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血液分析試劑及其使用方法

文檔序號(hào):6029029閱讀:963來源:國知局
專利名稱:血液分析試劑及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及血液分析試劑及其使用方法,更具體地講,本發(fā)明涉及用于對血液中
細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)的血液分析試劑及采用所述試劑進(jìn)行血液分析的方法。
背景技術(shù)
在正常人體內(nèi),嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)量較少,僅占白細(xì)胞總數(shù)的0_1%。但在重金屬中 毒、何杰金病、慢性粒細(xì)胞白血病等疾病中,嗜堿性粒細(xì)胞的數(shù)量會(huì)明顯升高,因此嗜堿性 粒細(xì)胞計(jì)數(shù)對于這些疾病的診斷具有重要意義。 過去,臨床上經(jīng)常使用一些化學(xué)染料來對嗜堿性粒細(xì)胞進(jìn)行染色計(jì)數(shù),包括瑞 氏_吉姆薩復(fù)合染色法、甲苯胺藍(lán)染色法和中性紅染色法等。這些方法僅能提供嗜堿性粒 細(xì)胞的百分比計(jì)數(shù),同時(shí)操作時(shí)間長、易受操作者主觀影響,并不適合臨床大規(guī)模標(biāo)本的檢 US4,882,284公開了一種對白細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)的方法。方法中使用了熒光染料 對白細(xì)胞進(jìn)行染色,然后通過測定熒光、側(cè)向散射光和前向角散射光信號(hào)可將白細(xì)胞分成 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞五個(gè)亞群。但由于嗜堿性 粒細(xì)胞的熒光和前向角散射光信號(hào)與中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞的熒光和前向散射光信號(hào)有部 分重疊,因此使用這個(gè)方法對嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)量正?;蚱偷臉?biāo)本進(jìn)行測定時(shí),計(jì)數(shù)和分 類結(jié)果并不準(zhǔn)確。 US5196346公開了一種用于嗜堿性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的試劑和方法。試劑中含有聚氧乙 烯醚類(polyoxyethylene ether)表面活性劑等組分。該方法僅使用單一參數(shù)(阻抗信 號(hào))對嗜堿性粒細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù),與多參數(shù)的分類方法相比,其準(zhǔn)確性較低。
US5538893、US5677183、US5518928分別公開了一種用于嗜堿性粒細(xì)胞分析用試劑 和方法。試劑中的主要成分包括非離子表面活性劑類的聚氧乙烯醇醚(polyoxyethylene glycol ether)等組分。此試劑可將除嗜堿性粒細(xì)胞以外的白細(xì)胞裸核化,唯獨(dú)保持嗜堿性 粒細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整。然后通過測定細(xì)胞的阻抗或低角散射光獲得細(xì)胞大小方面的信號(hào),再 通過測定細(xì)胞的側(cè)向或高角散射光獲得細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)方面的信號(hào),最后將兩種信號(hào)進(jìn)行組 合即可對嗜堿性粒細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。 US6214625B1公開了 一種對嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)的試劑 和方法。試劑由一種溶血?jiǎng)┖鸵环N穩(wěn)定劑組成。使溶血?jiǎng)┡c血液細(xì)胞混合一定時(shí)間,以 僅保持嗜堿性粒細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整,隨后添加穩(wěn)定劑。最終,通過測定細(xì)胞的阻抗、旋轉(zhuǎn) 散射光(rotatedlight scatter)信號(hào),或者射頻(radio frequency) 、 log光散射(log lightscatter)即可對嗜堿性粒細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。這一方法測定的參數(shù)較多,需要多個(gè)特 殊的測定裝置,儀器結(jié)構(gòu)復(fù)雜、價(jià)格昂貴。 應(yīng)用流式技術(shù)或阻抗方法對嗜堿細(xì)胞進(jìn)行分析的基本原理是根據(jù)大小進(jìn)行區(qū)分。 一般采用在酸性條件下處理血液樣本,由于嗜堿細(xì)胞的特性,在此處理?xiàng)l件下,嗜堿細(xì)胞仍 然保持完整細(xì)胞形態(tài),而嗜堿細(xì)胞以外的白細(xì)胞基本都被裸核化,這樣從大小信息就可以識(shí)別嗜堿細(xì)胞。但是一些異常血液樣本,如含有未成熟細(xì)胞、異常細(xì)胞等,在此處理?xiàng)l件下 不形成裸核,仍保持完整細(xì)胞結(jié)構(gòu),這樣根據(jù)大小信息進(jìn)行識(shí)別嗜堿細(xì)胞時(shí),形成嗜堿細(xì)胞 數(shù)目假性增高。 —般在嗜堿細(xì)胞識(shí)別的通道中進(jìn)行白細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù),但是由于有核紅細(xì)胞(NRBC) 的干擾,使得含有有核紅的樣本的白細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)出現(xiàn)偏差,需要扣除單獨(dú)有核紅的計(jì)數(shù) 部分,才能獲得準(zhǔn)確的白細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)。 有核紅細(xì)胞作為未成熟紅細(xì)胞,可分為早、中、晚幼紅細(xì)胞,通常存在骨髓等造血 組織器官,在正常成人外周血中極少出現(xiàn)。外周血中有核紅細(xì)胞的出現(xiàn)和許多疾病狀態(tài)以 及不良的預(yù)后有關(guān),如溶血性貧血、急慢性白血病、紅白血病、髓外造血及嚴(yán)重缺氧等,對一 些胎兒疾病的診斷及預(yù)后也具有重要的臨床價(jià)值。 傳統(tǒng)方法使用手工鏡檢方式檢測外周血中的有核紅細(xì)胞,這種方法容易受到檢測
者的主觀因素影響,并且計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目太少,造成誤差大,并且耗時(shí)費(fèi)力。在美國專利號(hào)5648225、5559037、5874310、6472215、5298426、6911313中分別公
開了有核紅細(xì)胞的檢測方法。 上述公開的試劑和方法中,都需要采用分別采用單獨(dú)的試劑和通道進(jìn)行嗜堿細(xì)胞 和有核紅細(xì)胞的識(shí)別,不能同時(shí)進(jìn)行有核紅細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞的識(shí)別,而且技術(shù)操作比較復(fù) 雜,不僅試劑和儀器成本較高,而且影響血液分析整體測試速度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一方面提供了一種血液分析試劑,所述試劑包括 (1).具有通式I結(jié)構(gòu)的化合物 其中 &、尺2各自獨(dú)立選自C卜18烷基0)01 6、 18烷基0R6和芐基,其中芐基由選自以下 的取代基任選取代卣素、羥基、巰基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、雜環(huán)基、卣代烷基、氨 基、烷基氨基、酰氨基和羧基,并且&和R2不同時(shí)為芐基; R6每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立為H、C卜18烷基或者苯基,其中苯基由選自以下的取代基任選取 代鹵素、羥基、巰基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、雜環(huán)基、卣代烷基、氨基、烷基氨基、酰 氨基和羧基; X為CH2、 C (CH3) 2、 0、 S或Se ;
9
Y為-CH2-CH R3、 R4和R5各自獨(dú)立選自H、鹵素、氰基、羥基、18烷基、C卜18烷基磺酸基、磺酸基
和C卜5烷基C00R7 ; R7為H或C卜6的烷基; Z—為陰離子; (2)選自陽離子表面活性劑、非離子表面活性劑的至少一種表面活性劑。 本發(fā)明另一方面提供了包含本發(fā)明的血液分析試劑的試劑盒,其中所述通式I的
化合物和所述表面活性劑分開獨(dú)立存放于單獨(dú)的容器或所述通式I的化合物和所述表面
活性劑被配制為單成分溶液。所述試劑盒可用于對血液細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù),優(yōu)選可有效鑒
別和計(jì)數(shù)待測血液樣品中有核紅細(xì)胞和/或嗜堿細(xì)胞,并進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。 本發(fā)明還一方面提供了一種對血液細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)的方法,所述方法包括以下
步驟(a)將血樣與本發(fā)明的血液檢測試劑混合形成細(xì)胞懸液;(b)檢測細(xì)胞的散射光和熒
光信號(hào);和(c)依據(jù)散射光和熒光信號(hào)對血液中的細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。 本發(fā)明還一方面提供了本發(fā)明的血液分析試劑在制備用于對血液細(xì)胞進(jìn)行分類 計(jì)數(shù)的試劑盒中的用途。 本發(fā)明采用一種試劑用一個(gè)測試通道即可實(shí)現(xiàn)嗜堿性粒細(xì)胞和有核紅細(xì)胞的識(shí) 別計(jì)數(shù);能夠?qū)κ葔A性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)準(zhǔn)確,排除有核紅細(xì)胞對白細(xì)胞計(jì)數(shù)的干擾,使白細(xì)胞計(jì) 數(shù)準(zhǔn)確。也可用于單獨(dú)識(shí)別計(jì)數(shù)嗜堿細(xì)胞或有核紅細(xì)胞。


圖1是本發(fā)明測定方法中使用的流式細(xì)胞儀的光學(xué)系統(tǒng)示意圖。 圖2是使用本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的血液分析試劑測定外周血的前向散射光和熒
光信號(hào)所生成的散點(diǎn)圖(實(shí)施例1) 圖3是使用本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的血液分析試劑測定外周血的前向散射光和熒 光信號(hào)所生成的散點(diǎn)圖(實(shí)施例2) 圖4是使用本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的血液分析試劑測定外周血的前向散射光和熒
10光信號(hào)所生成的散點(diǎn)圖(實(shí)施例3) 圖5是使用本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的血液分析試劑測定外周血的前向散射光和熒 光信號(hào)所生成的散點(diǎn)圖(實(shí)施例4) 圖6是使用本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的血液分析試劑測定外周血的前向散射光和熒 光信號(hào)所生成的散點(diǎn)圖(實(shí)施例5) 圖7本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的血液分析試劑測定外周血的前向散射光和熒光信號(hào) 所生成的散點(diǎn)圖(實(shí)施例6) 圖8本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的血液分析試劑測定外周血的前向散射光和熒光信號(hào) 所生成的散點(diǎn)圖(實(shí)施例7) 圖9是使用專利US5518928中公開的嗜堿細(xì)胞檢測試劑測定外周血的前向散射光 和熒光信號(hào)所生成的散點(diǎn)圖(實(shí)施例8) 圖10是使用本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的血液分析試劑測定外周血的前向散射光和熒 光信號(hào)所生成的散點(diǎn)圖(實(shí)施例8) 圖11是使用本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的血液分析試劑分析測試樣本所測嗜堿細(xì)胞百 分比結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)ICSH方法所得結(jié)果的相關(guān)性圖(實(shí)施例9) 圖12是使用本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的血液分析試劑分析測試樣本所測有核紅細(xì)胞 百分比結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)ICSH方法所得結(jié)果的相關(guān)性圖(實(shí)施例9)
具體實(shí)施方式

除另有說明外,本文中使用的術(shù)語具有以下含義。 本文中使用的術(shù)語"烷基",無論是單獨(dú)使用還是與其他基團(tuán)結(jié)合使用,指包含
l-18、優(yōu)選l-12、更優(yōu)選l-8、最優(yōu)選1-6個(gè)碳原子的直鏈烷基和支鏈烷基。如提及單個(gè)烷
基如"正丙基",則只特指直鏈烷基,如提及單個(gè)支鏈烷基如"異丙基",則只特指支鏈烷基。
例如,"C卜e烷基"包括C卜4烷基、(V3烷基、甲基、乙基、正丙基、異丙基和叔丁基。類似的規(guī)
則也適用于本說明書中使用的其它基團(tuán)。 本文中使用的術(shù)語"鹵素"包括氟、氯、溴和碘。 本文中使用的術(shù)語"生物樣品"包括但不限于肽、蛋白質(zhì)、核酸和血液中的有核紅 細(xì)胞。 本文中使用的術(shù)語"芳基"是指含有3至20個(gè)碳原子的芳族單環(huán)或2或3環(huán)稠環(huán) 基團(tuán),任選還含有1至3個(gè)選自N、 0和S的雜原子。 本文中使用的術(shù)語"雜環(huán)基"是指含有3至20個(gè)碳原子的非芳族單環(huán)或2或3環(huán) 稠環(huán)基團(tuán),任選還含有1至3個(gè)選自N、 0和S的雜原子。 本文中使用的術(shù)語"磺酸基"是指_S03H基團(tuán)或_S03—M基團(tuán),其中M為相反離子,包 括例如堿金屬離子(例如K+離子)或堿土金屬離子。 本文中使用的術(shù)語"烷基磺酸基"是指上述"磺酸基"通過上述"烷基"與分子的其 他部分連接的基團(tuán)。 本文中使用的術(shù)語"有核紅細(xì)胞"包括早幼紅細(xì)胞、中幼紅細(xì)胞以及晚幼紅細(xì)胞。
本發(fā)明的血液分析試劑
本發(fā)明所公開的試劑和方法可用于測試全血中的有核紅細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞。將本發(fā)
明試劑加入到全血中后,試劑中成分能夠快速溶解紅細(xì)胞,保留有核紅細(xì)胞的細(xì)胞核,并使
除嗜堿細(xì)胞外的白細(xì)胞膜部分溶解,應(yīng)用熒光散射法,對細(xì)胞進(jìn)行分類。 本發(fā)明一方面提供了一種血液分析試劑,所述試劑包括 (1).具有通式I結(jié)構(gòu)的化合物
I 其中 &、尺2各自獨(dú)立選自C卜18烷基0)01 6、 18烷基0R6和芐基,其中芐基由選自以下 的取代基任選取代卣素、羥基、巰基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、雜環(huán)基、卣代烷基、氨 基、烷基氨基、酰氨基和羧基,并且&和R2不同時(shí)為芐基; R6每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立為H、C卜18烷基或者苯基,其中苯基由選自以下的取代基任選取 代鹵素、羥基、巰基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、雜環(huán)基、卣代烷基、氨基、烷基氨基、酰 氨基和羧基; X為CH2、 C (CH3) 2、 0、 S或Se ;
12 (2)選自陽離子表面活性劑、非離子表面活性劑的至少一種表面活性劑。 具有通式I結(jié)構(gòu)的化合物 可用于本發(fā)明的作為熒光染料的化合物具有以下通式I結(jié)構(gòu)
R3、 R4和R5各自獨(dú)立選自H、鹵素、氰基、羥基、18烷基、C卜18烷基磺酸基、磺酸基
和C卜5烷基C00R7 ; R7為H或C卜6的烷基; Z—為陰離子。 優(yōu)選&、1 2各自獨(dú)立選自C卜6烷基C00Re、(V6烷基0R6和芐基,且&和R2不同時(shí)為芐基。 優(yōu)選R6每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立為H、 C卜6烷基或者苯基。 優(yōu)選R3、R4和R5各自獨(dú)立為H、鹵素、氰基、羥基、(V6烷基、(V6烷基磺酸基、磺酸基
或C卜5烷基C00R7。 優(yōu)選X為C(CH3)2、0或S。
<formula>formula see original document page 13</formula>
OPh phO 通式I的化合物在本發(fā)明所提供的血液分析試劑中的合適濃度范圍在O. Olppm到 lOOO卯m,優(yōu)選的濃度范圍為0. lppm到100卯m,而更優(yōu)選的濃度范圍為lppm到50卯m。
通式I的化合物可作為本文中所述的鹽形式直接用于生物樣品的染色。或者,在 一個(gè)實(shí)施方案中,通式I化合物可作為其衍生物的形式使用,所述衍生物包括但不限于綴 合物。 典型地,綴合物在熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)中使用。本文中使用的"綴合物"是 指通式I合物通過共價(jià)鍵與其它分子連接而形成的化合物??膳c通式I化合物綴合的分子 可為與細(xì)胞或細(xì)胞成分特異性結(jié)合的分子,包括但不限于抗體、抗原、受體、配體、酶、底物、 輔酶等。通常,測試樣品與綴合物溫育一段時(shí)間,使得該綴合物與測試樣品中的某些細(xì)胞或 細(xì)胞成分特異性結(jié)合,該綴合物與細(xì)胞或細(xì)胞成分的結(jié)合也可被稱為染色。該染色步驟可 依次進(jìn)行多次,或用多種綴合物同時(shí)進(jìn)行多種染色。染色完成后,樣品在熒光激活細(xì)胞分選 儀中進(jìn)行分析,其中激發(fā)光源激發(fā)綴合物中的通式I化合物,而測定裝置測定由激發(fā)的化 合物產(chǎn)生的發(fā)射光。 或者,在另一個(gè)實(shí)施方案中,該綴合物還可用于固相免疫測試,例如夾心型免疫測 試。固相免疫測試的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的,可由標(biāo)準(zhǔn)教科書獲得。所述綴合物可用作固相 免疫測試中的各種合適成分。 有關(guān)本發(fā)明所用的具有通式I結(jié)構(gòu)的化合物的具體描述可參見中請人同時(shí)待審 的中國發(fā)明專利申請,申請?zhí)枮?00810217140. 9,發(fā)明名稱為花菁類化合物及其在生物樣品染色中的用途。該專利申請通過引用結(jié)合到本文中。
表面藩齊H 本發(fā)明所用的表面活性劑可選用陽離子表面活性劑、非離子表面活性劑中的一 種,或者是兩者組合。 可用于本發(fā)明的陽離子表面活性劑為具有式II所示結(jié)構(gòu)的季銨鹽型陽離子表面
活性劑
<formula>formula see original document page 16</formula> 其中 R8為C原子數(shù)6-14的烷基或鏈烯基;
R9、 R1Q為C原子數(shù)1-4的烷基或鏈烯基;
Ru為C原子數(shù)1-4的烷基或鏈烯基或芐基;
B為鹵素原子。 優(yōu)選所述R8選自己基、辛基、癸基、十二烷基和十四烷基,特別優(yōu)選為癸基、十二烷 基或十四烷基直鏈烷基。 優(yōu)選所述R9、 R1Q選自甲基、乙基、丙基和丁烯基等,特別優(yōu)選為甲基、乙基或丙基。
優(yōu)選所述X為氯原子或溴原子。 可用于本發(fā)明的非離子表面活性劑選自辛基苯基聚氧乙烯醚,聚氧乙烯(10) 十六烷基醚、聚氧乙烯(23)十六烷基醚、聚氧乙烯(25)十六烷基醚和聚氧乙烯(30)十六 烷基醚等,優(yōu)選聚氧乙烯(25)十六烷基醚。 本發(fā)明的試劑系統(tǒng)的離子表面活性劑用量通常為50-5000mg/L,優(yōu)選 100-2000mg/L。具體用量根據(jù)使用表面活性劑的種類做出適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)。無論哪一種表面活 性劑其溶血能力只要達(dá)到紅細(xì)胞膜溶解,白細(xì)胞膜產(chǎn)生微孔,能夠進(jìn)入熒光染料即可。最好 遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于白細(xì)胞產(chǎn)生裸核用量。表面活性劑的溶血效果和側(cè)鏈長度有關(guān),側(cè)鏈越長溶血力 越強(qiáng),所需濃度越低。
其它組分 本發(fā)明試劑中還可加入芳香族有機(jī)酸或其鹽,使用芳香族有機(jī)酸可以使紅細(xì)胞溶 血速度加快,優(yōu)選水楊酸及其鹽、苯甲酸及其鹽,使用濃度為1-lOOmmol/L.
本發(fā)明的檢測試劑還可包括用于調(diào)節(jié)pH的緩沖劑。常見的緩沖劑有檸檬酸、甲 酸、乙酸、甘氨酸、苯二甲酸、酒石酸、蘋果酸、馬來酸等,其使用濃度通常為0.01-0. lmo1/ L,優(yōu)選為0. 01-0. 05mol/L。使用緩沖劑通常將試劑的pH值控制在在2_6之間,優(yōu)選為 2. 5-4. 5。 本發(fā)明的檢測試劑中還可以加入抗氧化劑,常用的有2,6-二叔丁基-4-甲基苯 酚、4-甲氧基苯酚、異維C鈉、維生素等,其使用濃度通常為0. l-5g/L。
本發(fā)明的檢測試劑還可包括用于調(diào)節(jié)滲透壓的滲透壓調(diào)節(jié)劑。試劑的滲透壓一般 控制在20-150m0sm/kg之間,因?yàn)闈B透壓在此范圍內(nèi),紅細(xì)胞容易被溶解,可防止對測量造 成干擾。常用的堿金屬鹽、葡萄糖、甘露醇等均可將試劑滲透壓控制在合理范圍內(nèi)。
另外,本發(fā)明的具有結(jié)構(gòu)I通式的化合物在水溶液不穩(wěn)定的情況下,可以溶解在 甲醇、乙醇、二甲亞砜、乙二醇等溶劑中保存。使用時(shí)可以與其他成分的水溶液混合使用。
輛日月麵編斤i式嫩 本發(fā)明另一方面提供了本發(fā)明的血液分析試劑在制備用于對血液細(xì)胞進(jìn)行分類 計(jì)數(shù)的試劑盒中的用途。優(yōu)選所述試劑盒可有效鑒別和計(jì)數(shù)待測血液樣品中有核紅細(xì)胞和 /或嗜堿細(xì)胞,并進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。 本發(fā)明還一方面提供了包含本發(fā)明的血液分析試劑的試劑盒,所述試劑盒可用于 對血液細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù),優(yōu)選可用于鑒別和計(jì)數(shù)待測血液樣品中有核紅細(xì)胞和/或嗜堿 細(xì)胞,并進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。 在一個(gè)試劑盒的實(shí)施方案中,所述通式I的化合物作為儲(chǔ)存液的形式,保存在單 獨(dú)的容器中。優(yōu)選采用甲醇、乙醇、二甲亞砜、乙二醇等作為溶劑。使用時(shí)可以與其他成分 的水溶液混合使用。 在另一個(gè)試劑盒的實(shí)施方案中,所述通式I的化合物與上述表面活性劑和/或其 他組分一起配制為單成份溶液。 所述試劑盒還可包含用于血液細(xì)胞,優(yōu)選有核紅細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞以及白細(xì)胞
分類計(jì)數(shù)所需的其他試劑,以及進(jìn)行所述分類計(jì)數(shù)的方法的說明書。所述試劑盒還可包含
可測定并與測試樣品對比的對照樣品或一系列對照樣品。試劑盒的各組分可分裝在單個(gè)容
器中,不同容器連同其說明一起全部在單獨(dú)的包裝中。 采用本發(fā)明的血液檢測試劑對血液細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)的方法 本發(fā)明還一方面提供了一種對血液細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)的方法,所述方法步驟包括
以下步驟(a)將血樣與本發(fā)明的血液檢測試劑混合形成細(xì)胞懸液;(b)檢測細(xì)胞的散射光
和熒光信號(hào);和(c)依據(jù)散射光和熒光信號(hào)對血液中的細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。 利用本發(fā)明的試劑對樣品進(jìn)行測試的具體過程包括將本發(fā)明的試劑和待測樣品
混合一段時(shí)間后,檢查細(xì)胞的熒光強(qiáng)度和細(xì)胞大小的信息,可以將有核紅細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞以
及其它類型白細(xì)胞進(jìn)行有效的區(qū)分。另外,由于不同發(fā)育時(shí)期有核紅細(xì)胞的細(xì)胞核體積大
小不同,本發(fā)明試劑可將有核紅細(xì)胞進(jìn)一步區(qū)分為不同發(fā)育時(shí)期的幼稚紅細(xì)胞。 利用本發(fā)明的試劑對樣品進(jìn)行處理時(shí),可同時(shí)在待測樣品中加入具有通式I結(jié)構(gòu)
的化合物和含有表面活性劑的溶血?jiǎng)部梢园凑涨昂箜樞蚺c樣品進(jìn)行混合。 在流式細(xì)胞儀或全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀上使用本發(fā)明的血液檢測試劑對血
液細(xì)胞進(jìn)行檢測時(shí),首先將血液樣本和本發(fā)明的血液檢測試劑按一定比例,通常為
i : io-i : ioo混勻制備成細(xì)胞懸液,并在反應(yīng)溫度42t:的條件下孵育4-30秒。然后將
細(xì)胞懸液注入到如圖1所示的光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行檢測。 在上述光學(xué)系統(tǒng)內(nèi),單個(gè)細(xì)胞依次進(jìn)入流動(dòng)室,并使用半導(dǎo)體激光器發(fā)出的波長 630nm左右激發(fā)光對其進(jìn)行照射。本發(fā)明血液檢測試劑所用的熒光染料可以在640nm附近 被激發(fā)且其波長在42t:可以保持穩(wěn)定,因此與使用的半導(dǎo)體激光器工作波長相匹配。
經(jīng)過激發(fā)的細(xì)胞發(fā)出的光散射信號(hào)被收集到光電二極管中,散射光的收集角度可以為低角(0° -5° ),也可以為高角(6。 -20° )。而細(xì)胞發(fā)出的熒光信號(hào)則被側(cè)向的光 電倍增管所收集。 光散射信號(hào)和熒光信號(hào)被輸入到數(shù)據(jù)處理單元進(jìn)行分析處理。最終,依據(jù)細(xì)胞的
光散射信號(hào)和熒光信號(hào)將血液中的各種進(jìn)行分類和計(jì)數(shù)。
實(shí)施例 以下所提供的實(shí)施例僅用于對本發(fā)明作出進(jìn)一步的舉例說明,而無意于對說明書 作出任何限定。 除非另有聲明,否則以下實(shí)施例中所用的血液細(xì)胞檢測設(shè)備為深圳邁瑞生物醫(yī)療 電子股份有限公司生產(chǎn)的BC系列流式細(xì)胞分析儀,檢測波長640nm。所述細(xì)胞分析儀的原 理圖如圖l所示。
實(shí)施例1 具有以下結(jié)構(gòu)的化合物(熒光染料)10mg
檸檬酸 1.21g
十二烷基三甲基氯化銨 500mg
水楊酸鈉 1.6g
4甲氧基苯酚 0. 2g H20 加至l升量
(用HC1將試劑pH值調(diào)至3. 5左右) 其中血液檢測試劑所用的作為熒光染料的通式I化合物具如下結(jié)構(gòu)
取一高值有核紅細(xì)胞樣本,經(jīng)國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(ICSH)推薦的瑞士-吉姆 撒染色法確認(rèn),其有核紅細(xì)胞比率為22NRBC/100個(gè)WBC,取此血液樣本20ii L與lmL試劑混 勻形成細(xì)胞懸液,42t:孵育4. 8秒。然后使細(xì)胞懸液通過流式細(xì)胞分析儀,并測定細(xì)胞的前 向(0° )散射光信號(hào)和熒光信號(hào),生成如圖2所示散點(diǎn)圖。散點(diǎn)圖上有核紅細(xì)胞與白細(xì)胞 之間存在明顯界限,計(jì)算結(jié)果為22. 24%。 本發(fā)明該實(shí)施例的試劑可將有核紅細(xì)胞進(jìn)一步劃分為中、晚幼紅細(xì)胞,經(jīng)國際血 液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(ICSH)推薦的瑞氏-吉姆撒染色法確認(rèn),樣本中中幼紅細(xì)胞比率為2% (2NRBC/100個(gè)WBC),晚幼紅細(xì)胞比率為20% (20NRBC/100個(gè)WBC)。使用本發(fā)明該實(shí)施例 的試劑和方法生成的散點(diǎn)圖計(jì)算結(jié)果為中幼紅細(xì)胞2. 15%,晚幼紅細(xì)胞20. 09% .
實(shí)施例2 取一嗜堿細(xì)胞含量較高樣本,經(jīng)國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(ICSH)推薦的瑞氏-吉姆撒染色法確認(rèn),其嗜堿細(xì)胞百分比為5% 。使用實(shí)施例1所述試劑和方法對該樣本進(jìn)行檢 測,生成如圖3所示的散點(diǎn)圖。散點(diǎn)圖上嗜堿性粒細(xì)胞與其他白細(xì)胞之間存在明顯界限,計(jì) 算結(jié)果為4.61%。 0135] 實(shí)施例3
0136] 具有以下結(jié)構(gòu)的化合物(熒光染料)10mg 0137] 檸檬酸 1.21g 0138] 聚氧乙烯(25)十六烷基醚 500mg 0139] 水楊酸鈉 1.6g 0140] 2,6-二叔丁基-4_甲基苯酚 0.2g 0141] H20 加至l升量 0142](用HC1將試劑pH值調(diào)至3. 5左右)
0143] 其中血液檢測試劑所用的作為熒光染料的通式I化合物具如下結(jié)構(gòu) 0144] 將血液標(biāo)本20ul和lml試劑混勻制成細(xì)胞懸液,42。C孵育4秒。然后使細(xì)胞懸液 通過流式細(xì)胞分析儀,并測定細(xì)胞的前向(0° )散射光信號(hào)和熒光信號(hào),生成如圖4所示散 點(diǎn)圖,測試結(jié)果為有核紅細(xì)胞5.6%,嗜堿細(xì)胞1.2%。同一標(biāo)本經(jīng)國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員 會(huì)(ICSH)推薦的瑞氏-吉姆撒染色法確認(rèn),其有核紅細(xì)胞比率為5% (5NRBC/100個(gè)WBC), 嗜堿細(xì)胞百分比為1%,











實(shí)施例4 (成分一)
1.21g
十二烷基三甲基氯化銨 400mg
苯甲酸鈉 2.0g
4甲氧基苯酚 0. 2g
H20 加至1升量
(用HC1將試劑pH值調(diào)至3. 5左右)
(成分二)
具有以下結(jié)構(gòu)的化合物(熒光染料)lOmg 甲醇 5ml 乙二醇 95ml
其中血液檢測試劑所用的作為熒光染料的通式I化合物具如下結(jié)構(gòu)
<formula>formula see original document page 20</formula> 取一高值有核紅樣本,將血液樣本20ul與1ml實(shí)施例4中(成分一 )混合,混勻 后加入(成分二),42t:孵育3秒。然后使細(xì)胞懸液通過流式細(xì)胞分析儀,并測定細(xì)胞的前 向(0° )散射光信號(hào)和熒光信號(hào),生成如圖5所示散點(diǎn)圖,測試結(jié)果為有核紅細(xì)胞4.5%, 嗜堿細(xì)胞O. 1%。經(jīng)國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(ICSH)推薦的瑞士-吉姆撒染色法確認(rèn),其 有核紅細(xì)胞比率為NRBC 4% (4/100個(gè)WBC),嗜堿細(xì)胞百分比為0。
實(shí)施例5 具有以下結(jié)構(gòu)的化合物(熒光染料)10mg
:0163] 檸檬酸 1.21g
:0164] 十四烷基三甲基氯化銨 lOOmg
:0165] 水楊酸鈉 1.6g
:0166] 4甲氧基苯酚 0.2g
:0167] H20 加至l升量(用HC1將試劑pH值調(diào)至3. 5左右) 其中血液檢測試劑所用的作為熒光染料的通式I化合物具如下結(jié)構(gòu)
EtOOC COOEt 取一有核紅細(xì)胞樣本,經(jīng)國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(ICSH)推薦的瑞士-吉姆撒染 色法確認(rèn),其有核紅細(xì)胞比率為4NRBC/100個(gè)WBC,嗜堿粒細(xì)胞比率為1 % ,取此血液樣本 20 L與lmL試劑分別混勻形成細(xì)胞懸液,42t:孵育4. 8秒。然后使細(xì)胞懸液通過流式細(xì)胞 分析儀,并測定細(xì)胞的前向(0° )散射光信號(hào)和熒光信號(hào),生成如圖6所示散點(diǎn)圖,測試結(jié) 果為有核紅細(xì)胞4. 5%,嗜堿細(xì)胞百分比為0. 7% .
實(shí)施例6 具有以下結(jié)構(gòu)的化合物(熒光染料)10mg
檸檬酸 2. lg



十二烷基三甲基氯化銨
水楊酸鈉
焦亞硫酸鈉
H90
加至l升
300mg 2. 0g 0. 2g 其中血液檢測試劑所用的作為熒光染料的通式I化合物具如下結(jié)構(gòu)
<formula>formula see original document page 21</formula> 取一有核紅細(xì)胞樣本,經(jīng)國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(ICSH)推薦的瑞士-吉姆撒染 色法確認(rèn),其有核紅細(xì)胞比率為4NRBC/100個(gè)WBC,嗜堿粒細(xì)胞比率為1 % ,取此血液樣本 20 L與lmL試劑分別混勻形成細(xì)胞懸液,42t:孵育4. 8秒。然后使細(xì)胞懸液通過流式細(xì)胞 分析儀,并測定細(xì)胞的前向(0° )散射光信號(hào)和熒光信號(hào),生成如圖7所示散點(diǎn)圖。測試結(jié) 果為有核紅細(xì)胞3. 8%,嗜堿細(xì)胞百分比為0. 8%。
0182]實(shí)施例7
0183]具有以下結(jié)構(gòu)的化合物(熒光染料)10mg
0184]檸檬酸2. 52g
0185]擰檬酸鈉0. 88g
0186]十二烷基三甲基氯化銨300mg
0187]水楊酸鈉l』g
0188]4甲氧基苯酚0. 2g
0189]H20加至1升量
0190](用HC1將試劑pH值調(diào)至3. 5左右)
0191]其中血液檢測試劑所用的作為熒光染料的通式I化合物具如下結(jié)構(gòu)0192] 取一高值有核紅細(xì)胞樣本,經(jīng)國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(ICSH)推薦的瑞士-吉姆 撒染色法確認(rèn),其有核紅細(xì)胞比率為39NRBC/100個(gè)WBC,取此血液樣本20 y L與lmL試劑分別混勻形成細(xì)胞懸液,42t:孵育4. 8秒。然后使細(xì)胞懸液通過流式細(xì)胞分析儀,并測定細(xì) 胞的前向(0° )散射光信號(hào)和熒光信號(hào),生成如圖8所示散點(diǎn)圖。測試結(jié)果為有核紅細(xì)胞 38. 6%。 實(shí)施例8 取臨床血樣一份,使用美國專利US5518928中公開的嗜堿細(xì)胞檢測試劑處理后, 使細(xì)胞懸液通過流式細(xì)胞分析儀,然后通過測定細(xì)胞的阻抗或低角散射光獲得細(xì)胞大小方 面的信號(hào),再通過測定細(xì)胞的側(cè)向或高角散射光獲得細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)方面的信號(hào),最后將兩 種信號(hào)進(jìn)行組合對嗜堿粒細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),如圖9,檢測結(jié)果為2. 5%,經(jīng)國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化 委員會(huì)(ICSH)推薦的瑞士-吉姆撒染色法確認(rèn),其嗜堿細(xì)胞百分比為O. 5%,光學(xué)散射法測 量結(jié)果明顯高于鏡檢結(jié)果。鏡下觀察樣本中的部分未成熟粒細(xì)胞體積大,胞漿內(nèi)顆粒物質(zhì) 增多,染色呈深藍(lán)色,未成熟粒細(xì)胞百分比為3%,結(jié)果表明一些疾病導(dǎo)致血液樣本中未成 熟粒細(xì)胞時(shí),可能造成散射法檢測的嗜堿性粒細(xì)胞結(jié)果假性偏高。使用本發(fā)明實(shí)施例1的 試劑和方法測試結(jié)果為0.6%,如圖10。使用專利中方法進(jìn)行檢測時(shí),由于這些細(xì)胞中的核 酸含量高于嗜堿性粒細(xì)胞,可以利用不同細(xì)胞中結(jié)合熒光強(qiáng)度不同將其與嗜堿性粒細(xì)胞進(jìn) 行區(qū)分。 實(shí)施例9 取臨床血液30份,使用實(shí)施例1中所述的方法和推薦的瑞士 _吉姆撒染色法進(jìn)行
嗜堿細(xì)胞分類檢測,其相關(guān)性如圖11。取有核紅樣本30例,使用實(shí)施例1中所述的方法和
推薦的瑞士 _吉姆撒染色法分別進(jìn)行有核紅細(xì)胞檢測,其相關(guān)性如圖12. 已通過上述各實(shí)施方案和具體實(shí)施例對本發(fā)明作出說明,但本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理
解,在不偏離本發(fā)明宗旨和范圍的情況下,可對本發(fā)明作出各種修改、變更和替換。
權(quán)利要求
一種血液分析試劑,所述試劑包括(1).具有通式I結(jié)構(gòu)的化合物其中R1、R2各自獨(dú)立選自C1-18烷基COOR6、C1-18烷基OR6和芐基,其中芐基由選自以下的取代基任選取代鹵素、羥基、巰基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、雜環(huán)基、鹵代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基和羧基,并且R1和R2不同時(shí)為芐基;R6每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立為H、C1-18烷基或者苯基,其中苯基由選自以下的取代基任選取代鹵素、羥基、巰基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、雜環(huán)基、鹵代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基和羧基;X為CH2、C(CH3)2、O、S或Se;Y為-CH2-CH=CH-、或各自獨(dú)立為R3、R4和R5各自獨(dú)立選自H、鹵素、氰基、羥基、C1-18烷基、C1-18烷基磺酸基、磺酸基和C1-5烷基COOR7;R7為H或C1-6的烷基;Z-為陰離子(2)選自陽離子表面活性劑、非離子表面活性劑的至少一種表面活性劑。F2008102182672C0000011.tif,F2008102182672C0000012.tif,F2008102182672C0000013.tif,F2008102182672C0000021.tif,F2008102182672C0000022.tif,F2008102182672C0000023.tif
2. 權(quán)利要求1的血液分析試劑,其中R2各自獨(dú)立選自(V6烷基C00R6、 (V6烷基0R6 和節(jié)基,且&和R2不同時(shí)為節(jié)基。
3. 權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的血液分析試劑,其中Re每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立為H、C卜e烷基或者 苯基。
4. 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的血液分析試劑,其中R3、R4和R5各自獨(dú)立為H、鹵素、氰基、 羥基、C卜6烷基、(V6烷基磺酸基、磺酸基或C卜5烷基C00R7。
5. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的血液分析試劑,其中X為C(CH3)2、 0或S。
6.
7. 權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的血液分析試劑,其中Z—為選自鹵素離子、C104—、 PF( CF3S03—、BF4—、乙酸根或?qū)妆交撬岣?fù)離子的陰離子。
8. 權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的血液分析試劑,所述化合物為<formula>formula see original document page 4</formula><formula>formula see original document page 5</formula>OPh PhO 。
9. 權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的血液分析試劑,其中所述陽離子表面活性劑為具有式II所示結(jié)構(gòu)的季銨鹽型陽離子表面活性劑{R8-N+-R"} B-II射R8為C原子數(shù)6-14的烷基或鏈烯基; R9、 R1Q為C原子數(shù)1-4的烷基或鏈烯基; Rn為C原子數(shù)1-4的烷基或鏈烯基或芐基; B為鹵素原子。
10. 權(quán)利要求9的血液分析試劑,其中所述R8選自己基、辛基、癸基、十二烷基和十四烷 基,優(yōu)選為癸基、十二烷基或十四烷基直鏈烷基。
11. 權(quán)利要求9-10中任一項(xiàng)的血液分析試齊U,其中所述R9、Rw選自甲基、乙基、丙基和 丁烯基等,優(yōu)選為甲基、乙基或丙基。
12. 權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)的血液分析試劑,其中所述X為氯原子或溴原子。
13. 權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的血液分析試劑,其中所述非離子表面活性劑選自辛基苯 基聚氧乙烯醚,聚氧乙烯(10)十六烷基醚、聚氧乙烯(23)十六烷基醚、聚氧乙烯(25)十六 烷基醚和聚氧乙烯(30)十六烷基醚等,優(yōu)選聚氧乙烯(25)十六烷基醚。
14. 權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的血液分析試劑,所述試劑還含有芳香族有機(jī)酸或其鹽, 優(yōu)選水楊酸及其鹽、苯甲酸及其鹽。
15. 權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的血液分析試劑,所述試劑還含有選自檸檬酸、甲酸、乙 酸、甘氨酸、苯二甲酸、酒石酸、蘋果酸和馬來酸的pH值緩沖劑。
16. 權(quán)利要求15的血液分析試劑,其中所述緩沖劑的pH值為2-6,優(yōu)選為2. 5-4. 5。
17. 權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的血液分析試劑,所述試劑還含有選自2,6- 二叔丁 基-4-甲基苯酚、4-甲氧基苯酚、異維C鈉和維生素的抗氧化劑。
18. 權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的血液分析試劑,所述試劑還含有選自堿金屬鹽、葡萄糖 和甘露醇的滲透壓調(diào)節(jié)劑。
19. 權(quán)利要求18的血液分析試劑,所述試劑的滲透壓一般控制在20-150m0sm/kg之間。
20. —種對血液細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)的方法,所述方法包括以下步驟(a)將血樣與權(quán)利 要求1-19中任一項(xiàng)的血液分析試劑混合形成細(xì)胞懸液;(b)檢測細(xì)胞懸液的散射光和熒光 信號(hào);和(c)依據(jù)散射光和熒光信號(hào)對血液中的細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。
21. 權(quán)利要求20的方法,其中所述血液細(xì)胞包括有核紅細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和/或白細(xì)胞。
22. —種用于血液分析的試劑盒,所述試劑盒包括權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的血液分析 試劑,其中所述通式I的化合物和所述表面活性劑分開獨(dú)立存放于單獨(dú)的容器或所述通式 I的化合物和所述表面活性劑被配制為單成分溶液。
全文摘要
本發(fā)明一方面提供了一種血液分析試劑,所述試劑包括(1)具有通式I結(jié)構(gòu)的化合物;(2)選自陽離子表面活性劑、非離子表面活性劑的至少一種表面活性劑。本發(fā)明另一方面提供了一種對血液細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)的方法,所述方法包括以下步驟(a)將血樣與本發(fā)明的血液檢測試劑混合形成細(xì)胞懸液;(b)檢測細(xì)胞的散射光和熒光信號(hào);和(c)依據(jù)散射光和熒光信號(hào)對血液中的細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。本發(fā)明所提供的血液分析試劑可有效鑒別和計(jì)數(shù)待測血液樣品中有核紅細(xì)胞和/或嗜堿細(xì)胞,并進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。
文檔編號(hào)G01N15/10GK101750476SQ20081021826
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月8日
發(fā)明者包德泉, 匡玉吉, 張寶華, 徐兵, 邵建輝, 雷霆 申請人:深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司
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