專利名稱：保護(hù)性抗原Omp25c在布魯氏菌疫苗制備中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白的新用途，特別是涉及布魯氏菌疫苗株M5的重要免疫保護(hù)性抗 原0mp25c蛋白在制備布魯氏菌疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
布魯氏菌病(brucellosis，簡稱布病)是由布魯氏菌(Brucella)引起的一類 動(dòng)物源性疾病，是一種重要的人畜共患病，在世界范圍內(nèi)廣泛流行。布魯氏菌可感染人 類、多種家畜和野生動(dòng)物，病人主要癥狀為慢性關(guān)節(jié)炎及神經(jīng)損傷，病畜主要表現(xiàn)為流產(chǎn) 和不育(尚德秋.布氏菌病研究進(jìn)展.中國地方病防治雜志2004，19 =204-212 ；Corbel, Μ. J. Brucellosis :an overview. Emerg Infect Dis 1997，3 :213-21.)。布病不僅給我國畜 牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也嚴(yán)重威脅人民的健康生活。另外，布魯氏菌還被用作生物 武器，對國家安全存在著嚴(yán)重的威脅。近年來布病的發(fā)病率呈上升趨勢，我國布病的發(fā)病率 已經(jīng)超過歷史最高水平，引起相關(guān)部門的高度重視。布魯氏菌的外膜蛋白最早于20世紀(jì)80年代早期被發(fā)現(xiàn)，外膜蛋白在穩(wěn)定細(xì)菌 外膜的結(jié)構(gòu)、適應(yīng)胞內(nèi)外環(huán)境和抵抗胞內(nèi)殺菌機(jī)制等方面起著重要作用，與布魯氏菌的 毒力密切相關(guān)，同時(shí)也是免疫原性蛋白的重要來源(Schurig G G，Sriranganathan N， Corbel M J.Brucellosis vaccines :past,present and future. Vet Microbiol 2002,90 479-496.)。因此，很多有關(guān)布魯氏菌致病機(jī)制和免疫反應(yīng)機(jī)制的研究都集中在外膜蛋白 的研究上。Jos印h P. Connolly等在進(jìn)行牛布魯氏菌的免疫蛋白質(zhì)組研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)0mp25c 是牛布魯氏菌的免疫原性蛋白(Connolly，J. P. et al. Proteomicanalysis of Brucella abortus cell envelope and identification of immunogeniccandidate proteins for vaccine development. Proteomics 2006.6:3767-80.)。但并非所有的免疫原性蛋白都具 有免疫保護(hù)性，如0!11 31，8 沈等免疫原性蛋白就沒有免疫保護(hù)性。發(fā)明人在前期的羊布魯 氏菌外膜蛋白質(zhì)組研究中也發(fā)現(xiàn)，0mp25c蛋白是羊布魯氏菌外膜蛋白的主要成員，但是該 蛋白在羊布魯氏菌毒力和免疫保護(hù)性方面是否起著重要作用仍不清楚，發(fā)明人通過在疫苗 株中缺失omp25c并分析其毒力和免疫保護(hù)性的改變，來探討omp25c蛋白在布魯氏菌疫苗 中的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供0mp25c蛋白的一種新的醫(yī)藥用途。發(fā)明人的研究表明，0mp25c蛋白在布魯氏菌疫苗的保護(hù)性中起著重要作用，具有 增強(qiáng)布魯氏菌免疫保護(hù)性的作用，可以在制備布魯氏菌疫苗中得到廣泛應(yīng)用。本發(fā)明所提供的布魯氏菌疫苗的活性成份為上述可激發(fā)機(jī)體對布魯氏菌產(chǎn)生免 疫力的保護(hù)性抗原0mp25c蛋白。免疫原性蛋白0mp25c在制備布魯氏菌抗體的免疫保護(hù)性蛋白中的應(yīng)用也屬于本 發(fā)明的包括范圍。
本發(fā)明提供的免疫保護(hù)性抗原，可以在布魯氏菌疫苗株高表達(dá)，從而進(jìn)一步提高 疫苗的免疫保護(hù)效果。本發(fā)明提供一種0mp25c蛋白的新用途，即在制備布魯氏菌疫苗中的應(yīng)用。為分析 0mp25c對布魯氏菌疫苗株M5的毒力及免疫保護(hù)性的影響，本發(fā)明首先表達(dá)了 0mp25c蛋白， 確認(rèn)它們的免疫原性，然后構(gòu)建M5的omp25c基因缺失突變株，比較缺失突變株和疫苗株的 毒力和免疫保護(hù)性，對0mp25c蛋白的免疫保護(hù)性進(jìn)行分析。與M5比較，omp25c突變株在小 鼠脾臟內(nèi)的存活時(shí)間較短，在第4周時(shí)未能被檢出?？贵w水平檢測結(jié)果表明，omp25c突變株 和M5疫苗株在Balb/c小鼠體內(nèi)均能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體，但是與M5相比，突變株引起的 體液免疫應(yīng)答相對較弱，持續(xù)時(shí)間較短。而且突變株誘導(dǎo)產(chǎn)生反映體液免疫應(yīng)答的細(xì)胞因 子IL-10的水平也遠(yuǎn)比M5低。突變株和M5疫苗株的小鼠脾淋巴細(xì)胞均能分泌IFN- γ，但 是突變株IFN-Y濃度明顯低于疫苗株。免疫應(yīng)答結(jié)果表明，突變株的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答 能力明顯下降，免疫原性減弱。攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，接種了 omp25c突變株的小鼠用16M攻 毒后，免疫保護(hù)效果下降，與M5疫苗株存在顯著的差距。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與疫苗株M5相比， omp25c突變株毒力減弱，說明omp25c基因在M5疫苗株的毒力中發(fā)揮一定的作用。omp25c 的缺失使得M5誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫水平及免疫保護(hù)效果下降，說明omp25c對疫苗株M5 的免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)效果有一定的影響。由此可見，外膜蛋白0mp25c在布魯氏菌疫苗株 M5的毒力和免疫保護(hù)性方面發(fā)揮重要的作用，是布魯氏菌疫苗的關(guān)鍵成份，可以其為活性 成份制備布魯氏菌疫苗。下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為重組蛋白0mp25c的SDS-PAGE檢測結(jié)果圖2為重組蛋白0mp25c的免疫原性分析結(jié)果圖3為含突變盒N-K-C的重組質(zhì)粒pUC19K-NC的1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖4為omp25c缺失突變株的PCR鑒定結(jié)果圖5為omp25c缺失突變株在小鼠脾臟內(nèi)的存活能力檢測結(jié)果圖6為小鼠血清總IgG水平檢測結(jié)果圖7為IFN-Y檢測結(jié)果圖8為IL-10檢測結(jié)果圖9為免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。本發(fā)明中，0mp25c表示蛋白， 斜體小寫omp25c表示基因。
實(shí)施例1、0mp25c蛋白的表達(dá)及免疫原性分析一、0mp25c蛋白的表達(dá)1、表達(dá)引物的設(shè)計(jì)B. melitensis 16M已完成全基因組測序，根據(jù)GenBank中收錄的16M序列及注釋 信息(GenBank號(hào)AE008918)，用SignalP軟件分析基因的信號(hào)肽序列并去除相應(yīng)的信號(hào)肽序列，DNAMar軟件分析蛋白的抗原性及疏水性后，用I^rimer Premier 5 (PREMIERBiosoft International,Palo Alto)設(shè)計(jì) 0mp25c 蛋白的特異性表達(dá)引物BMEI18^-E_F :3，-ACGT GGATCCGACGCCGTCATTGAACAGG-5’ 和 BMEI1829-E-R 3’ -AGCTAAGCTTGAACTTGTAAGCGACACCG-5 ’。再根據(jù)表達(dá)載體PET3M的多克隆酶切位點(diǎn)信息在上游引物的5’端添加BamH I酶切位 點(diǎn)，在下游引物的5’端添加Hind III酶切位點(diǎn)。2、重組表達(dá)載體的構(gòu)建以16M基因組為模板，使用上述引物BMEI18^-E-F和BMEI1829-E-R用PCR的 方法擴(kuò)增omp25c基因。PCR反應(yīng)體系為10XPCR緩沖液5μ 1，dNTP (2. 5mM) 4 μ 1，上游 引物(20 μ Μ) 0. 5 μ 1，下游引物(20 μ Μ) 0. 5ul，rTaq 酶(5U/y 1)0. 25 μ 1，模板 DNA(10ng/ μ 1)1 μ 1，加水補(bǔ)齊至終體積 50μ 1。PCR 反應(yīng)條件為94°C 5min ；95°C 30s,56°C 30s， 72°C 60s，共30個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0反應(yīng)結(jié)束后，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，對其用BamHI和 HindIII進(jìn)行雙酶切消化，并與經(jīng)同樣酶切消化處理的pET3h載體(購自Takara公司)相 連，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞行復(fù)制，涂于含0. lmg/mL氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)過夜。長出的單克隆經(jīng)PCR及酶切鑒定正確后，送測序公司進(jìn)行測 序，結(jié)果得到序列及插入位置均正確的重組表達(dá)載體，命名為pET3h-25c。3、重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將測序正確的重組表達(dá)載體pET3h-25c轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER2566中，用含0. Img/ mL氨芐青霉素的抗性LB瓊脂平板篩選陽性克隆。將PCR鑒定呈陽性的表達(dá)克隆接種至含 0. lmg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，用0. 5mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，同時(shí)設(shè)陰性對照，用 12% SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達(dá)。陽性菌株進(jìn)行大量誘導(dǎo)，超聲裂解破碎后，分別收集 上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE，對融合蛋白進(jìn)行可溶性分析。SDS-PAGE檢測結(jié)果如圖1所示 (M =Protein Ruler III ；1 陰性對照；2 :0mp25c(42. 44kD)), omp25c 能在大腸桿菌 ER2566 中表達(dá)出與預(yù)期大小相符的蛋白44kD)。重組蛋白的陽性菌株大量誘導(dǎo)后，離心收集菌 體，用PBS懸浮，超聲裂解破碎，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行純化。二、重組蛋白0mp25c的免疫原性分析用western blotting分析重組蛋白0mp25c的免疫原性。方法為將蛋白表達(dá)產(chǎn) 物經(jīng)12% SDS-PAGE電泳后，通過濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封 閉過夜，用TBST漂洗后，用純化的兔抗布氏桿菌抗體為一抗，同時(shí)設(shè)正常兔血清作為對照， 室溫孵育Ih后，漂洗，加入1 1000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(軍事醫(yī)學(xué) 科學(xué)院微生物流行病研究所)，室溫孵育lh，漂洗后將膜浸入DAB底物溶液中，至目的條帶 清晰時(shí)終止反應(yīng)。結(jié)果如圖2所示(M =Protein Ruler III ；1 :0mp25c)，0mp25c蛋白能與 羊布魯氏菌血清結(jié)合，具有免疫原性。實(shí)施例2、omp25c突變株的構(gòu)建一、引物設(shè)計(jì)根據(jù)0mp25c基因(BMEI1829)的ORF及兩側(cè)的序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增N端和C端同源臂的 引物，N端同源臂擴(kuò)增引物為BMEI1829-N-F和BMEI1829-N-R，5’端酶切位點(diǎn)分別為KpnI 和Xho I ；C端同源臂擴(kuò)增引物為=BMEI 1829-C-F和BMEI1829-C-R，5，端酶切位點(diǎn)分別為 Sal I和Hind III。此外，分別在卡那基因的內(nèi)部及靶標(biāo)基因同源臂的外側(cè)設(shè)計(jì)突變株鑒 定引物(Pucl9K-F和BMEI1829-I-R)，用于確定omp25c基因的正確替換。設(shè)計(jì)的引物及其序列見表1。 表1引物序列引物sequence (5'-3')Pucl9K-FACGTGGATCCCTCGAGGGGCCCGCCACCTGGGATGAATGTCBMEI1829-N-FACGTGGTACCGTTTCAAGTTCCTGCCCACGBMEI1829-N-RACGTCTCGAGGCCGAGATAGGCACCATTCCBMEIl 829-C-FACGTGTCGACGACGACGCTGCCGTTACCABMEI1829-C-RACGTAAGCTTCCTGACCGCCGAAATAAGCBMEIl 829-I-RGTTGTAGCCGGTGTAAAGG二、omp25c突變盒及突變載體的構(gòu)建以16M基因組為模板，首先擴(kuò)增omp25c基因的N端同源臂，先將擴(kuò)增的同源臂N 端片段插入到pUC19K(喬鳳，陳澤良，王玉飛，等.pUC19K質(zhì)粒的構(gòu)建及其在布魯氏菌缺失 標(biāo)記株構(gòu)建中的應(yīng)用.中國生物工程雜志2007，27 :1-5.)的Kpn I和BioI位點(diǎn)，得到質(zhì)粒 PUC19K-N ；然后擴(kuò)增C端同源臂，將C端片段插入到pUC19K-N的Ml I和Hind III位點(diǎn)，得 到含有突變盒N-K-C的突變載體pUC19K-NC。為進(jìn)一步確認(rèn)N、C端同源臂的正確插入，分別 用Kpn I和Hind III雙酶切對突變載體pUC19K_NC進(jìn)行鑒定，切出突變盒N-K-C片段，1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖3所示(1 :pUC19K-NC/KpnI+HindIII ；2 :pUC19K_NC質(zhì)粒；M MarkerIII)，與預(yù)期大小一致。將鑒定正確的質(zhì)粒pUC19K_NC轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài) 細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制，涂于含0. lmg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)過夜。將長出的 單克隆經(jīng)PCR和酶切鑒定正確之后，送測序公司測序，結(jié)果得到序列及插入位置均正確的 重組表達(dá)載體PUC19K-NC。三、omp25c缺失突變體的篩選與鑒定將含突變盒的載體pUC19K-NC質(zhì)粒DNA電轉(zhuǎn)化入布魯氏菌M5電感受態(tài)細(xì)胞中，復(fù) 蘇后涂布含有50 μ g/mL卡那霉素的大豆胰蛋白胨瓊脂TSA平板(生物梅里埃公司)，37°C 培養(yǎng)3-5天，篩選AmpsKanlr抗性克隆。用突變株的鑒定引物(BMEI1^9_I_R與Pucl9K_F，序 列見表1)對抗性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果如圖4所示(M :marker III ；1 :Μ5 Δ omp25c ； 2. M5)，挑取的克隆用鑒定引物可擴(kuò)增出預(yù)期大小的產(chǎn)物(1.68Kb)，而野生株擴(kuò)增為陰性， 初步表明缺失突變株構(gòu)建是正確的。對能擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段的產(chǎn)物的抗性克隆進(jìn)行測 序確認(rèn)，結(jié)果得到omp25c基因突變體重組菌株，命名為M5A0mp25c。實(shí)施例3、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及動(dòng)物免疫選用6 8周齡Balb/c小鼠(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心)，隨機(jī)分為4組，每組 30只。第1組為M5減毒活菌苗(中國藥品生物制品檢定所)；第2組為突變株M5 Δ omp25c 免疫組，免疫劑量2 X IO5CFU/只；第3組為生理鹽水對照組，免疫劑量200 μ L/只。采取腹 膜腔注射，免疫次數(shù)為1次。二、0mp25c缺失突變株在小鼠脾臟內(nèi)的存活能力檢測分別用疫苗株M5和omp25c缺失突變株M5 Δ omp25c免疫小鼠，于免疫后的第7、14 和28天無菌取出小鼠的脾臟，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組選取5只小鼠，眼球取血后處死小鼠，迅速取 出脾臟，加入ImL含有0. 1% Triton X-100的生理鹽水，用玻璃勻漿器制成勻漿，取組織勻漿進(jìn)行10倍系列稀釋，選取適當(dāng)稀釋度的勻漿液100 μ L涂TSA平板，計(jì)算CFU。結(jié)果如圖 5所示，在各時(shí)間點(diǎn)，M5A0mp25c實(shí)驗(yàn)組脾臟中缺失突變株的數(shù)量均少于M5陽性組。第28 天時(shí)，M5的細(xì)菌數(shù)的log值為1. 2，而突變株未能被檢出。該實(shí)驗(yàn)表明omp25c缺失后，布魯 氏菌M5的胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)減少，毒力減弱。三、小鼠血清總IgG水平檢測分別于免疫后第7、14、觀、42、56天檢測小鼠血清抗體，方法為于小鼠尾部采血， 4°C過夜，4000rpm離心lOmin，分離血清待用。采用間接非競爭ELISA方法檢測血清抗體水 平。具體操作是用108CFU/mL M5滅活菌以每孔100 μ L包被酶聯(lián)板，將待測血清按1 400 稀釋，每孔100 μ L，加羊抗鼠IgG-HRP反應(yīng)，最后加底物TMB顯色，置于酶標(biāo)儀測450nm吸 光度(OD)值。結(jié)果如圖6所示，M5組在第14天就可以明顯檢測到抗體，第觀天抗體滴 度達(dá)到最高(OD45tl = 0. 84 ，第42、56天抗體水平雖略有下降，但是仍然維持在較高水平。 M5 Δ omp25c實(shí)驗(yàn)組雖然在第14天能檢測到抗體，但是不如M5陽性組顯著，抗體滴度在第 28天達(dá)到最高(OD45tl = 0. 435)，到第42天時(shí)開始下降。雖然M5 Δ omp25c的抗體滴度變化 趨勢與M5類似，但是其各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的抗體水平均明顯低于M5減毒活疫苗組(P < 0. 05)。四、細(xì)胞因子檢測1、小鼠脾細(xì)胞的分離在免疫后的不同時(shí)間點(diǎn)，從每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中各取3只小鼠處死并無菌取脾，以200目 銅網(wǎng)分離出單細(xì)胞，將脾細(xì)胞加入離心管中l(wèi)OOOrpm/min離心15min后棄上清。以低滲紅 細(xì)胞裂解液室溫避光裂解紅細(xì)胞15min，離心棄上清。再以30mL含2%小牛血清的1640培 養(yǎng)基將細(xì)胞洗2次，以含10%小牛血清的1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，最終將細(xì)胞濃度 稀釋為5X106/mL。2、體外刺激將免疫和對照小鼠脾細(xì)胞分別取100 μ L加入細(xì)胞培養(yǎng)板(5X IO5細(xì)胞/孔)，不同 菌株取100 μ L加入相應(yīng)的孔，每孔IO8CFU,每種菌株重復(fù)3孔。分別以100 μ L的ConA (濃 度為5μ g/mL，Sigma公司)和1640完全培養(yǎng)基為陽性和陰性對照。混合物培養(yǎng)在37°C、 飽和濕度和5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，72h后取上清檢測IFN-Y和ILlO。測IFN-y/ILlO的試 劑盒采用R & D System公司的Mouse IFN- y /IL-10 Immunoassay Kit，將稀釋好的細(xì)胞上 清樣品加入到酶聯(lián)板孔中，用雙抗夾心方法，反應(yīng)后測其OD45tl值。3、IFN-γ 檢測布魯氏菌是一種胞內(nèi)寄生菌，細(xì)胞免疫的意義大于體液免疫。因此本發(fā)明檢測 了在M5和M5A0mp25c免疫過程中小鼠血清細(xì)胞因子IFN-γ的水平，結(jié)果如圖7所示。 與PBS對照組相比，Μ5菌株在免疫后7天即激發(fā)了一定程度的細(xì)胞免疫，隨后IFN-Y水 平持續(xù)上升，并且在監(jiān)測的42天達(dá)到了最高值，在免疫后第56天，濃度還維持在較高水 平。M5Aomp25c組在14天時(shí)誘導(dǎo)了一定水平的IFN-γ，觀天時(shí)達(dá)到最高峰，但在42天時(shí) IFN-Y水平已經(jīng)開始下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，omp25c缺失以后，布魯氏菌誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-Y的 水平明顯降低。說明0mp25c蛋白在布魯氏菌M5的細(xì)胞免疫中發(fā)揮了重要的作用。4、IL-10 檢測據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，IL-10主要是在布魯氏菌的體液免疫中發(fā)揮一定的作用。因此本發(fā) 明檢測了在M5和M5 Δ omp25c免疫過程中小鼠血清細(xì)胞因子IL-10的水平，結(jié)果如圖8所示。與PBS對照組相比，M5及M5 Δ omp25c均能誘導(dǎo)一定水平的IL-10，而且變化趨勢大致 接近。在免疫后42天時(shí)達(dá)到最高峰，而后下降。但整體來說，M5A0mp25c組IL-10的水平 低于M5組。結(jié)合小鼠血清總IgG水平檢測，說明0mp25c蛋白在布魯氏菌M5的體液免疫中 也發(fā)揮了重要的作用。五、免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)于小鼠免疫后第8周進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，腹膜腔內(nèi)注射強(qiáng)毒株16M(中國藥品生物制品 檢定所)，IO5Cfu/只。攻毒后第1、2、4周處死小鼠，無菌取脾臟，研磨，稀釋后接種于TSA平 板，培養(yǎng)3 4天，菌落計(jì)數(shù)，IogltlCFU士SD的平均值即為每組的攻毒結(jié)果。結(jié)果如圖9所 示，用布魯氏菌16M強(qiáng)毒株攻毒后，與PBS組比較，M5A0mp25c沒有產(chǎn)生明顯的保護(hù)力，而 且較M5減毒活疫苗的免疫保護(hù)效果差異顯著(P < 0. 05)。結(jié)果表明，omp25c缺失突變株 的免疫保護(hù)效果明顯下降，再次說明0mp25c蛋白對布魯氏菌M5具有一定的免疫保護(hù)性。布魯氏菌是一種胞內(nèi)寄生的細(xì)小的球狀桿菌，在胞內(nèi)有極強(qiáng)的生存能力，使得布 魯氏菌引起的感染一旦發(fā)生，很難徹底治愈。外膜蛋白與布魯氏菌的毒力密切相關(guān)，同時(shí)也 是免疫原性蛋白的重要來源。但是尚沒有人研究0mp25c蛋白在毒株及疫苗株的毒力和免 疫保護(hù)性中發(fā)揮的作用。在上述實(shí)施例中，我們挑選了我國最常用的羊布魯氏菌減毒活疫 苗株M5作為靶標(biāo)，對M5進(jìn)行基因突變改造，構(gòu)建了布魯氏菌外膜蛋白o(hù)mp25c基因的缺失 突變株。探討了缺失突變株的毒力、免疫原性及保護(hù)性，從而分析0mp25c蛋白在疫苗株M5 毒力和免疫保護(hù)性中發(fā)揮何等作用。在上述實(shí)施例中，我們首先表達(dá)了 0mp25c蛋白，分析了它們的抗原性。結(jié)果表明 0mp25c蛋白可以和羊布魯氏菌血清結(jié)合，具有免疫原性。接著，我們進(jìn)一步分析了 0mp25c 蛋白對M5疫苗株的毒力和免疫保護(hù)性的影響。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，0mp25c蛋白與布魯氏菌 的毒力相關(guān)，缺失該基因的缺失突變株對小鼠的毒力明顯減弱，不能在小鼠體內(nèi)長期存活。 抗體水平檢測結(jié)果表明，omp25c突變株和疫苗株M5在Balb/c小鼠體內(nèi)均能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異 性抗體，但是與M5相比，突變株引起的體液免疫應(yīng)答相對較弱，持續(xù)時(shí)間較短。而且突變株 誘導(dǎo)產(chǎn)生反映體液免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子IL-10的水平也遠(yuǎn)比M5低。布魯氏菌感染宿主后寄 生于巨噬細(xì)胞內(nèi)，因此引起的機(jī)體免疫應(yīng)以細(xì)胞免疫為主。即布魯氏菌激發(fā)抗原遞呈細(xì)胞， 弓 1 Th Thl (Mosmann T R, Sad S. The expanding universe of T-cell subset :Thl, Th2 and more. Immunol Today, 1996,17 :138-146), Thl 細(xì)胞分泌 IFN-γ 從 而上調(diào)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，同時(shí)還能直接殺滅布魯氏菌感染的巨噬細(xì)胞達(dá)到保護(hù)宿主的 巨的(Murphy A, Sathiyaseelan J, Parent MA, et al. Interferon-gamma is crucial for survivinga Brucella abortus infection in both resistant C57B/6 and susceptible Balb/cmice. Immunology 2003,19 :218-220)。因此，有效的布魯氏菌疫苗必須能誘導(dǎo)以產(chǎn) 生IFN- γ為特征的Thl型免疫反應(yīng)。突變株和疫苗株M5免疫小鼠后，小鼠脾淋巴細(xì)胞均能 分泌IFN-Y，但是突變株IFN-γ濃度明顯低于疫苗株。免疫應(yīng)答結(jié)果表明，突變株的體液 和細(xì)胞免疫應(yīng)答能力明顯下降，免疫原性減弱，說明0mp25c在M5疫苗的體液免疫及細(xì)胞免 疫過程中都發(fā)揮了重要的作用，能夠增強(qiáng)疫苗的細(xì)胞和體液免疫。另外，從攻毒結(jié)果來看， 缺失了 omp25c的突變株喪失了良好的保護(hù)性，與疫苗株M5存在顯著的差距，顯示omp25c 對減毒活疫苗株M5的免疫保護(hù)效果有一定的影響。由此可見，外膜蛋白0mp25c在布魯氏 菌疫苗株M5的毒力和免疫保護(hù)性方面發(fā)揮重要的作用，能夠增強(qiáng)疫苗的免疫保護(hù)作用，可以其為活性成份制備布魯氏菌疫苗。利用外膜蛋白0mp25c進(jìn)行布魯氏菌疫苗的制備可采 用現(xiàn)有常規(guī)方法，本文不予贅述。
權(quán)利要求
1.0mp25c蛋白在制備布魯氏菌疫苗中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于為免疫原性蛋白0mp25c在制備布魯氏菌 抗體的免疫保護(hù)性蛋白中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了布魯氏菌的一種保護(hù)性抗原Omp25c蛋白及其在制備布魯氏菌疫苗中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與野生型疫苗株相比，omp25c突變株毒力減弱，說明omp25c基因在疫苗株的毒力中發(fā)揮一定的作用。omp25c缺失株誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫水平及免疫保護(hù)效果均下降，說明omp25c對疫苗株的免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)效果有促進(jìn)作用。由此可見，Omp25c蛋白是布魯氏菌的一個(gè)重要保護(hù)性抗原，能夠增強(qiáng)疫苗株誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)及其保護(hù)效果，以其為活性成份制備布魯氏菌疫苗，可提高疫苗的免疫保護(hù)效果。
文檔編號(hào)A61K39/10GK102038941SQ20091023649
公開日2011年5月4日 申請日期2009年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月23日
發(fā)明者孫巖松, 徐杰, 曲勍, 杜昕穎, 汪舟佳, 王玉飛, 鐘志軍, 陳澤良, 黃留玉 申請人:中國人民解放軍疾病預(yù)防控制所