一種重組褐藻膠裂合酶的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種重組褐藻膠裂合酶的制備方法。具體地，本發(fā) 明涉及一種利用重組大腸桿菌制備褐藻膠裂合酶的方法。
【背景技術】
[0002] 銅綠假單胞菌aeri/giflosa，又稱綠膿桿菌）是臨床最常見的條件致 病菌之一，可導致多種急性和慢性感染，如囊性纖維化（白種人人群中最普遍的遺傳?。┎?人和彌漫性泛細支氣管炎患者的慢性肺炎，以及細菌性心內(nèi)膜炎、角膜炎、慢性中耳炎、膽 道感染和尿路感染等。由銅綠假單胞菌引起的醫(yī)院內(nèi)感染占10%~30%，而下呼吸道感染率 更高，居病原菌之首。近年來隨著各種假體、移植物等生物材料和各種內(nèi)置式導管的廣泛應 用，銅綠假單胞菌導致的感染日趨增多。
[0003] 銅綠假單胞菌的耐藥性有多種機制，包括：生物被膜（Biofilm)形成、抗生素修飾 酶的生成、青霉素結合蛋白改變、外膜低滲透、外膜孔蛋白缺失和主動外排泵系統(tǒng)等，其中 生物被膜的形成是銅綠假單胞菌產(chǎn)生抗生素耐藥的主要原因之一。生物被膜是指由附著于 組織或生物材料表面的細菌細胞和包裹著細菌的由細菌自身所分泌的含水聚合性基質所 組成的結構性細菌群落，是細菌生長過程中為適應生存環(huán)境而形成的一種與浮游細胞相對 應的存在形式。銅綠假單胞菌極易形成生物被膜，形成了生物被膜的銅綠假單胞菌具有極 強的耐藥性（比游離的細菌提高100 - 1000倍)和抵抗機體免疫系統(tǒng)作用的能力，造成臨床 上難治性、持續(xù)性感染。
[0004] 銅綠假單胞菌的生物被膜由胞外多聚物包括乙?；衷迥z（acetylated alginate)、DNA、蛋白質等成分組成，其中乙?；衷迥z是生物被膜的主要組成部分，決定 了生物膜的結構和功能，并且決定了生物被膜的物理性質與生物學特性。褐藻膠裂合酶 (alginate lyase)可通過β -消去反應催化褐藻膠的降解，在非還原性末端生成C4, 5雙 鍵。但絕大多數(shù)褐藻膠裂合酶不能降解銅綠假單胞菌產(chǎn)生的乙酰化褐藻膠。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種利用重組大腸桿菌制備褐藻膠裂合酶的方法。
[0006] 本發(fā)明的褐藻膠裂合酶制備方法是通過如下技術方案實現(xiàn)的。
[0007] 大腸桿菌 BL21 (DE3) /pET24-algL 在 LB 培養(yǎng)液中 30-37°C 100-300 r/min 振蕩培 養(yǎng)至0D_=0. 5-2. 0,按照1-10% (v/v)的接種量接種到裝有LB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，當菌體 長至0D6QQ=0. 5-5. 0時，加入終濃度為0. 1-1. 0 mM的IPTG，在15-20°C誘導24-72 h ;將發(fā)酵 液離心，收集菌體，超聲破碎細菌，上清液上樣于鎳離子親和層析柱，用咪唑梯度洗脫，收集 活性組分。
[0008] 本發(fā)明所用的a辦Z基因可利用中國發(fā)明專利申請03138824. 8提供的方法制備。 發(fā)酵液體積為1-1000 L。
[0009] 本發(fā)明的純化方法可以得到純度95%的褐藻膠裂合酶，回收率達到70%以上，具有 工藝簡單、容易控制、純化效果好、回收率高、成本低的優(yōu)點。
【附圖說明】
[0010] 圖1 :大腸桿菌BL21(DE3)/pET24-algL在5 L發(fā)酵罐中的發(fā)酵曲線。
[0011] 圖2 :純化后的褐藻膠裂合酶的SDS-PAGE圖譜。
【具體實施方式】
[0012] 實施例1利用重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)褐藻膠裂合酶AlgL。
[0013] 將保存在-80°C的大腸桿菌BL21 (DE3) /pET24-algL在LB平板上劃線，30-37°C培 養(yǎng)過夜；挑取單克隆至LB培養(yǎng)液中，30-37°C 100-300 r/min振蕩培養(yǎng)至0D6M=0. 5-2. 0,根 據(jù)發(fā)酵罐體積決定種子液體積和轉接次數(shù)；按照1-10% (v/v)的接種量接種到5 L發(fā)酵罐 中，發(fā)酵罐中裝入LB培養(yǎng)基，裝液量為50-80%，初始通氣為1 vvm，初始攪拌轉速為350 r/ min，溫度控制為30-40 °C，pH控制在6. 0-8. 0,通過調(diào)節(jié)通氣量和轉速控制溶氧在15-40% ; 當菌體長至0D6QQ=0. 5-5. 0時，加入終濃度為0. 1-1. 0 mM的IPTG，在15-20°C誘導24-72 h。
[0014] 實施例2重組褐藻膠裂合酶AlgL的純化。
[0015] 將發(fā)酵液0-30 °C 3000-12000 r/min離心5-30 min，收集菌體，重懸于含有500 mM NaCl的50 mM磷酸鹽緩沖液（pH 7. 6);利用超聲完全破碎細菌，0-30 °C 3000-12000 r/ min離心5-30 min,收集上清液；上清液上樣于鎳離子親和層析柱，用咪唑梯度洗脫，收集 洗脫組分，根據(jù)酶活測定結果合并活性組分；活性組分對50 mM磷酸鹽緩沖液（pH 7.6)進 行透析過夜，分裝后儲存在_20°C。
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【主權項】
1. 一種重組褐藻膠裂合酶的制備方法，其特征在于，該方法包括： (1) 將保存在-80°C的大腸桿菌BL21 (DE3)/pET24-algL在LB平板上劃線，30-37°C培 養(yǎng)過夜； (2) 挑取單克隆至LB培養(yǎng)液中，30-37°C 100-300 r/min振蕩培養(yǎng)至0D6M=0. 5-2. 0,根 據(jù)發(fā)酵罐體積決定種子液體積和轉接次數(shù)； (3) 按照1-10% (v/v)的接種量接種到發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中裝入LB培養(yǎng)基，裝液量為 50-80%，初始通氣為1 vvm，初始攪拌轉速為350 r/min，溫度控制為30-40 °C，pH控制在 6. 0-8. 0,通過調(diào)節(jié)通氣量和轉速控制溶氧在15-40% ;當菌體長至0D6QQ=0. 5-5. 0時，加入終 濃度為 〇· 1-1. 〇 mM 的 IPTG，在 15-20°C誘導 24-72 h ; (4) 將發(fā)酵液離心，收集菌體，重懸于含有500 mM NaCl的50 mM磷酸鹽緩沖液（pH 7. 6);利用超聲完全破碎細菌，離心，收集上清液；上清液上樣于鎳離子親和層析柱，用咪唑 梯度洗脫，收集洗脫組分，根據(jù)酶活測定結果合并活性組分；活性組分對50 mM磷酸鹽緩沖 液（pH 7. 6)進行透析過夜，分裝后儲存在-20°C。2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的離心轉速為3000-12000 r/min，離心 溫度為0-30 °C，離心時間為5-30 min。3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵罐體積從1升到1000升。4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所得到的重組褐藻膠裂合酶AlgL純度達到 95%，回收率達到70%以上。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種重組褐藻膠裂合酶的制備方法。本發(fā)明將重組大腸桿菌在發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)，加入誘導劑誘導產(chǎn)酶；離心收集菌體，超聲破碎后離心，收集上清液，利用親和層析得到純度95%的褐藻膠裂合酶，回收率達到70%以上。本發(fā)明的制備方法適用于中試和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)褐藻膠裂合酶，具有工藝簡單、容易控制、純化效果好、回收率高、成本低的優(yōu)點。
【IPC分類】C12R1/19, C12N9/88
【公開號】CN105624136
【申請?zhí)枴緾N201410595013
【發(fā)明人】于文功, 韓峰, 路新枝
【申請人】中國海洋大學
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2014年10月30日