一種褐藻膠裂解酶Algb及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)計(jì)一種褐藻膠裂解酶基因 algb。本發(fā)明還提供了含有該基因的載體和大 腸桿菌重組菌株及其表達(dá)產(chǎn)物的生產(chǎn)方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 褐藻膠是由ct -L-古羅糖醛酸（G)和β -D-甘露糖醛酸（M)兩種單糖醛酸組成的 線型酸性多糖，廣泛地存在于海帶、裙帶菜等大型褐藻類植物細(xì)胞壁中。隨著糖生物學(xué)與糖 化學(xué)研究的逐步深入，許多海洋寡糖，尤其是褐藻膠的降解產(chǎn)物-褐藻膠寡糖具有多種生 物學(xué)活性。例如，低聚合度的褐藻膠寡糖具有降血脂、抗病毒、抗腫瘤以及抗氧化等生物學(xué) 活性，有的已經(jīng)開(kāi)發(fā)為藥品。以褐藻膠為原料制備褐藻膠寡糖有多種方法：酸解法、氧化降 解法、超聲降解法和酶降解法。
[0003] 其中，酸解法和氧化降解法降解條件難以控制，操作較為復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)。超聲降解 法一般與其他降解法共同使用，降解產(chǎn)物聚合度高，不易制得寡糖；酶法降解相對(duì)于其他降 解方法具有降解條件溫和，反應(yīng)條件易于控制，產(chǎn)物特異性強(qiáng)，得率高等優(yōu)點(diǎn)，因此成為制 備褐藻膠寡糖的首選方法。
[0004] 制備褐藻膠寡糖所使用的酶即褐藻膠裂解酶，屬于多糖裂解酶家族成員，能夠催 化糖醛酸單元之間的1，4糖苷鍵發(fā)生水解，在斷裂后新形成的非還原端生成雙鍵。按照其 底物特異性的差異，褐藻膠裂解酶可以分為三類：專一性降解聚甘露糖醛酸的聚甘露糖醛 酸裂解酶（EC4. 2. 2. 3)、專一性降解聚古羅糖醛酸的聚古羅糖醛酸裂解酶（EC4. 2. 2. 11)和 能降解上述兩種片段的雙功能褐藻膠裂解酶。由于其具有底物專一性，褐藻膠裂解酶主要 用于制備特異性結(jié)構(gòu)的褐藻膠寡糖，研究褐藻膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)等方面；此外，褐藻膠裂解酶還 可以應(yīng)用于治療肺囊腫性纖維化，制備海帶等大型褐藻的原生質(zhì)體等。
[0005] 褐藻膠裂解酶主要來(lái)源于海洋動(dòng)植物（包括海洋軟體動(dòng)物、海洋藻類）和多 種微生物（包括海洋細(xì)菌、土壤細(xì)菌和真菌）。根據(jù)其底物特異性不同，可分為兩大類： 專一性降解聚甘露糖醛酸的裂解酶（EC4. 2. 2. 3)和專一性降解聚古羅糖醛酸的裂解酶 (EC4. 2. 2. 11);此外還有一些能夠降解上述兩種片段的雙功能裂解酶，主要是來(lái)源于交替 假單胞菌勵(lì)272(?8611(1〇3]^61'01]101^3 3口.勵(lì)272)的褐藻膠裂解酶417;從交替假單胞菌 Pseudoaltermonas sp.SM0524 中分離得到的 AlySJ-〇2 ;從 Isoptericola halotolerans 分 離得到褐藻膠裂解酶以及從麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomsa maltophilia KJ-2)克隆得 到的褐藻膠裂解酶；以上四種裂解酶均具有降解PM和PG的能力，降解產(chǎn)物多為DP2-6的 寡糖。雙功能的褐藻膠裂解酶由于其廣泛的底物特異性而在工業(yè)生產(chǎn)上具有重要的應(yīng)用價(jià) 值，主要用于褐藻膠寡糖的生產(chǎn)。本發(fā)明所涉及的褐藻膠裂解酶具有降解兩種片段的能力， 并且在廣泛的pH范圍內(nèi)具有良好的活性與穩(wěn)定性，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種新型褐藻膠裂解酶Algb及其編碼基因。
[0007] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種制備新型褐藻膠裂解酶Algb的方法。
[0008] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供新型褐藻膠裂解酶Algb基因重組表達(dá)質(zhì)粒和重組基 因工程菌株。
[0009] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供新型褐藻膠裂解酶Algb在褐藻膠降解中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明所提供的褐藻膠裂解酶Algb,來(lái)源于弧菌菌株Vibrio alginolyticus 40B，其氨基酸序列具有如下特征之一：
[0011] 1)序列表中的SEQ ID N0. 2從氨基端開(kāi)始的第1-478位氨基酸殘基序列。
[0012] 2)將序列表中的SEQ ID N0. 2從氨基端開(kāi)始的第1-478位氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)氨 基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加后具有降解褐藻膠活性的蛋白質(zhì)。
[0013] 本發(fā)明提供了新型褐藻膠裂解酶Algb的編碼基因（命名為algb)，具有下述核苷 酸序列特征之一：
[0014] 1)序列表中SEQ ID NO. 1的脫氧糖核酸（DNA)序列；
[0015] 2)編碼序列表中SEQ ID NO. 1氨基酸序列的脫氧核糖核酸（DNA)序列；
[0016] 本發(fā)明的新型褐藻膠裂解酶Algb的氨基酸序列及其核苷酸編碼序列也可以根據(jù) 預(yù)測(cè)的Algb的氨基酸序列及其核苷酸序列人工合成獲得。
[0017] 制備重組酶Algb的方法，是將編碼基因 algb克隆到重組表達(dá)載體，導(dǎo)入宿主細(xì) 胞，獲得重組表達(dá)的褐藻膠裂解酶。
[0018] 所述的重組表達(dá)內(nèi)切褐藻膠裂解酶Algb的表達(dá)載體可以是大腸桿菌表達(dá)載體、 酵母表達(dá)載體、枯草桿菌表達(dá)載體、乳酸菌表達(dá)載體、鏈霉菌表達(dá)載體、噬菌體載體、絲狀真 菌表達(dá)載體、植物表達(dá)載體、昆蟲表達(dá)載體、或哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體等。
[0019] 用于重組表達(dá)褐藻膠裂解酶Algb的重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，可以是大腸桿菌宿 主細(xì)胞（如 Escherichia coli BL21>Escherichia coli JM109>Escherichia coli DH5 a 等）、酵母菌宿主細(xì)胞（如Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis 等）、枯草桿菌宿主細(xì)胞（如 Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis 9920 等）、乳酸菌宿主細(xì)胞（如Lactic acid bacteria C0CC101等）、放線菌宿主細(xì)胞（如 Streptomyces spp.等）、絲狀真菌宿主細(xì)胞（如 Trichoderma viride，Trichoderma reesei, Aspergillus niger、Aspergillus nidulans 等）、昆蟲細(xì)胞（如 Bombyx mori, Antharaea eucalypti等）或哺乳動(dòng)物細(xì)胞（如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CH0,幼小倉(cāng)鼠腎臟細(xì)胞 BHK、中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞CHL等）。
[0020] 本發(fā)明的新型褐藻膠裂解酶Algb來(lái)源于弧菌菌株Vibrio alginolyticus40B，通 過(guò)基因組挖掘技術(shù)，分析Vibrio alginolyticus40B基因組中可能的褐藻膠裂解酶基因，依 據(jù)同源序列通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物，克隆得到褐藻膠裂解酶Algb全長(zhǎng)編碼基因，該基因編碼 區(qū)長(zhǎng)1437bp，編碼478個(gè)氨基酸，分子量約為54. 12kDa，屬于多糖裂解酶家族7。大腸桿菌 表達(dá)獲得重組酶Algb，以褐藻膠為底物時(shí)，在30°C、ρΗ8· 0條件下具有最高酶活力，比活力 達(dá)到 48. 79U/mg。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1 :新型褐藻膠裂解酶Algb的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型：整體結(jié)構(gòu)為手套狀_β -三 明治結(jié)構(gòu)（glove-like-β-sandwich)，其中包含 3 個(gè)小螺旋結(jié)構(gòu)（HI :22-26 ;H2 :76-79 ; H3 :185-189)以及2個(gè)反向平行的β-折疊片A和B，A包含8個(gè)β-strand結(jié)構(gòu)，B包含7 個(gè)β -strand結(jié)構(gòu)。
[0022] 圖2 :新型褐藻膠裂解酶Algb表達(dá)及純化的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖（SDS-PAGE)。 各泳道加入的樣品分別是：M:蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量（marker)，條帶自上到下順序?yàn)椋?70kDa， 130kDa，110kDa，70kDa，55kDa，40kDa，35kDa，25kDa ;泳道 1 :重組菌體破碎后上清，上樣量 為10 μ 1，泳道2 :重組菌破碎后上清經(jīng)鎳柱純化的流出液，上樣量10 μ 1 ;泳道3: lOmmol咪 唑洗脫液，上樣量10 μ 1 ;泳道4 :20mmol咪唑洗脫液，上樣量10 μ 1 ;泳道5 :50mmol咪唑洗 脫液，上樣量10 μ 1 ;泳道6 :250mmol咪唑洗脫液，上樣量10 μ 1。
[0023] 圖3 :溫度對(duì)于褐藻膠裂解酶Algb活性的影響。
[0024] 圖4 :pH對(duì)于褐藻膠裂解酶Algb活性的影響。
[0025] 圖5 :溫度對(duì)于褐藻膠裂解酶Algb的穩(wěn)定性的影響。
[0026] 圖6 :pH對(duì)于褐藻膠裂解酶Algb的穩(wěn)定性的影響。
[0027] 圖7 :褐藻膠裂解酶Algb的底物偏好性曲線。
[0028] 圖8 :褐藻膠裂解酶對(duì)于三種底物的降解產(chǎn)物ESI-MS圖譜。A :褐藻膠底物的降解 產(chǎn)物的ESI-MS譜圖，B :polyM底物的降解產(chǎn)物的ESI-MS譜圖，C :polyG底物的降解產(chǎn)物的 ESI-MS 譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 實(shí)施例lVibrio alginolyticus 40B的培養(yǎng)及菌株基因組DNA提取
[0030] 所采用的菌種為弧菌Vibrio alginolyticus,挑取菌株的單克隆菌落接種到50ml 液體培養(yǎng)基中，接著放入溫度為30°C、轉(zhuǎn)數(shù)為220rpmin的搖床培養(yǎng)24小時(shí)后，將培養(yǎng)液離 心收集菌體并丟棄上清培養(yǎng)基。
[0031] 使用的液體培養(yǎng)基配方為（g/L):牛肉膏5g、葡萄糖15g、酵母浸粉1. 0g、NaCl 5. 0g