一種特異結(jié)合trb3的多肽在治療或預(yù)防腹主動(dòng)脈瘤中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種多肽及其衍生物在制備治療或預(yù)防腹主動(dòng)脈瘤的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腹主動(dòng)脈瘤指腹主動(dòng)脈出現(xiàn)向側(cè)面和前后搏動(dòng)的膨脹性腫塊，呈瘤樣擴(kuò)張，通常 主動(dòng)脈直徑增大50%以上可定義為動(dòng)脈瘤。該疾病病變部位具有極高破裂風(fēng)險(xiǎn)，瘤體一旦 破裂，常伴有休克表現(xiàn)，死亡率高達(dá)78% -92%，嚴(yán)重威脅人類健康。瘤體未破裂時(shí)，患者常 伴有臍周及中上腹部劇烈疼痛癥狀，并發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、下肢動(dòng)脈栓塞、腎積水等 疾病，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。腹主動(dòng)脈瘤常見(jiàn)于老年男性，男女發(fā)病之比為10:3。目前 尚針對(duì)腹主動(dòng)脈瘤的治療策略十分有限，大多數(shù)患者接受高風(fēng)險(xiǎn)和高成本的手術(shù)治療。
[0003] 大量研究指出，腹主動(dòng)脈瘤病理的發(fā)生發(fā)展與炎癥因子白介素6、白介素8與氧 化應(yīng)激堆積密切相關(guān)。自噬為機(jī)體病變的一種重要防御機(jī)制，經(jīng)典的自噬被定義為通過(guò)溶 酶體途徑清除細(xì)胞內(nèi)冗余、錯(cuò)誤折疊蛋白以及損傷細(xì)胞器，防止氧自由基堆積與炎癥。P62 是自噬過(guò)程中重要的"貨車蛋白"。P62蛋白結(jié)構(gòu)域中含有泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域（Ubiquitin associated domain, UBA)，與泛素化蛋白（(Ubiquitin，Ub)結(jié)合，作為"貨車"將受損細(xì)胞 器或蛋白募集于自噬小體膜上的LC3,這個(gè)過(guò)程主要通過(guò)P62蛋白的LIR(LC3-Interacting Region, LIR)結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)，介導(dǎo)泛素化蛋白的降解，同時(shí)，P62的表達(dá)水平也隨之降低。當(dāng)自 噬受到抑制或自噬流被阻斷時(shí)，P62與其結(jié)合的泛素化蛋白不能及時(shí)降解，在胞漿內(nèi)堆積而 表達(dá)升高。胞漿內(nèi)P62可與氧化應(yīng)激形成惡性循環(huán)，造成細(xì)胞毒性，促進(jìn)炎癥發(fā)生發(fā)展。
[0004] TRB3 (Tribbles Homologue3)是Tribbles同源蛋白家族成員之一，最早在果蠅中 被鑒定到，并發(fā)現(xiàn)該蛋白能抑制有絲分裂，調(diào)節(jié)發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞的增殖、遷移及形態(tài)形成。 在哺乳動(dòng)物中，有三種Tribbles同源蛋白：TRBl，TRB2和TRB3,它們都是假激酶蛋白家族成 員。這三種蛋白都含有Ser/Thr蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域（Kinase like domain, KD)，但卻缺乏ATP 的結(jié)合位點(diǎn)和催化殘基，因此沒(méi)有激酶活性。盡管如此，Tribbles蛋白卻具有接頭蛋白樣 的功能，參與多種蛋白復(fù)合體的組裝。在哺乳動(dòng)物Tribbles家族成員中，TRB3的研究最為 深入，其相互作用蛋白包括轉(zhuǎn)錄因子、泛素連接酶、細(xì)胞膜上II型BMP受體以及MAPK、PI3K 信號(hào)通路成員。通過(guò)與這些蛋白相互作用，TRB3參與了糖脂代謝、脂肪細(xì)胞分化、凋亡、應(yīng) 激和膠原表達(dá)等的調(diào)控。近來(lái)多種證據(jù)表明，TRB3在腹主動(dòng)脈瘤相關(guān)疾病動(dòng)脈粥樣硬化的 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中都具有重要的調(diào)節(jié)作用，提示TRB3可能是治療腹主動(dòng)脈瘤及其相關(guān)性疾 病的潛在靶點(diǎn)。
[0005] 有研究指出，TRB3與自噬底物p62相互結(jié)合，阻斷自噬。因此，研究和開(kāi)發(fā)TRB3蛋 白的抑制劑，或者阻斷其與P62蛋白結(jié)合的物質(zhì)，具有很好的恢復(fù)自噬流，治療腹主動(dòng)脈瘤 及其相關(guān)性疾病發(fā)生和發(fā)展的成藥前景

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)目前缺乏能有效利用的TRB3蛋白抑制劑的現(xiàn) 狀，而提供一種能特異性結(jié)合TRB3的多肽及其在制備治療或預(yù)防腹主動(dòng)脈瘤類藥物中的 應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的發(fā)明人在研究的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在腹主動(dòng)脈瘤病變部位以及血管緊張素II 刺激的主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)自噬經(jīng)典指標(biāo)LC3I向LC3II轉(zhuǎn)化，表明自噬上游信號(hào)的 激活。發(fā)明人還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)TRB3的表達(dá)量升高，與p62發(fā)生相互作用，阻斷了自噬流，造成 腹主動(dòng)脈瘤病變部位蛋白、炎癥因子與氧化應(yīng)激的堆積?；诎l(fā)明人的研究工作，本發(fā)明提 供下述技術(shù)方案。
[0008] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：一種可特異性結(jié)合TRB3的多肽或所述多肽的衍生物 在制備治療或預(yù)防腹主動(dòng)脈瘤的藥物中的應(yīng)用；
[0009] 所述的多肽的氨基酸序列為如SEQ ID NO : 1所示序列；
[0010] 所述多肽的衍生物為所述多肽與細(xì)胞穿膜肽接連所形成的嵌合肽。
[0011] 本發(fā)明中，所述的如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中，可適當(dāng)引入氨基酸替換， 缺失或添加，只要改變后的氨基酸序列仍然能夠形成能與TRB3特異性結(jié)合的多肽且該多 肽仍然保持改變前的活性即可。
[0012] 本發(fā)明中，所述的細(xì)胞穿膜肽為本領(lǐng)域常規(guī)所述的細(xì)胞穿膜肽，只要其能輔助將 所述多肽送入細(xì)胞以發(fā)揮作用即可，一般而言，所述的細(xì)胞穿膜肽為由10~30個(gè)氨基酸 組成的短肽分子。所述的細(xì)胞穿膜肽較佳地為P印2多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所 示；即在本發(fā)明中，所述的多肽衍生物較佳地為以P印2多肽連接如SEQ ID NO :1所示序列 中的嵌合多肽。所述的細(xì)胞穿膜肽還可以為HIV-I病毒反轉(zhuǎn)錄激活因子（Trans-activator transcription，Tat)蛋白的 TAT 肽（YGRKKRRQRRR，其氨基酸序列如 SEQ ID :3 所示）、果 蠅觸角同源異型蛋白的轉(zhuǎn)錄因子Antp肽（RQIKIWFQNRRMKWKK，其氨基酸序列如SEQ ID : 4所示）、P印-1肽（KETWWETWffTEWSQPKKKRKV，其氨基酸序列如SEQ ID :5所示）、MPG肽 (GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV，其氨基酸序列如 SEQ ID :6 所示）和 R⑶肽（Arg-Gly-Asp， 其氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示）中的任一種或多種。所述細(xì)胞穿膜肽較佳地連接在所 述多肽的N端或者C端，更佳的是N端。
[0013] 本發(fā)明所述的多肽及其衍生物可以作為活性成分用于制備預(yù)防或治療腹主動(dòng)脈 瘤的藥物。所述的"活性成分"是指具有預(yù)防或治療腹主動(dòng)脈瘤功能的化合物，即所述多肽 或所述多肽的衍生物用于制備預(yù)防或治療腹主動(dòng)脈瘤的藥物。在該藥物中，所述多肽或所 述多肽的衍生物可以單獨(dú)作為活性成分，也可以和其他化合物一起作為活性成分。
[0014] 本發(fā)明中，所述的藥物可以包含生理學(xué)或藥學(xué)上可接受的載體，所述的載體可以 為任意合適的生理學(xué)或藥學(xué)上可接受的藥物輔料，較佳地選自殼聚糖及其衍生物、卡波姆 和脂質(zhì)體中的一種或多種。因此，在本發(fā)明中，所述的多肽或所述多肽的衍生物較佳地與所 述藥物輔料組成藥物組合物。所述的藥物組合物可以為本領(lǐng)域常規(guī)所述的各種劑型，較佳 地是固體、半固體或液體的形式，可以是水溶液、非水溶液或混懸液，更佳地是片劑、膠囊、 顆粒劑、注射劑或輸注劑等。所述藥物組合物的給藥途徑較佳地為注射給藥或口服給藥，所 述注射給藥較佳地包括：靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮內(nèi)注射或皮下注射途徑給藥。 [0015] 本發(fā)明所述的藥物組合物在治療時(shí)的使用劑量根據(jù)患者的年齡和病情而定，使用 劑量較佳地為〇. 1~15mg/kg，更佳地為5~10mg/kg，最優(yōu)選為5mg/kg，給藥次數(shù)較佳地為 一天一次或數(shù)次。
[0016] 本發(fā)明中，所述的腹主動(dòng)脈瘤為本領(lǐng)域常規(guī)所指的病理狀態(tài)，包括：（1)腹主動(dòng)脈 直徑增大，呈瘤樣，（2)炎癥因子白介素6高度表達(dá)，3)炎癥因子白介素8高度表達(dá)，（4)氧 化應(yīng)激堆積，（5)細(xì)胞凋亡指標(biāo)cleaved caspase3高度表達(dá)。
[0017] 在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述的各優(yōu)選條件可任意組合，即得本發(fā)明各較佳 實(shí)例。
[0018] 本發(fā)明所用試劑和原料除特別說(shuō)明之外，均市售可得。
[0019] 本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：本發(fā)明的多肽或多肽衍生物能夠特異性地與TRB3 結(jié)合，從而阻斷TRB3與P62蛋白的相互作用，恢復(fù)自噬流，該肽段的衍生物P印2-A2可以治 療血管緊張素II誘導(dǎo)的ApoE敲除小鼠腹主動(dòng)脈瘤，具有非常顯著的療效。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為用表面等離子共振方法驗(yàn)證多肽A2與蛋白TRB3的動(dòng)力學(xué)結(jié)合曲線。其中 右圖為A2和TRB3的結(jié)合曲線。
[0021] 圖2為用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)驗(yàn)證多肽A2與蛋白TRB3的結(jié)合直方圖。中陽(yáng) 性對(duì)照為P62蛋白，陰性對(duì)照為牛血清白蛋白BSA。
[0022] 圖3為用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)驗(yàn)證多肽A2競(jìng)爭(zhēng)TRB3和P62蛋白結(jié)合的 直方圖。其中對(duì)照為TRB3與P62的結(jié)合直方圖，A2代表加入多肽A2后TRB3與P62的結(jié) 合直方圖。
[0023] 圖4為用免疫共沉淀的方法驗(yàn)證在細(xì)胞水平多肽A2的衍生物P印2-A2對(duì)蛋白 TRB3和P62相互作用的影響。
[0024] 圖5為用H&E染色方法證明相比于瘤旁對(duì)照，腹