Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽及其用途，其中該抗原多肽的多肽活性片段為下列至少之一：1)SEQ ID NO:1所示序列：SFATDVLSSNKPVLV；2)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列經(jīng)氨基酸殘基修飾、取代、缺失或添加而形成的氨基酸衍生序列。利用本發(fā)明的Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽，能夠有效地檢測樣品，例如結(jié)核病或疑似結(jié)核病患者的血液樣品(例如血清樣品)中的Trxc抗體水平。
【專利說明】
Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽及其用 途。更具體地，本發(fā)明涉及Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽、該抗原多肽在制備檢測血清中Trxc抗 體水平的試劑盒中的用途、用于檢測樣品中Trxc抗體水平的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核病是全球三大傳染性疾病之一，世界衛(wèi)生組織(WT0)發(fā)布的流行病調(diào)查報(bào)告 顯示，我國結(jié)核病分支桿菌感染病理占全球總病例數(shù)的12%，僅次于印度，位居全球第二。 結(jié)核病的高發(fā)和流行嚴(yán)重影響了我國的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展。目前臨床上使用的結(jié)核病診斷方 法主要以結(jié)核菌的檢出作為金標(biāo)準(zhǔn)，如痰涂片、痰集菌和痰培養(yǎng)的方法，其診斷方法耗時(shí) 長，特異性或者敏感性低。
[0003] 基于血清免疫學(xué)的檢測方法是現(xiàn)階段結(jié)核病診斷的重要輔助手段之一，其中廣泛 使用的抗原特異性r 一干擾素釋放實(shí)驗(yàn)（IGRA)有商業(yè)試劑盒T-spot. TB和QFT-IT。
[0004] IGRA使用的抗原是結(jié)核分支桿菌RD(region of difference)區(qū)基因編碼的全蛋 白，生產(chǎn)成本高，價(jià)格昂貴，世界衛(wèi)生組織不推薦中低收入國家作為篩查檢測手段廣泛使 用。并且也有研究表明，在結(jié)核病高度流行的國家，IGRA的診斷受到環(huán)境因素干擾特異性降 低，假陽性升高，不適用于我國國情，需要尋找更好的血清免疫學(xué)診斷標(biāo)志物。
[0005] 因而，目前的結(jié)核病血清免疫學(xué)診斷、檢測方面的研究仍有待加強(qiáng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：
[0007]結(jié)核分枝桿菌膜蛋白Trxc能引起人體免疫反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)抗體，血清抗Trxc多克 隆抗體的表達(dá)水平能反映出個(gè)體的結(jié)核分枝桿菌感染狀態(tài)。目前利用ELISA等免疫印跡雜 交技術(shù)檢測血清抗Trxc抗體的方法均需要Trxc純蛋白作為識(shí)別抗原。此外，純化蛋白制備 過程繁瑣，費(fèi)時(shí)耗力，成本較高。
[0008] 本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷至少之一，而提供一種有用的商業(yè)選擇。
[0009] 從而，本發(fā)明利用多肽微陣列的技術(shù)篩選獲得了 Trxc蛋白抗原識(shí)別高頻表位，并 提供了包含血清抗體識(shí)別Trxc蛋白的核心氨基酸序列和保護(hù)氨基酸序列并偶聯(lián)載體蛋白 如KLH等的TRXC抗體識(shí)別的抗原多肽，基于結(jié)核病患者血清Trxc抗體表達(dá)水平較健康人顯 著升高，利用這些抗原多肽通過免疫印跡檢測手段可有效檢測待測者血清中的Trxc抗體水 平，進(jìn)而能夠用于結(jié)核病診斷。
[0010]為此，在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽。根據(jù)本 發(fā)明的實(shí)施例，其多肽活性片段為下列至少之一：
[0011] 1)SEQ ID N0:1 所示序列：SFATDVLSSNKPVLV;
[0012] 2)SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列經(jīng)氨基酸殘基修飾、取代、缺失或添加而形成的 氨基酸衍生序列。
[0013] 發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的上述Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽，通過免疫印跡 檢測手段可有效檢測待測者血清中的Trxc抗體水平，進(jìn)而基于待測者血清Trxc抗體表達(dá)水 平是否較健康人顯著升高，能夠有效進(jìn)行結(jié)核病診斷，確定待測者是否為疑似結(jié)核病患者。 其中，結(jié)核病患者血清Trxc抗體表達(dá)水平較健康人顯著升高。本技術(shù)方案以一段人工合成 的多肽序列替代傳統(tǒng)使用純蛋白，能達(dá)到相同的診斷價(jià)值，具有更高的經(jīng)濟(jì)效益。并且，根 據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的上述抗原多肽Trxc抗體識(shí)別特異性好，Trxc抗體水平檢測效 率高，且制備簡單，成本低，易于進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，利于大量推廣應(yīng)用。
[0014] 進(jìn)一步，基于利用上述Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽，通過免疫印跡檢測手段可有效 檢測待測者血清中的Trxc抗體水平，在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了前面所述的Trxc 抗體識(shí)別的抗原多肽在制備檢測血清中Trxc抗體水平的試劑盒中的用途。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒用于結(jié)核病診斷。其中，基于結(jié)核病患者血清Trxc 抗體表達(dá)水平較健康人顯著升高，能夠有效對待測者進(jìn)行結(jié)核病診斷。
[0016] 在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測樣品中Trxc抗體水平的試劑 盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒包括:前面所述的Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽。根據(jù)本發(fā) 明的實(shí)施例，利用該試劑盒能夠有效檢測樣品中Trxc抗體水平，進(jìn)而基于結(jié)核病患者血清 Trxc抗體表達(dá)水平較健康人顯著升高，能夠有效對待測者進(jìn)行結(jié)核病診斷。
[0017] 具體地，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽以下列的至少一種 形式提供：
[0018] 1)96孔板，所述96孔板的孔中包被所述Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽；
[0019] 2)微球，所述微球偶聯(lián)所述Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽。
[0020] 進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，該試劑盒進(jìn)一步包括：陽性對照樣品，所述 陽性對照樣品為抗Trxc蛋白的抗體。由此，利用該試劑盒進(jìn)行Trxc抗體水平檢測和結(jié)核病 診斷時(shí)，結(jié)果更加可靠。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)一步包括:標(biāo)準(zhǔn)樣品，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品為多例Trxc抗體表達(dá) 為陽性的血清的等體積混合物。由此，利用該試劑盒進(jìn)行Trxc抗體水平檢測和結(jié)核病診斷 時(shí)結(jié)果更加真實(shí)可靠。
[0022]根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品為所述多例Trxc抗體表達(dá)為陽性的血 清的等體積混合物的梯度稀釋產(chǎn)物，所述梯度稀釋的比例從1:50起至1:2000止。由此，利用 該試劑盒進(jìn)行Trxc抗體水平檢測和結(jié)核病診斷時(shí)結(jié)果可靠度高。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽的濃度為lμg/ml。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述樣品為血清。
[0025] 本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為 對本發(fā)明的限制。
[0027] Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽
[0028]在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽。根據(jù)本發(fā)明 的實(shí)施例，其多肽活性片段為下列至少之一：
[0029] 1)SEQ ID N0:1 所示序列：SFATDVLSSNKPVLV;
[0030] 2)SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列經(jīng)氨基酸殘基修飾、取代、缺失或添加而形成的 氨基酸衍生序列。
[0031] 發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的上述Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽，通過免疫印跡 檢測手段可有效檢測待測者血清中的Trxc抗體水平，進(jìn)而基于待測者血清Trxc抗體表達(dá)水 平是否較健康人顯著升高，能夠有效進(jìn)行結(jié)核病診斷，確定待測者是否為疑似結(jié)核病患者。 其中，結(jié)核病患者血清Trxc抗體表達(dá)水平較健康人顯著升高。并且，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例， 本發(fā)明的上述抗原多肽Trxc抗體識(shí)別特異性好，Trxc抗體水平檢測效率高，且制備簡單，成 本低，易于進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，利于大量推廣應(yīng)用。
[0032] 需要說明的是，上述多肽均來自于Trxc蛋白的全長序列（例如來源于蛋白質(zhì)公共 資源數(shù)據(jù)庫uni-prot)所對應(yīng)的位置。另外，在本文中所使用的術(shù)語"多肽"是指至少兩個(gè)氨 基酸通過肽鍵連接而得到的寡聚物，其中，多肽中所包含的氨基酸殘基的數(shù)目并不受特別 限制。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，多肽可以含有15個(gè)氨基酸。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理 解的是，還可以對上述多肽進(jìn)行化學(xué)修飾，以便增加多肽的抗原性，有助于多肽包被到 ELISA板底。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用具有上述氨基酸序列的多肽，能夠有效地檢測樣品， 例如結(jié)核病或疑似結(jié)核病患者的血液樣品（例如血清樣品）中的TRXC抗體水平。發(fā)明人發(fā)現(xiàn) 從Trxc蛋白完整序列得到的上述多肽可以模擬Trxc的抗原表位，能夠與血液樣本中TRXC抗 體特異性的反應(yīng)，因而，可以有效地用于檢測對象血液樣本中的TRXC抗體水平，由此，可以 有效地用于篩查結(jié)核病疑似患者血清，為結(jié)核病的診斷提供了一個(gè)新的檢測手段。
[0033] 上述抗原多肽可通過化學(xué)合成得到，也可以通過基因工程技術(shù)得到，此技術(shù)為行 業(yè)內(nèi)所熟悉。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，可以有效地通過常規(guī)合成方法，合成上述多 肽，從而代替重組表達(dá)的生物合成方式。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以用上述多肽進(jìn)行檢測的樣品的類型并不受特別限制。 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，優(yōu)選的樣品為來自結(jié)核病或疑似結(jié)核病患者的血液樣本。由此，可以 利用多肽檢測結(jié)核病或疑似結(jié)核病患者的血液樣本中的TRXC抗體水平，由此可以確定患者 是否患有結(jié)核病，為結(jié)核病檢測提供輔助手段，或者提供結(jié)核病的早期篩查。另外，還可以 通過檢測對象血液中的Trxc抗體水平，而對患者進(jìn)行治療的療效評估監(jiān)測分析。
[0035] 利用本發(fā)明的多肽檢測樣品中Trxc抗體水平的方法并不受特別限制，包括但不限 于ELISA、液相芯片、固相芯片及其它免疫雜交技術(shù)等。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以通過酶聯(lián) 免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法，借助本發(fā)明的多肽檢測樣品中的Trxc抗體水平。由此，可以進(jìn)一 步提高利用多肽檢測結(jié)核病或疑似結(jié)核病患者的血液樣品中的Trxc抗體水平的效率。作為 示例，可以采用下列方法利用多肽檢測結(jié)核病或疑似結(jié)核病患者的血液樣品中的Trxc抗體 水平：
[0036]首先，用pH9.6的碳酸鹽緩沖液(NaC03 0.159g，NaHC03 0.293g，加水至 100ml，pH值 為9.6)稀釋多肽至以8/!111，以10(^1/孔的量加入到96孔酶標(biāo)板的孔中，封板膜密封后4°(：過 夜。
[0037] 接下來，棄去孔中的液體，0.1%TBS-T洗滌緩沖液(含0. l%TWeen-20的TBS-T溶液 配制為NaCl 8.7g，Tris 1.21g，加去離子水至 1000ml，pH 7.5,再加入Tween-20 lml)洗滌 酶標(biāo)板5次，每次3min。
[0038] 接著，向孔中添加含5%BSA和0.05%Tween-20的TBS-T封閉緩沖液（其配制方法 為：NaCl 0.87g，Tris 0.121g，加去離子水至 100ml，pH 7.5,再加入Tween-20 0.5ml，BSA 5g)，每孔300μ1，封板膜密封后37°C孵育lh。
[0039] 接著，添加標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品。用上述含5 % BSA和0.05 % Tween-20的TBS-T封閉緩 沖液稀釋待測血清，稀釋比例為1:100。梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品的血清，稀釋比例從1:50起至 1:2000止。完全棄去孔中液體，每孔加待測樣品的血清稀釋液100μ1，每例待測樣品的血清 樣本3個(gè)復(fù)孔，每板設(shè)立2個(gè)陽性對照孔，加入已知陽性血清，且每板設(shè)立2個(gè)空白對照孔，加 入0.1 % TBS-T洗滌緩沖液。封板膜密封后37 °C孵育2h。棄去孔中液體，洗滌酶標(biāo)板5次，每次 3min〇
[0040] 接著，進(jìn)行第二抗體免疫反應(yīng)。利用上述含5%BSA和0.05%Tween-20的TBS-T封閉 緩沖液稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG，稀釋比例1:5000，每孔加10(^1，封板膜密 封后37 °C孵育lh。棄去孔中液體，洗滌酶標(biāo)板5次，每次3min。
[0041 ]接著，加底物顯色。按照常規(guī)ELISA試劑盒說明書(例如康為世紀(jì)TMB顯色試劑盒）， 加入顯色底物，每孔加入1〇〇μ1，室溫避光條件下顯色lOmin，每孔加入50μ1 2M H2SO4終止反 應(yīng)。
[0042]接著，酶標(biāo)儀492nm波長條件下測定光密度0D值。
[0043] 最后，基于所得的光密度0D值與標(biāo)準(zhǔn)品濃度擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得對應(yīng)檢測樣品 的相對濃度，然后與預(yù)定參考值進(jìn)行比較，確定待測樣本是否來源于患有結(jié)核病患者。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以利用確診癌癥患者和健康人(健康志愿者）的血液樣品 進(jìn)行平行試驗(yàn)所得到的數(shù)值作為預(yù)定的參考值。
[0045] 設(shè)當(dāng)待測樣本中的Trxc抗體相對濃度高于X，則待測血清為疑似結(jié)核病患者血清。 X是發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)計(jì)算獲得，具體方法為檢測人群中結(jié)核患者和健康人血清抗體相對濃 度的受試者工作曲線(R0C曲線)最優(yōu)點(diǎn)下的相對濃度。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，采用40例結(jié)核患 者血清樣本和80例健康人血清樣本，計(jì)算得序列SEQ ID NO: 1所示抗原多肽的X值為5.3。 [0046] TRXC抗體識(shí)別的抗原多肽的應(yīng)用
[0047]在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了前面所述的Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽在制備 檢測血清中Trxc抗體水平的試劑盒中的用途。
[0048]如前所述，采用制備的試劑盒，利用其包含的Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽，通過免疫 印跡檢測手段可有效檢測待測者血清中的Trxc抗體水平，進(jìn)而能夠有效進(jìn)行結(jié)核病診斷。 從而，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒用于結(jié)核病診斷。其中，基于結(jié)核病患者血清Trxc抗 體表達(dá)水平較健康人顯著升高，能夠有效對待測者進(jìn)行結(jié)核病診斷。
[0049]為此，在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測樣品中Trxc抗體水平的 試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒包括:前面所述的Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽。根據(jù) 本發(fā)明的實(shí)施例，利用該試劑盒能夠有效檢測樣品中Trxc抗體水平，進(jìn)而基于結(jié)核病患者 血清Trxc抗體表達(dá)水平較健康人顯著升高，能夠有效對待測者進(jìn)行結(jié)核病診斷。
[0050] 具體地，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽以下列的至少一種 形式提供：
[0051] 1)96孔板，所述96孔板的孔中包被所述Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽；
[0052] 2)微球，所述微球偶聯(lián)所述Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽。
[0053]進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，該試劑盒進(jìn)一步包括：陽性對照樣品，所述 陽性對照樣品為抗Trxc蛋白的抗體。由此，利用該試劑盒進(jìn)行Trxc抗體水平檢測和結(jié)核病 診斷時(shí)，結(jié)果更加可靠。
[0054]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)一步包括:標(biāo)準(zhǔn)樣品，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品為多例Trxc抗體表達(dá) 為陽性的血清的等體積混合物。由此，利用該試劑盒進(jìn)行Trxc抗體水平檢測和結(jié)核病診斷 時(shí)結(jié)果更加真實(shí)可靠。其中陽性血清的例數(shù)也即血清的患者來源數(shù)并不受特別限制，所述 "多例"也可以為1例。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品為Trxc抗體表達(dá)為陽性的 血清的等體積混合物。
[0055]根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品為所述多例Trxc抗體表達(dá)為陽性的血 清的等體積混合物的梯度稀釋產(chǎn)物，所述梯度稀釋的比例從1:50起至1:2000止。其中，經(jīng)梯 度稀釋是為了方便后續(xù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此，利用該試劑盒進(jìn)行Trxc抗體水平檢測和結(jié)核 病診斷時(shí)結(jié)果可靠度高。
[0056]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽的濃度為lμg/ml。
[0057]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述樣品為血清。
[0058]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，該試劑盒可以包括:96孔板，所述96孔板的孔中包被前 面所述的TRXC抗體識(shí)別的抗原多肽。進(jìn)一步，該試劑盒可以進(jìn)一步包括：陽性對照樣品，所 述陽性對照樣品為抗Trxc蛋白的抗體，或者/額外地可以進(jìn)一步包括:標(biāo)準(zhǔn)樣品，所述標(biāo)準(zhǔn) 樣品為Trxc抗體表達(dá)為陽性的血清經(jīng)梯度稀釋后的組合。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所 述標(biāo)準(zhǔn)樣品為所述多例Trxc抗體表達(dá)為陽性的血清的等體積混合物的梯度稀釋產(chǎn)物，所述 梯度稀釋的比例從1: 50起至1: 2000止。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述Trxc抗體識(shí)別的抗原多 肽的濃度為lμg/ml。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述樣品為血清。
[0059] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述樣品為來自結(jié)核病或疑似結(jié)核病患者的血液樣品。由 此，可以利用多肽檢測結(jié)核病或疑似結(jié)核病患者的血液樣品中的Trxc抗體水平，由此可以 確定患者是否患有結(jié)核病，為結(jié)核病檢測提供輔助手段，或者監(jiān)控結(jié)核病的進(jìn)展。另外，利 用該試劑盒還可以通過檢測對象血液中的Trxc抗體水平，而對患者對治療方法的反應(yīng)進(jìn)行 預(yù)后。
[0060] 在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提出了一種用于檢測樣品中TRXC抗體水平的試劑 盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒包括:前面所述的Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽。由此，利用 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以有效地借助根據(jù)本發(fā)明的Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽對樣品中的 Trxc抗體水平進(jìn)行檢測。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒可以進(jìn)一步包括:適于進(jìn)行ELISA 檢測的試劑。由此，可以通過ELISA檢測方法，利用根據(jù)本發(fā)明的多肽對樣品中的Trxc抗體 進(jìn)行檢測，從而可以進(jìn)一步提高利用多肽檢測結(jié)核病或疑似結(jié)核病患者的血液樣品中的 Trxc抗體水平的效率。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述多肽設(shè)置于96孔板中，例如可以包被96孔 板的孔，例如可以通過常規(guī)處理如借助包被液和阻滯液進(jìn)行。由此，可以方便地高通量地進(jìn) 行檢測?？梢赃M(jìn)一步提高利用多肽檢測結(jié)核病或疑似結(jié)核病患者的血液樣品中的Trxc抗體 水平的效率。試劑盒中還可以包含其他試劑，例如洗滌緩沖液，樣品稀釋緩沖液，TMB底物溶 液，反應(yīng)終止液，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，陽性對照樣品，標(biāo)準(zhǔn)樣品。其中，陽性對照樣 品為抗Trxc蛋白的抗體，標(biāo)準(zhǔn)樣品為Trxc抗體表達(dá)為陽性的血清經(jīng)梯度稀釋后的組合?；?者，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品為所述多例Trxc抗體表達(dá)為陽性的血清的等體積混合物的梯度稀釋產(chǎn) 物。
[0061]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述樣品為來自結(jié)核病或疑似結(jié)核病患者以及健康志愿者 的血液樣品。
[0062]另外，利用該試劑盒還可以通過檢測對象血液中的Trxc抗體水平，而對患者對治 療方法的反應(yīng)進(jìn)行預(yù)后。
[0063] 下面通過具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行解釋。需要說明的是，下列實(shí)施例僅僅是說明 性的，并不以任何方式限制本發(fā)明。另外，下列實(shí)施例中所采用的所有儀器、材料等均為市 售可得的，如在下列實(shí)施例中沒有明確指出的操作，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)的操作 方法進(jìn)行。
[0064] 實(shí)施例1
[0065] 一、多肽的制備 [0066] 1.肽庫的制備
[0067] Trxc的氨基酸序列從蛋白質(zhì)公共資源數(shù)據(jù)庫uni-prot獲得。
[0068] 2.原位合成Trxc蛋白肽庫制備多肽芯片(peptide array)
[0069] 根據(jù)蛋白及多肽氨基酸殘基長度、重疊序列長度進(jìn)行多肽合成儀ASP SL(德國， intavis公司)MutilPep合成控制程序設(shè)定，依據(jù)程序控制在每個(gè)合成周期添加一種特定氨 基酸到活化的硝酸纖維素膜表面合成位點(diǎn)，并催化氨基酸之間肽鍵形成。多肽芯片合成后 于一 20 °C密封保存?zhèn)溆谩?br>[0070] 二、篩選與結(jié)核病相關(guān)的多肽(抗原表位的篩選）
[0071] 1.多肽芯片的水化和免疫印跡
[0072]將前述步驟一制備的多肽芯片（這里稱為"多肽芯片Γ)浸入40ml 100%乙醇中， 搖床上搖5分鐘。然后，將該多肽芯片浸入40ml 75%乙醇中，搖床上搖5分鐘。接下來，將多 肽芯片浸入40ml 50%乙醇中，搖床上搖5分鐘。接著，加入150ml PBS浸泡30分鐘。最后，將 將多肽芯片浸入40ml 5%脫脂奶粉/PBS-T溶液中，室溫下孵育3小時(shí)進(jìn)行封閉。
[0073] 將下述初篩和鑒定實(shí)驗(yàn)中涉及的血清樣本用5%脫脂奶粉/PBS-T溶液1:1000稀釋 制備成免疫反應(yīng)液，將多肽芯片放入雜交袋內(nèi)，按〇. Iml/cm2加反應(yīng)液，去除袋內(nèi)所有氣泡， 封膜機(jī)封口，4°C輕輕振蕩過夜。
[0074]血清免疫反應(yīng)結(jié)束后，剪開雜交袋，棄去反應(yīng)液，PBS-T 40ml洗多肽芯片3次，每次 15分鐘，將多肽芯片放入雜交袋內(nèi)，加1:2000稀釋的山羊抗人IgG溶液，按0.1ml/cm2加二抗 反應(yīng)液，封好雜交袋，室溫下輕輕振蕩2小時(shí)，40ml PBS-T洗膜3次，每次15分鐘。
[0075] 接下來，進(jìn)行ECL顯影，曝光，曝光結(jié)果用AlphaView軟件系統(tǒng)分析圖像。
[0076] 2.抗原表位的初篩
[0077] 將10例結(jié)核病患者外周血血清等量混合制備成結(jié)核混合血清池，10例PPD檢測陰 性志愿者外周血血清等量混合制備成健康混合血清池。上述血清池與多肽芯片按照上述方 法進(jìn)行免疫雜交，根據(jù)免疫反應(yīng)結(jié)果，挑選與結(jié)核病患者血清反映陽性且健康志愿者血清 反映陰性的差異多肽位點(diǎn)，共計(jì)2個(gè)，即為Trxc蛋白在結(jié)核血清中的抗原識(shí)別表位。
[0078] 3.具有結(jié)核病診斷價(jià)值的抗原多肽篩選
[0079] 按照實(shí)施例1所述的制備方法，制備包含上述2條差異多肽及對照在內(nèi)的多肽芯片 (這里稱為"多肽芯片2"），通過與100例結(jié)核病患者血清和90例健康人血清進(jìn)行免疫反應(yīng)， 篩選出Trxc抗原表位高頻位點(diǎn)1個(gè)(SEQ ID NO: 1所示序列：SFATDVLSSNKPVLV)，其具有區(qū)分 結(jié)核病患者和健康人的價(jià)值。
[0080]三、ELISA 檢驗(yàn)
[0081]以步驟二中篩選獲得的多肽(序列如SEQ ID NO: 1所示）為抗原包被96孔板，運(yùn)用 ELISA方法對下列樣本進(jìn)行Trxc抗體的檢測:82例結(jié)核患者血清和38例健康對照血清。 [0082]具體檢測方法如下：
[0083]首先，用多肽合成儀MultiPep RS按照序列表中氨基酸殘基順序合成所述抗原多 肽。
[0084]接著，用？!19.6的碳酸鹽緩沖液(恥0)3 0.1598，恥!10)3 0.2938，加水至10〇1111，？!1 值為9.6)稀釋多肽至以8/1111，以10(^1/孔的量加入到96孔酶標(biāo)板的孔中，封板膜密封后4 1€ 過夜。
[0085] 接下來，棄去孔中的液體，0.1%TBS-T洗滌緩沖液(含0. l%TWeen-20的TBS-T溶液 配制為NaCl 8.7g，Tris 1.21g，加去離子水至 1000ml，pH 7.5,再加入Tween-20 lml)洗滌 酶標(biāo)板5次，每次3min。
[0086] 接著，向孔中添加含5%BSA和0.05%Tween-20的TBS-T封閉緩沖液（其配制方法 為：NaCl 0.87g，Tris 0.121g，加去離子水至 100ml，pH 7.5,再加入Tween-20 0.5ml，BSA 5g)，每孔300μ1，封板膜密封后37°C孵育lh。
[0087] 接著，添加標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品。所述標(biāo)準(zhǔn)品為隨機(jī)選取的其中10例結(jié)核病患者的 外周血血清的等體積混合物。用上述含5%BSA和0.05%Tween-20的TBS-T封閉緩沖液稀釋 待測血清，稀釋比例為1:100。梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品的血清混合物，稀釋比例從1:50起至1: 2000止。完全棄去孔中液體，每孔加待測樣品的血清稀釋液100μΙ，每例待測樣品的血清樣 本3個(gè)復(fù)孔，每板設(shè)立2個(gè)陽性對照孔，加入已知陽性血清，且每板設(shè)立2個(gè)空白對照孔，加入 0.1 % TBS-T洗滌緩沖液。封板膜密封后37 °C孵育2h。棄去孔中液體，洗滌酶標(biāo)板5次，每次 3min〇
[0088] 接著，進(jìn)行第二抗體免疫反應(yīng)。利用上述含5%BSA和0.05%Tween-20的TBS-T封閉 緩沖液稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG，稀釋比例1:5000，每孔加10(^1，封板膜密 封后37 °C孵育lh。棄去孔中液體，洗滌酶標(biāo)板5次，每次3min。
[0089]接著，加底物顯色。按照常規(guī)ELISA試劑盒說明書(康為世紀(jì)TMB顯色試劑盒），加入 顯色底物，每孔加入1〇〇μ1，室溫避光條件下顯色lOmin，每孔加入50μ1 2M H2SO4終止反應(yīng)。
[0090] 接著，酶標(biāo)儀492nm波長條件下測定光密度0D值。
[0091] 最后，基于所得的光密度0D值與標(biāo)準(zhǔn)品濃度擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得對應(yīng)檢測樣品 的相對濃度，然后與預(yù)定參考值進(jìn)行比較，確定待測樣本是否來源于患有結(jié)核病患者。 [00 92]設(shè)當(dāng)待測樣本中的Trxc抗體相對濃度高于X，則待測血清為疑似結(jié)核病患者血清。 X為檢測人群中結(jié)核患者和健康人血清抗體相對濃度的受試者工作曲線(R0C曲線）最優(yōu)點(diǎn) 下的相對濃度。基于40例結(jié)核患者血清樣本和40例健康人血清樣本，計(jì)算得到各抗原多肽 對應(yīng)的X值，其中序列SEQ ID NO: 1所示抗原多肽的X值為5.3。
[0093]以此為cutoff值(預(yù)定參考值），檢測結(jié)果如下：
[0094]
[0095] 陽性和陰性例數(shù)的比較結(jié)果如下：
[0096]
[0097] 敏感性、特異性及陰性陽性預(yù)測值總結(jié)如下：
[0098]
[0099]
[0100]用Trxc純化蛋白作為抗原，檢測血清抗體濃度，檢測結(jié)果如下：
[0101]
[0102] 陽性和陰性例數(shù)的比較結(jié)果如下：
[0103]
'[0104]~敏感性、特異性及陰性陽性預(yù)測值總結(jié)如下: ' '
[0105]
[0106] 結(jié)果證明，相比之下，多肽抗原相比全蛋白抗原具有相同的診斷價(jià)值。 '
[0107] 由此，證明了本發(fā)明的Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽，可有效用于結(jié)核病的輔助診斷。
[0108] 在本說明書的描述中，參考術(shù)語"一個(gè)實(shí)施例"、"一些實(shí)施例"、"示例"、"具體示 例"、或"一些示例"等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特 點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不 一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何 的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。
[0109] 盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解:在不 脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本 發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽，其特征在于，其多肽活性片段為下列至少之一： 1. SEQ ID N0:1 所示序列：SFATDVLSSNKPVLV; 2. SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列經(jīng)氨基酸殘基修飾、取代、缺失或添加而形成的氨基 酸衍生序列。2. 權(quán)利要求1所述的Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽在制備檢測血清中Trxc抗體水平的試劑 盒中的用途。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述試劑盒用于結(jié)核病診斷。4. 一種用于檢測樣品中Trxc抗體水平的試劑盒，其特征在于，包括： 權(quán)利要求1所述的T r X C抗體識(shí)別的抗原多肽。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽以下列的 至少一種形式提供： 1) 96孔板，所述96孔板的孔中包被所述Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽； 2) 微球，所述微球偶聯(lián)所述Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，進(jìn)一步包括：陽性對照樣品，所述陽性對 照樣品為抗Trxc蛋白的抗體。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，進(jìn)一步包括:標(biāo)準(zhǔn)樣品，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品為 多例Trxc抗體表達(dá)為陽性的血清的等體積混合物。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品為所述多例Trxc抗體表達(dá) 為陽性的血清的等體積混合物的梯度稀釋產(chǎn)物，所述梯度稀釋的比例從1: 50起至1: 2000 止。9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述Trxc抗體識(shí)別的抗原多肽的濃度為 lμg/ml〇10. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述樣品為血清。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK106008685SQ201610331113
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月18日
【發(fā)明人】岳文濤, 譚金晶, 顧勐, 張麗娜
【申請人】首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院, 北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所