前列腺癌特異性pap-gm-csf-il-6基因重組融合蛋白及其制備方法
【專利說明】前列腺癌特異性PAP-GM-CSF-1L-6基因重組融合蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種基因重組蛋白的制備，特別涉及前列腺癌特異性PAP-GM-CSF-1L-6基因重組融合蛋白的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]前列腺癌在西方國家男性高發(fā)的惡性腫瘤中，其死亡率高居癌癥死亡率的第二位，僅次于肺癌。自20世紀(jì)90年代起，前列腺癌的實驗研究在我國受到了重視并迅速開展，然而晚期前列腺癌和雄激素非依賴階段的列腺癌，對其相關(guān)的發(fā)病機制知之甚少，尚無有效的治療方法，當(dāng)前的研究仍然處于摸索階段，還需要通過大量的體內(nèi)外實驗進一步深入的探索。2008年12月，美國FDA正式批準(zhǔn)DC誘導(dǎo)的腫瘤免疫治療應(yīng)用于臨床，目前應(yīng)用的腫瘤抗原有多種，包括腫瘤細胞裂解物、腫瘤相關(guān)全抗原、蛋白多肽、蛋白單肽等，現(xiàn)有的DC疫苗制備方法中大多數(shù)采用腫瘤組織塊或癌相關(guān)蛋白作為靶向物質(zhì)，負(fù)載效率低，靶向性較低，特異性較差。
[0003]前列腺特異性酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase，PAP)是酸性磷酸酶同工酶，由前列腺上皮細胞溶酶體產(chǎn)生，是一種由兩個相同亞單位組成的糖蛋白，其分子量為100kD。在前列腺癌時，血清中PAP水平明顯升高，且其升高程度與前列腺癌的病情基本呈平行關(guān)系。當(dāng)病情好轉(zhuǎn)，PAP水平降低，常提示癌癥有復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良。研究還發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用抗PAP抗體，能夠有效檢測出循環(huán)血中游離的癌細胞(Circulating tumor cells, CTC)，并且對腹腔廣泛轉(zhuǎn)移和種植所致腹水，具有良好的療效。因而，PAP可作為前列腺腫瘤極好的靶標(biāo)和抗原，應(yīng)用于腫瘤檢測及腫瘤特異性細胞免疫治療。
[0004]粒細胞-巨卩蜜細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor, GM-CSF)是一種多小性的細胞因子，可促進DC等APCs的分化、成熟和活化，也可增加DC表面的主要組織相容復(fù)合物Π，促進腫瘤抗原的有效遞呈。GM-CSF對于紅細胞和巨核細胞的增值和分化也起到促進作用，在DC的培養(yǎng)過程中，GM-CSF是不可或缺的細胞因子，促進DC的活化能力，從而增強DC疫苗的抗原提成能力，從而促進抗原特異性細胞毒T淋巴細胞(Cytotoxicity T lymphocytes, CTL)的殺傷功能。
[0005]白細胞介素-6(Interluekin-6，IL-6)，是一種具有多功能的生物活性多膚物質(zhì)，主要來源于單核巨噬細胞，部分來自于T、B淋巴細胞、成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞，某些腫瘤細胞也能產(chǎn)生IL-6<JL-6在促進機體免疫應(yīng)答、增強骨髓造血、提高自身免疫和機體防御能力等方面均具有重要作用。它的作用主要體現(xiàn)在ThZ型免疫反應(yīng)中，對多種細胞的增殖都具有促進作用，如刺激雜交瘤、漿細胞瘤和骨髓瘤生長;刺激T細胞生長;促進EBV轉(zhuǎn)化的B細胞生長;促進造血干細胞生長及刺激腎小球系膜生長等。它對髓樣白血病細胞系的生長具有抑制作用；還能抑制黑素瘤、乳腺癌細胞等的生長增殖。并可作為某些中性細胞的催化劑，與其他細胞因子協(xié)同作用從而促進骨髓干細胞的成熟。因此IL-6在人類疾病的治療上，常用于治療由放療、化療所引起的血小板減少癥、癌癥等疾病或者作為疫苗的強效佐劑應(yīng)用于臨床試驗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于應(yīng)用基因重組技術(shù)，將前列腺癌特異性PAP、GM-CSF及IL-6重組偶聯(lián)，制備成高純度的PAP-GM-CSF-1L-6融合蛋白，為細胞免疫治療提供一種能促進DC疫苗抗原遞呈功能的前列腺癌特異性重組蛋白抗原，從而顯著提高細胞免疫治療的臨床療效。
[0007]本發(fā)明提供一種前列腺癌特異性PAP-GM-CSF-1L-6基因重組融合蛋白，三種蛋白的氨基酸序列均為已知序列。
[0008]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:提供前列腺癌特異性PAP-GM-CSF-1L-6基因重組融合蛋白的制備方法，所述的重組蛋白的連接順序為PAP-1 inkerl-GM-CSF-1 inker2-1L_6，所述方法步驟如下:
(1)引物的設(shè)計與合成；
(2)基因擴增和測序；
(3 )重組載體pcDNA3.1-PAP-GM-CSF-1L-6 的構(gòu)建；
(4)重組載體pcDNA3.1-PAP-GM-CSF-1L-6 的篩選、鑒定；
(5)重組質(zhì)粒pcDNA3.1-PAP-GM-CSF-1L-6 轉(zhuǎn)染 HEK293 細胞株；
(6)重組PAP-GM-CSF-1L-6融合蛋白在HEK293細胞株內(nèi)表達；
(7)重組PAP-GM-CSF-1L-6融合蛋白的純化；
(8 )純化的PAP-GM-CSF-1L-6融合蛋白滲透濃縮。
[0009]在所述(I)引物的設(shè)計與合成，如下所述:
PAP上游引物序列為:
57 CTAGCTAGCCGGCTCTCCTCAACATGAG 37 (見序列表 I);
下游引物序列為:
57 GCCGCTCGAGATCTGTACTGTCCTCAGT 37 (見序列表2);
其上下游引物分別引入了限制性內(nèi)切酶NheI和XhoI的酶切位點。
[0010]Linkerl的氨基酸序列(見序列表3);
GM-CSF的氨基酸序列(見序列表4);
其GM-CSF氨基酸序列前后加入限制性內(nèi)切酶Xho I和BamHI酶切位點。
[0011]Linker2的氨基酸序列(見學(xué)列表5);
IL-6上游引物序列為:
S7AtatggatccggtggctctggatctccagtacccccaggagS7 (見序列表 6)；
下游引物序列為:
57 TGGGGTACCCATTTGCCGAAGAGCCCTCA37 (見序列表7)；
其上下游引物分別引入了限制性內(nèi)切酶BamHI和KpnI的酶切位點。
[0012]在所述(2)基因擴增和測序的步驟，從前列腺癌細胞株P(guān)C-3M中提取RNA，然后反轉(zhuǎn)ScDNA，以cDNA為模板，PCR擴增PAP基因，切膠回收目的片段，將該片段連接至T載體，轉(zhuǎn)化DH5a，PCR擴增鑒定陽性斑，提取陽性斑的質(zhì)粒并測序。GM-CSF序列為生工生物工程(上海)股份有限公司合成基因。人外周血單核細胞中提取RNA，反轉(zhuǎn)為cDNA，以cDNA為模板，PCR擴增IL-6基因，切膠回收目的片段，將該片段連接至T載體，轉(zhuǎn)化DH5a，PCR擴增鑒定陽性斑，提取陽性斑的質(zhì)粒并測序。
[0013]在所述(3)重組載體pcDNA3.1-PAP-GM-CSF-1L-6的構(gòu)建的方法，用限制性內(nèi)切酶NheI和XhoI酶切測序正確、連有PAP的T載體，切膠回收PAP片段；用限制性內(nèi)切酶BamHI和kpnl酶切測序正確、連有IL-6的T載體，切膠回收IL-6片段;載體pcDNA3.1用限制性內(nèi)切酶NheI和kpnl，切膠回收載體;然后把PAP片段、GM-CSF片段、IL-6片段以及載體用T4連接酶進行連接。
[0014]在所述(4)重組載體pcDNA3.1-PAP-GM-CSF-1L-6的篩選、鑒定步驟中，CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)DH5a，然后將以上連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，PCR方法擴增篩選陽性重組載體，對陽性斑進行質(zhì)粒提取，并進行酶切鑒定。
[0015]在所述(5)重組質(zhì)粒pcDNA3.1-PAP-GM-CSF-1L-6轉(zhuǎn)染HEK293細胞株中方法，將陽性重組載體和Lipofectamine?2000(Invitrogen)加入HEK293細胞中，37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0016]在所述(6)重組PAP-GM-CSF-1L-6融合蛋白在HEK293細胞株內(nèi)表達，將重組載體轉(zhuǎn)入HEK293細胞內(nèi)培養(yǎng)48h，收集細胞加入蛋白抽提試劑，冰上孵育20分鐘，讓細胞充分裂解，于4°C，17000g離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清至新管中。
[0017]在所述(7)重組PAP-GM-CSF-1L-6融合蛋白的純化方法，將收集的細胞全蛋白用鎳柱純化。Ni Sepharose? 6 Fast Flow上柱，用Wash buffer洗柱5次，用Elut1n buffer(50mM PBS PH 8.0，0.3Μ NaCl，150mM咪唑)洗脫目的蛋白。
[0018]在所述純化(8)PAP-GM-CSF-1L-6融合蛋白滲透濃縮步驟中，將洗脫下的、純化的融合蛋白溶液裝入已經(jīng)處理好的透析袋，放入透析緩沖液(50mM PBS PH 8.0,0.15M NaCl)中4°C過夜，以去除純化蛋白中含有的咪唑。次日，將透析后的蛋白過濃縮柱進行濃縮，4°C，4000g離心lOmin，測量濃縮后的融合蛋白的濃度。
[0019]本發(fā)明PAP-GM-CSF-1L-6重組蛋白，進行了western blot鑒定實驗，鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，方法如下:
分別取重組蛋白20μ1，加入等體積的2 X