一種重組蛋白Vo及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥領(lǐng)域，涉及一種重組腦膜炎大腸桿菌K1疫苗蛋白Vo，本 發(fā)明進(jìn)一步涉及該重組蛋白的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)菌性腦膜炎是新生兒的常見感染性疾病，是新生兒死亡及遠(yuǎn)期致殘的主要原 因。世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示，新生兒細(xì)菌性腦膜炎發(fā)生率位于新生兒感染性疾病的前5位， 其死亡率高達(dá)40%。由于早產(chǎn)兒的增多及其它原因，我國新生兒細(xì)菌性腦膜炎發(fā)病率逐漸 上升，其已成為新生兒住院三大病因之一。隨著抗生素耐藥性的泛濫，新生兒細(xì)菌性腦膜炎 的療效和預(yù)后更加不容樂觀。資料顯示約有1%_40%的新生兒細(xì)菌性腦膜炎患者死亡，僅 30 %的患者能夠治愈?；颊咧斡笸ǔ３霈F(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，如腦積水、癲癇、智能低下等， 為家庭和社會(huì)造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。
[0003] 大腸桿菌Kl(E.coli K1)是引發(fā)新生兒細(xì)菌性腦膜炎的主要病原體，約超過80% 病例的由該菌感染所致。外膜蛋白A(outer membrane A，0mpA)是E.coli K1的關(guān)鍵致病因 子，在E.coli K1引發(fā)的新生兒腦膜炎中發(fā)揮重要作用(Kim K.S.2008.Nat Rev Microbiol 6: 625-634.)。研究發(fā)現(xiàn)，E.coli K1引起新生兒腦膜炎必須通過以下4個(gè)病理過程：① E.coli Κ1感染宿主并定植新生兒腸道或泌尿道;②E.coli Κ1從感染定植部位入血并在血 液中繁殖，引起新生兒菌血癥;③E.coli K1突破新生兒血腦屏障，進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)；④ E.coli K1在顱內(nèi)釋放促炎因子和毒素，引起白細(xì)胞的浸潤和血腦屏障通透性增加，最終引 發(fā)新生兒腦膜炎等感染性疾病。在整個(gè)新生兒腦膜炎的發(fā)病過程中，E.coli K1能抵抗血液 免疫系統(tǒng)的殺傷并引發(fā)菌血癥、入侵血腦屏障導(dǎo)致顱內(nèi)感染是決定細(xì)菌感染的關(guān)鍵因素， 而外膜蛋白A(outer membrane protein A，0mpA)在此細(xì)菌致病的關(guān)鍵過程中都發(fā)揮決定 性的作用(Krishnan S.，and N.V.Prasadarao.2012.FEBS J·)，所以O(shè)mpA可以作為腦膜炎 大腸桿菌疫苗的重要候選疫苗分子。
[0004] OmpA為I型跨膜蛋白，其全長346個(gè)氨基酸，主要由2個(gè)domain組成，N端1-198氨基 酸為典型的beta-barrel的跨膜結(jié)構(gòu)，C端domain為肽聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域。重組表達(dá)的全長 OmpA蛋白因?yàn)楹锌缒そY(jié)構(gòu)難溶于水，不能作為疫苗分子。OmpA的N端結(jié)構(gòu)域是其主要功能 結(jié)構(gòu)域，其暴露在胞外的Ιοορ?，1〇〇ρ2，1οορ3，1οορ4是其介導(dǎo)OmpA相關(guān)病理生理過程的關(guān) 鍵結(jié)構(gòu)域。此外，通過Anti Jen，Bepipred和Epitome等表位軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)OmpA的loop 1， 1〇〇ρ2，1〇〇ρ3，1〇〇ρ4具有很多的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位。目前尚沒有基于OmpA蛋白制備抗 體的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對腦膜炎大腸桿菌的嚴(yán)重危害，本發(fā)明提供一種腦膜炎大腸桿菌K1的重組蛋白 Vo，該重組蛋白由腦膜炎大腸桿菌KlOmpA的有效成分構(gòu)成，其可應(yīng)用于制備腦膜炎大腸桿 菌的亞單位疫苗以及相關(guān)的檢測試劑盒。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案：
[0007] 一種重組蛋白Vo,所述重組蛋白Vo由腦膜炎大腸桿菌K1的外膜蛋白A(0mpA)的膜 外片段通過連接肽融合而成;所述重組蛋白Vo具有以下通式：
[0008] l〇〇pl-(linker a)ni-loop2-(linker b)n2-loop3-(linker b)n3-loop4-(linker a)n4-loopl-(linker a)n5-loop2-(linker b)n6-loop3-(linker b)n7-loop4；
[0009] 其中，所述連接肽 1 inker a選自 G1 y SerG 1 yG 1 y Ser，G1 yGly SerG 1 yG 1 y， TyrAlaProValAspVal 中的一個(gè)，優(yōu)選為 GlySerGlyGlySer;
[0010] 所述連接肽 linker b選自 GlySerGlyGlySerGly，GlyGlySerGlyGly， TyrAlaProValAspVal 中的一個(gè)，優(yōu)選為 GlySerGlyGlySerGly;
[0011] 111、112、113、114、115、116、117各自獨(dú)立地選自1、2、3或4，優(yōu)選為1 ;
[0012] 優(yōu)選地，所述loopl的氨基酸序列為SEQ ID N0:3;
[0013] 優(yōu)選地，所述1οορ2的氨基酸序列為SEQ ID NO:4。
[0014] 優(yōu)選地，所述1οορ3的氨基酸序列為SEQ ID N0:5;
[0015] 優(yōu)選地，所述1οορ4的氨基酸序列為SEQ ID N0:6。
[0016] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組蛋白Vo的氨基酸序列為SEQ ID N0:2; 優(yōu)選地，編碼所述重組蛋白Vo的核苷酸序列為SEQ ID NO: 1。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體由骨架質(zhì)?？尚揎椀剡B接編碼上述 重組蛋白Vo的核苷酸序列形成。
[0018]在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述骨架質(zhì)粒選自pGex系列載體、pET系列載體 或pQE系列載體;優(yōu)選為pGex-6P-2。
[0019 ] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了上述重組蛋白Vo的制備方法，所述方法包括：
[0020] 1)構(gòu)建如上所述的表達(dá)載體；
[0021] 2)將步驟1)得到的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主菌，得到含有表達(dá)載體的宿主菌；
[0022] 3)誘導(dǎo)步驟2)得到的含有表達(dá)載體的宿主菌表達(dá)重組蛋白Vo;
[0023] 4)提取并純化得到重組蛋白Vo。
[0024] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主菌選自大腸桿菌XLl_blue、BL21或 HMS174菌株中的一種，優(yōu)選為大腸桿菌XLl-blue菌株。
[0025] 優(yōu)選地，所述宿主菌為大腸桿菌XLl-blue菌株。
[0026] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了上述重組蛋白Vo在制備用于診斷、預(yù)防或治療腦膜炎大 腸桿菌K1的藥物中的應(yīng)用。
[0027] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物為用于診斷腦膜炎大腸桿菌K1的試劑 盒。
[0028] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物為用于預(yù)防或治療腦膜炎大腸桿菌K1 的亞單位疫苗。
[0029] 由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn)：
[0030] 1)用于表達(dá)重組蛋白Vo的表達(dá)質(zhì)?？稍谠吮磉_(dá)系統(tǒng)-大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)。
[0031] 2)選擇pGEX載體系列時(shí)，重組蛋白Vo以融合蛋白形式表達(dá);表達(dá)載體上接有一個(gè) 分子量為26kDa的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，所表達(dá)的融合蛋白中就含有一個(gè)GST標(biāo)簽，此 標(biāo)簽就成為蛋白純化的標(biāo)記，使得純化條件溫和、步驟簡單、不需要變性劑的加入，從而純 化后的蛋白能最大限度保持其空間構(gòu)象和免疫原性;純化出來的重組蛋白Vo的純度大于 95%〇
[0032] 3)Vo重組蛋白能夠誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生特異性的抗體和具有免疫保護(hù)效果。
[0033] 利用本發(fā)明的重組蛋白Vo制備的亞單位疫苗可通過皮下（肌肉）注射途徑進(jìn)行免 疫接種，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生高滴度IgG抗體。并經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，所述基因工程重組蛋白疫苗具 有良好的抗E.coli K1感染的免疫保護(hù)效果。為進(jìn)一步的聯(lián)合疫苗和多亞單位融合疫苗研 究打下基礎(chǔ)，同時(shí)為防治疫苗和診斷試劑盒的研制及應(yīng)用具有重要的作用。
【附圖說明】
[0034]圖1:重組蛋白Vo的結(jié)構(gòu)組成示意圖。A為OmpA分子的結(jié)構(gòu)示意圖。B為重組蛋白Vo 的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0035]圖2為重組質(zhì)粒pGex-6P-2-V〇的雙酶切鑒定結(jié)果。其中，泳道1為核酸(DNA)分子量 標(biāo)準(zhǔn)(Marker)，從上到下大小分別為：4500、3000、2000、1200、800、500、200bp;泳道2&3:重 組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-2-V 〇經(jīng)酶切后的鑒定結(jié)果，酶切后分離的片段約4000bp和約500bp。 [0036]圖3為蛋白Vo誘導(dǎo)鑒定結(jié)果；其中，泳道1:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)，從上到下大 小分別為：170Kd、130Kd、100Kd、70Kd、55Kd、40Kd、35Kd、25Kd、15Kd;泳道 2:結(jié)合誘導(dǎo)表達(dá)的 超聲上清的GST填料;泳道3:經(jīng)PP酶酶切后的上清;泳道4:經(jīng)PP酶酶切后的GST填料。
[0037]圖4為純化后的蛋白Vo SDS-P