病毒是HIV、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的融合蛋白，其中所述多肽是病毒多肽，并且所述病毒是A型流感病毒。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的融合蛋白，其中所述A型流感病毒選自由H5N1、H9N2、H7N1、H7N2、H7N3和H7N7組成的組。18.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的融合蛋白，其進(jìn)一步包括一種或多種另外的異源多肽。19.一種免疫原性組合物，其包括依照權(quán)利要求1至18任一項(xiàng)所述的融合蛋白。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的免疫原性組合物，其進(jìn)一步包括至少一種佐劑。21.—種在受治療者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，其包括以下步驟以足以引起免疫應(yīng)答的量、向受治療者施用權(quán)利要求19或權(quán)利要求20所述的免疫原性組合物。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述免疫應(yīng)答是細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。23.—種多核苷酸序列，其編碼權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的融合蛋白。24.—種載體，其包括權(quán)利要求23所述的多核苷酸序列。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的載體，其進(jìn)一步包括至少一種控制序列元件，所述控制序列元件可操作地連接到所述多核苷酸序列。26.—種宿主細(xì)胞，其包括權(quán)利要求24或25所述的載體，或者權(quán)利要求23所述的多核苷酸序列。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自由BHK、VERO、HT1080、293、COS和CHO組成的組。29.—種在受治療者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括以下步驟-提供依照權(quán)利要求1至18任一項(xiàng)所述的融合蛋白，以及-向受治療者施用治療有效量的所述融合蛋白，在所述受治療者中期望得到針對所述融合蛋白中提供的所述抗原性多肽或其片段而誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述方法延伸至為治療病原性疾病感染而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，所述方法進(jìn)一步包括以下步驟-獲得源自病原體的抗原性多肽序列，其是所述疾病的成因或者是得自所述病原體的產(chǎn)物，-使用所述抗原性多肽序列以形成所述融合蛋白，以及-向需要所述治療的受治療者施用治療有效量或預(yù)防有效量的、含有所述融合蛋白的組合物。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述抗原性多肽得自細(xì)菌病原體或病毒病原體。32.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步延伸至為治療非病原性疾病病癥而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，所述方法進(jìn)一步包括以下步驟-獲得對于所述非病原性疾病病癥特異性的抗原性多肽序列，-使用所述抗原性多肽序列以形成所述融合蛋白，以及_向需要所述治療的受治療者施用治療有效量或預(yù)防有效量的、含有所述融合蛋白的組合物。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中非病原性抗原性多肽選自由腫瘤特異性多肽、對于神經(jīng)變性疾病具有特異性的多肽和對于自身免疫性疾病具有特異性的多肽組成的組。34.根據(jù)權(quán)利要求29至33任一項(xiàng)所述的方法，其中所述免疫應(yīng)答是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。35.根據(jù)權(quán)利要求29至34任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受治療者是哺乳動(dòng)物。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。37.—種在受治療者中產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答的方法，其包括以下步驟在允許在受治療者中產(chǎn)生CTL應(yīng)答的條件下，向受治療者施用依照權(quán)利要求19或權(quán)利要求20所述的免疫原性組合物。38.—種在受治療者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，其包括在允許表達(dá)所述多核苷酸并且產(chǎn)生所述融合蛋白的條件下，向受治療者的細(xì)胞施用依照權(quán)利要求23所述的多核香酸或依照權(quán)利要求25所述的載體，從而激發(fā)對于所述融合蛋白的免疫應(yīng)答。39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述載體是非病毒載體。40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述載體是病毒載體。41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是慢病毒載體。43.根據(jù)權(quán)利要求38至42任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受治療者是哺乳動(dòng)物。44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。45.根據(jù)權(quán)利要求38至44任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多核香酸或載體通過靜脈內(nèi)或肌內(nèi)施用。46.—種用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的藥物組合物，其中所述藥物組合物包括融合蛋白連同藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑，所述融合蛋白包括一種或多種抗原性多肽序列和結(jié)合Fc受體的多肽，其中所述結(jié)合Fc受體的多肽以足以引起所結(jié)合Fc受體內(nèi)陷的結(jié)合親合力來結(jié)合Fc受體。47.—種用作藥物的融合蛋白，其包括一種或多種抗原性多肽序列和結(jié)合Fc受體的多肽，所述結(jié)合Fc受體的多肽以足以引起所結(jié)合Fc受體內(nèi)陷的結(jié)合親合力來結(jié)合Fc受體。48.融合蛋白用于制備治療或預(yù)防疾病的藥物的用途，所述融合蛋白包括一種或多種抗原性多肽序列和結(jié)合Fc受體的多肽，其中所述結(jié)合Fc受體的多肽以足以引起所結(jié)合Fc受體內(nèi)陷的結(jié)合親合力來結(jié)合Fc受體。49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的用途，其中所述疾病是病原性疾病。50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的用途，其中所述病原性疾病是病毒感染。51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的用途，其中所述病毒感染是HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或A型流感病毒感染。52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的用途，其中所述A型流感病毒選自下列亞型H5N1、H9N2、H7N1、H7N2、H7N3和H7N7。53.根據(jù)權(quán)利要求48所述的用途，其中所述疾病是非病原性疾病。54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的用途，其中所述非病原性疾病選自由癌性或惡性病癥、神經(jīng)變性疾病和自身免疫性疾病組成的組。全文摘要本發(fā)明提供了包含結(jié)合Fc受體的多肽和抗原性多肽的融合蛋白。所述融合蛋白可以進(jìn)一步包括連接到結(jié)合Fc受體的多肽和抗原性多肽的、連接體序列或鉸鏈區(qū)。結(jié)合Fc受體的多肽通常包括人IgG免疫球蛋白CH2恒定區(qū)。抗原性多肽能是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的任何多肽。向受治療者施用所述融合蛋白，結(jié)果誘導(dǎo)針對所述融合蛋白中提供的抗原性多肽的、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。本發(fā)明進(jìn)一步延伸到使用本發(fā)明所述的融合蛋白治療受治療者中疾病病癥的方法。文檔編號(hào)C07K16/00GK101448854SQ200780018518公開日2009年6月3日申請日期2007年3月22日優(yōu)先權(quán)日2006年3月22日發(fā)明者卡米洛·科拉科申請人:免疫生物學(xué)有限公司