一種TgVP1胞外區(qū)抗原多肽、抗TgVP1的多克隆抗體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種TgVPl胞外區(qū)抗原多肽，抗TgVPl的多克隆抗體及其應用。
【背景技術】
[0002] V-H+-PPaSe是一種獨特的質子泵，在多種動植物中都存在。它能夠水解無機焦 磷酸鹽的磷酸酐鍵，并利用所釋放的能量轉運質子，產生跨膜的電化學梯度，發(fā)揮和質子泵 ATP酶類似的作用。V-H+-PPase能使儲存的能量高效轉化為H+和/或電轉膜梯度，用于多 種不同的細胞內轉運過程。V-PPases最早被發(fā)現存在于植物和光合細菌中，近期研宄表明 錐蟲、利什曼原蟲、弓形蟲、惡性瘧原蟲也存在這種酶。值得關注的是，在這些寄生蟲的動物 宿主中均不存在這種酶類，因此V-PPases作為寄生蟲病潛在的藥物靶點具有重要的研宄 價值。弓形蟲的V-PPases主要分布于酸性鈣體及質膜，根據結構和功能的不同可分為兩 種類型，VPl和VP2。TgVPl需要K+激活其生物學活性。當弓形蟲入侵細胞時，TgVPl組成 圈狀結構分布于弓形蟲外緣，并隨著弓形蟲的侵入在蟲體內迀移。當弓形蟲完成侵襲過程 時，TgVPl重新回到弓形蟲的頂端。TgVPl含有17個跨膜域，N端具有信號肽序列，可以指 導TgVPl進入弓形蟲的分泌途徑，但具體作用機制尚不明確。有研宄表明弓形蟲焦磷酸酶 活性可抑制弓形蟲在細胞內的復制。因此，TgVPl有作為潛在的弓形蟲病臨床診斷和治療 革巴標的可能，制備TgVP 1的抗體具有十分重要的意義，可以為該蛋白功能的研宄奠定基礎， 同時為其作為疾病標志物的可行性提供實驗數據支持。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的目的是克服現有技術的不足，提供一種能用于ELISA、western-blot、免 疫熒光檢測的抗弓形蟲TgVPl蛋白的多克隆抗體。
[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種弓形蟲TgVPl胞外區(qū)抗原多肽。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供一種抗TgVPl的多克隆抗體。
[0006] 本發(fā)明的又一目的是提供上述抗TgVPl的多克隆抗體的應用。
[0007] 本發(fā)明通過以下技術方案實現上述目的：
[0008] 一種弓形蟲TgVPl胞外區(qū)抗原多肽，氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示，或在SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列N端連接一個半胱氨酸。在N端加入半胱氨酸是為了便于與載體蛋 白偶聯(lián)。
[0009] -種抗TgVPl的多克隆抗體，是以前述TgVPl抗原多肽為免疫原，免疫動物制備而 成。
[0010] 上述抗TgVPl的多克隆抗體的制備方法，步驟如下：TgVPl抗原多肽與馬來酰胺活 化的匙孔血藍載體蛋白KLH偶聯(lián)，經脫鹽純化后作為免疫原與佐劑混合免疫新西蘭兔，期 間進行兩次以上免疫，待ELISA檢測血清抗體效價達1:100000后，采集兔血清，經過純化、 ELISA和western blot鑒定后，得到抗TgVPl的多克隆抗體。
[0011] 化學合成的多肽抗原是小分子，本身很難具有好的抗原性，只能誘導動物產生很 弱的免疫反應，因而與載體蛋白交聯(lián)是很重要的。載體蛋白含有很多抗原決定基，能夠刺激 T輔助細胞，進而誘導B細胞反應。用于與多肽交聯(lián)的載體蛋白有多種，其中最普遍使用的 載體是匙孔血藍蛋白（keyhole limpet hemacyanin，KLH)，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA)，卵清蛋白（ovalbumin，OVA)和牛甲狀腺球蛋白（bovine thyroglobulin， THY)。KLH具有更高的抗原性，與本發(fā)明的TgVPl抗原多肽交聯(lián)后免疫原性最強，因此本發(fā) 明選用KLH作為偶聯(lián)載體蛋白。BSA也常用來作為多肽載體，但由于BSA經常被用做檢測試 驗的阻斷劑而使得該方法生產的抗體在應用上存在著一定的局限性。
[0012] 弓形蟲TgVPl的多克隆抗體在ELISA、western-blot、免疫熒光等實驗中的應用。
[0013] 與現有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0014] 本發(fā)明對弓形蟲TgVPl蛋白氨基酸序列的二級結構、免疫原性、親疏水性、表面可 及性、跨膜域等進行分析，確定合適的一段胞外區(qū)肽序列進行人工合成；將合成的多肽與馬 來酰亞氨活化的載體mcKLH偶聯(lián)，將此偶聯(lián)產物進行脫鹽柱純化后免疫新西蘭兔；經過多 次免疫的兔血清用ELISA法對抗體效價進行檢測，效價達理想值后收集免疫兔血清，并用 Protein G蛋白純化柱純化抗體；對純化后抗體進行ELISA、Western bot等鑒定。鑒定結 果表明該多克隆抗體可特異性識別弓形蟲TgVPl蛋白。
[0015] 本發(fā)明將此純化抗體用于進行弓形蟲的ELISA、Western bot、免疫熒光染色等實 驗證明其能識別天然的TgVPl蛋白。此TgVPl的多克隆抗體為進一步研宄弓形蟲TgVPl的 功能奠定了基礎，為驗證其作為潛在抗弓形蟲病藥物靶點提供了有力的工具。
【附圖說明】
[0016] 圖1.抗TgVPl的多克隆抗體經protein G凝膠柱純化后的SDS-PAGE電泳（12% ) 檢測結果。泳道1 :蛋白Marker ;泳道2 :純化后的抗TgVPl的多克隆抗體。
[0017] 圖2.抗TgVPl的多克隆抗體的western-blot鑒定結果。泳道1 :上樣為OFTu細 胞裂解蛋白；泳道2 :上樣為弓形蟲速殖子裂解蛋白；泳道M :蛋白Marker。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于解釋本發(fā) 明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明的技術方案的前提下，對本發(fā)明所作的本 領域普通技術人員容易實現的任何改動都將落入本發(fā)明的權利要求范圍之內。
[0019] 實施例1制備弓形蟲TgVPl抗原多肽
[0020] 1.弓形蟲TgVPl多肽的設計及合成：根據GenBank上的弓形蟲TgVPl序列（登錄 號：EPT25031. 1)獲得弓形蟲TgVPl蛋白序列，含有816個氨基酸。
[0021] 2.用DNAstar軟件分析TgVPl蛋白特性，分析結果見表1，該蛋白的分子量為 85296道爾頓，等電點為4. 83,為酸性蛋白。
[0022]表 1
[0023]
【主權項】
1. 一種弓形蟲TgVPl胞外區(qū)抗原多肽，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示，或 在SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列N端連接一個半胱氨酸。
2. -種抗弓形蟲TgVPl的多克隆抗體，其特征在于以權利要求1所述弓形蟲TgVPl抗 原多肽為免疫原，免疫動物制備而成。
3. 權利要求2所述抗弓形蟲TgVPl的多克隆抗體的制備方法，其特征在于步驟如下： 權利要求1所述弓形蟲TgVPl胞外區(qū)抗原多肽與馬來酰胺活化的匙孔血藍載體蛋白KLH偶 聯(lián)，經脫鹽純化后作為免疫原與佐劑混合免疫新西蘭兔，期間進行兩次以上免疫，待ELISA 檢測血清抗體效價達1:100000后，采集兔血清，經過純化、ELISA和western blot鑒定后， 得到抗弓形蟲TgVPl的多克隆抗體。
4. 權利要求2所述抗弓形蟲TgVPl的多克隆抗體在弓形蟲TgVPl蛋白檢測中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種弓形蟲TgVP1胞外區(qū)抗原多肽、抗弓形蟲TgVP1的多克隆抗體及其應用。該弓形蟲TgVP1胞外區(qū)抗原多肽氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示或在其N端連接一個半胱氨酸。以該弓形蟲TgVP1抗原多肽為免疫原免疫新西蘭兔制備得到了抗弓形蟲TgVP1的多克隆抗體，鑒定結果表明該多克隆抗體可特異性識別弓形蟲TgVP1蛋白，可用于ELISA、Western blot、免疫熒光等試驗中弓形蟲TgVP1蛋白的檢測，為該蛋白功能的基礎研究及其作為潛在抗弓形蟲病藥物靶點的研究提供有力工具，應用前景廣闊。
【IPC分類】G01N33-569, C07K14-45, C07K16-20, G01N33-68
【公開號】CN104744580
【申請?zhí)枴緾N201510092945
【發(fā)明人】羅樹紅, 郝文波, 肖斌
【申請人】南方醫(yī)科大學
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年3月2日