專利名稱：黃曲霉毒素M₁的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及ー種黃曲霉毒素M1的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及使用方法。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素(Aflatoxins)是真菌產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物，廣泛存在于各種糧食、食品和飼料中，對人類和動物表現(xiàn)出很強的毒性。黃曲霉毒素1993年被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機構(gòu)劃定為I類致癌物。黃曲霉毒素^(Aflatoxin M1，縮寫AFM1)屬于黃曲霉毒素一類結(jié)構(gòu)相似的化合物中的ー種，該類毒素是由常見的黃曲霉菌(Asperillus Flavus)和寄生曲霉菌(Asperillus Parasiticus)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，在濕熱地區(qū)食品和飼料中出現(xiàn)黃曲霉毒素的機率最高。AFM1物理化學(xué)性質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定，不被巴氏消毒破壞。黃曲霉毒素M1的危害主要表現(xiàn)在致癌性和致突變性，對人及動物肝臟組織有破壞作用，可導(dǎo)致肝癌甚至死亡。動物的AFM1中毒主要表現(xiàn)為食欲不振、體重下降、生長遲緩、繁殖能力降低、產(chǎn)蛋及產(chǎn)奶量減少等。中毒病變主要在肝臟，表現(xiàn)為肝細(xì)胞變性、壞死、出血、膽管增生等。急性中毒后期，動物出現(xiàn)體溫升高、血性腹瀉、心臟出現(xiàn)出血瘀點和瘀斑、膽囊壁增厚、門靜脈周圍纖維化、肝淋巴結(jié)節(jié)形成及空泡形成、膽管增生等。黃曲霉毒素M1是動物攝入黃曲霉毒素B1后在體內(nèi)經(jīng)羥基化代謝的產(chǎn)物，一部分從尿和乳汁排出，一部分存在于動物的可食部分，如乳、肝、蛋類、腎、血和肌肉中，其中以乳最為常見。黃曲霉毒素M1的毒性和致癌性與黃曲霉毒素B1的基本相似。由于牛乳及其制品是人類、特別是嬰兒的主要食品，所以被黃曲霉毒素M1污染的牛乳及其制品危害性更大。很多國家已經(jīng)對牛奶和乳制品中的黃曲霉毒素M1含量有了明確的限量標(biāo)準(zhǔn)。美國、中國以及日本對乳及乳制品中AFM1的限量標(biāo)準(zhǔn)為0.g/kg,而歐盟國家及瑞士對鮮乳中的AFM1限量標(biāo)準(zhǔn)則更低，分別為0.05 u g/kg、0.01 u g/kg。AFM1毒性主要表現(xiàn)在致癌性和致突變性，生理學(xué)致癌機制的研究表明=AFM1的遠(yuǎn)端呋喃環(huán)環(huán)氧結(jié)構(gòu)可與體內(nèi)DNA嘌呤殘基共價結(jié)合，從而產(chǎn)生DNA的某些損傷，引起DNA結(jié)構(gòu)和功能的改變，產(chǎn)生癌變。AFM1致癌性與AFB1的致癌性基本相似，但毒性低于AFB1，然而與氰化鉀和砒霜相比，仍屬劇毒物質(zhì)，為強致癌劑。流行病學(xué)研究結(jié)果表明:肝癌高發(fā)區(qū)的肝癌發(fā)病率與AFB1的攝入以及轉(zhuǎn)化為尿中的AFM1的轉(zhuǎn)化率有密切關(guān)系。隨著人們對黃曲霉毒素認(rèn)識的不斷深入以及監(jiān)控カ度的加大，人體直接攝入AFB1的機會越來越少，而動物乳中AFM1的存在對人類的危害變得至關(guān)重要。由于黃曲霉毒素M1相當(dāng)穩(wěn)定，巴氏滅菌法也無法將其殺滅，所以檢測黃曲霉毒素M1不僅要在飼料原料中檢測，而且在最終產(chǎn)品中也需要進(jìn)行鑒定。由于黃曲霉毒素M1在牛奶等食品中的殘留、在飼料中的污染都很微量，檢測很困難，因此需建立ー種高度靈敏、低檢測限的檢測方法。目前黃曲霉毒素M1比較常用的檢測方法有高效液相色譜法(HPLC)，氣 相色譜法(GC)，薄層層析法(TLC)，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)以及免疫分析檢測法等。TLC的特異性較差，靈敏度也相對較低，因此需要的AFM1標(biāo)準(zhǔn)品濃度較高，存在潛在的高操作污染性；儀器法所需儀器設(shè)備投資大，操作技術(shù)要求高，浄化柱消耗較多，檢測成本較高。它們都各有優(yōu)缺點，但這些方法因有的具有特異性差、靈敏度低、樣品預(yù)處理繁瑣、需價格昂貴的精密儀器、費時、一次不能檢測大量的樣品等缺點，不易推廣，ELISA方法雖具有簡單、快速、靈敏的特點，也適宜大規(guī)模的篩查工作，但其靈敏度有一定的制約。因此，建立一種經(jīng)濟、可靠、特異、敏感、快速有效的檢測方法有很大的實際意義和應(yīng)用前景?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)是化學(xué)發(fā)光和免疫分析結(jié)合的產(chǎn)物，將發(fā)光物質(zhì)直接標(biāo)記到抗原或抗體上，與抗體或抗原發(fā)生特異性免疫反應(yīng)后，通過測定標(biāo)記物的化學(xué)發(fā)光強度確定被測抗體或抗原的含量。具有高通量檢測、靈敏度高、檢測范圍寬、分析速度快、價廉經(jīng)濟等優(yōu)點，是免疫分析的重要發(fā)展方向，并被逐漸引入食品安全領(lǐng)域有毒有害物質(zhì)的檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供ー種黃曲霉毒素M1的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。本發(fā)明的另ー目的在于提供上述黃曲霉毒素M1的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的使用方法。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):ー種黃曲霉毒素M1的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括包被有黃曲霉毒素M1抗原的化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板，黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品，黃曲霉毒素M1抗體，酶標(biāo)抗抗體，化學(xué)發(fā)光液和洗滌液。所述的化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板優(yōu)選為96孔可拆不透明白色發(fā)光板；所述的黃曲霉毒素M1抗原為黃曲霉毒素M1與牛血清白蛋白(BSA)的偶聯(lián)物；包被黃曲霉毒素M1抗原的包被液優(yōu)選為將1.69g碳酸鈉和2.95g碳酸氫鈉溶于IL雙蒸水中得到，黃曲霉毒素M1抗原的包被濃度為0.625mg/L;封閉液 優(yōu)選為取0.1g BSA (牛血清白蛋白)、5g甘氨酸溶于IOOmL PBS(0.01mol/L pH7.4)溶液得到。所述的黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品濃度為lmg/mL，使用時用0.01mol/L PBST (配方為NaH2PO4 12H202.9g、NaC18.5g、KC10.2g、KH2PO40.2g, Tween-200.5mL，定容至 1L)將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成濃度為0.0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3 ii g/L的一系列黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品溶液。所述的黃曲霉毒素M1抗體為黃曲霉毒素M1單克隆抗體或兔多克隆抗體。所述的黃曲霉毒素M1單克隆抗體為商業(yè)化的黃曲霉毒素M1單克隆抗體(如北京為康惠華生物技術(shù)有限公司的黃曲霉毒素M1單克隆抗體)。所述的黃曲霉毒素M1兔多克隆抗體為商業(yè)化的黃曲霉毒素M1多克隆抗體(如北京為康惠華生物技術(shù)有限公司的黃曲霉毒素M1多克隆抗體)。優(yōu)選的，所述的黃曲霉毒素M1抗體為黃曲霉毒素M1單克隆抗體，其原濃度為2mg/mL，使用時優(yōu)選為0.01mol/L PBST稀釋6000倍。所述的酶標(biāo)抗抗體優(yōu)選為辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG。更優(yōu)選的，所述的酶標(biāo)抗抗體為辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，其原濃度為10mg/mL，使用時優(yōu)選為 0.01mol/L PBST 稀釋 6000 倍。所述化學(xué)發(fā)光液由A液和B液組成，A液優(yōu)選為將20mg對碘苯酚、Smg魯米諾、1.21g Tris溶于IOOmL去離子水，用鹽酸調(diào)pH至8.4得到；B液優(yōu)選為將體積分?jǐn)?shù)0.40%H202、1.21g Tris溶于IOOmL去離子水，用鹽酸調(diào)pH至7.0得到；使用時將A液和B液按體積比1:1的比例混合。所述的洗滌液優(yōu)選為20倍濃縮洗滌液，20倍濃縮洗滌液是含有體積分?jǐn)?shù)
0.5%Tween20的pH7.40.4mol/L的磷酸鹽緩沖液，使用時用去離子水稀釋成I倍洗滌液。所述的黃曲霉毒素M1的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒最大檢測范圍為18 130pg/mL,靈敏度 48pg/mL,檢出限 40pg/mL。上述黃曲霉毒素M1的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的使用方法，包括如下步驟:(I)將試劑盒置于15 35°C平衡30min以上。(2)取出化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板，往標(biāo)準(zhǔn)孔中加入不同濃度的黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，樣品孔中加入待測樣品，然后每孔加入黃曲霉毒素M1抗體，蓋上蓋板膜振搖混勻，孵育。(3)吸除板孔中的反應(yīng)液，加入洗滌液洗滌，將酶標(biāo)板拍干。(4)往各孔中加入酶標(biāo)抗抗體，輕拍混勻，孵育。(5)每孔加入化學(xué)發(fā)光反應(yīng)液，輕拍混勻，蓋上蓋板膜，I 2min后用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定各孔的發(fā)光值RLU。(6)檢測結(jié)果計算與 分 析:抑制率(％) =B/B0X 100 (%)，式中:B—不同濃度黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)溶液孔(或樣品孔)的發(fā)光值^tl-O濃度黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)光值；以抑制率為縱坐標(biāo)，黃曲霉毒素M1濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而確定樣品中黃曲霉毒素M1的含量。步驟(2)中所述的待測樣品為液態(tài)乳或乳粉，其處理方法如下:液態(tài)乳:將待測液態(tài)乳搖勻,稱取5.0g試樣到IOmL離心管中，2 8°C以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心lOmin，用脫脂棉簽除去上層脂肪。加入150i!L0.36mOl/L亞鐵氰化鉀溶液，短暫渦旋混合后加入150iiL1.04mol/L硫酸鋅溶液，渦旋振蕩3min后，于10 15°C以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心IOmin,上清液即可用于檢測；乳粉:稱取10.0g待測乳粉于小燒杯中，加50°C熱水溶解，轉(zhuǎn)移到IOOmL容量瓶
中，定容至刻度，以下處理同液態(tài)乳。優(yōu)選的，所述的黃曲霉毒素M1的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的使用方法，其特征在于包含如下步驟:(I)將試劑盒置于室溫平衡30min以上，用0.0lmol/L PBST將黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成濃度分別為0.0,0.01,0.03,0.1,0.3、l、3i! g/L的黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品溶液。(2)取出化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板，在標(biāo)準(zhǔn)孔加入50 y L不同濃度的黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，樣品孔加入50 y L待測樣品，然后每孔加入50 y L稀釋好的黃曲霉毒素M1單克隆抗體，蓋上蓋板膜在微量振蕩器上振搖IOmin后,置于37°C孵育50min。(3)吸除板孔中的反應(yīng)液，各孔加入洗滌液約300 u L，靜置20秒左右，除去其中液體，如此共洗5次，最后ー次將板拍干；也可用自動洗板機洗板5次，洗完后將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去孔中的液體。(4)往各孔中加入100 u L稀釋好的辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG酶標(biāo)抗抗體，輕拍混勻后，置于37°C孵育30min。(5)每孔加入100 L A液與B液等體積混合后的化學(xué)發(fā)光液，輕拍混勻，蓋上蓋板膜，I 2min后用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定各孔的發(fā)光值RLU，保存數(shù)據(jù)。
(6)檢測結(jié)果計算與分析:抑制率(％) =B/B0X 100 (%)，式中:B—不同濃度黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)溶液孔(或樣品孔)的發(fā)光值^tl-O濃度黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)光值；以抑制率為縱坐標(biāo)，黃曲霉毒素M1濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而確定樣品中黃曲霉毒素M1的含量。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果:(I)環(huán)保經(jīng)濟:與現(xiàn)有的檢測黃曲霉毒素M1的ELISA試劑盒相比，不需要再使用具有腐蝕性的硫酸、以及大部分有毒或為致癌物質(zhì)的底物，更加環(huán)保經(jīng)濟。(2)高靈敏度、高特異性:與現(xiàn)有的檢測黃曲霉毒素M1的ELISA試劑盒相比，克服了試劑盒檢測過程中易受到內(nèi)源性酶干擾、吸光度的檢測也易受到多種外在因素的影響的弊端，本發(fā)明采用高特異性、高親合力的抗體，檢測黃曲霉毒素M1的化學(xué)發(fā)光酶免疫試劑盒靈敏度更高，可達(dá)到0.048ng/mL。(3)高精密度、高穩(wěn)定性:采用包被抗原進(jìn)行酶標(biāo)板的包被，相對于抗體包被，更有利于達(dá)到較好的包被效果與較長的保存時間，從而提高了試劑盒檢測的精密度與穩(wěn)定性。(4)快速、準(zhǔn)確:前處理方法簡單快速、符合試劑盒的快速、準(zhǔn)確的檢測要求?；谝陨蟽?yōu)點本試劑盒非常適用于黃曲霉毒素M1殘留的痕量分析與批量檢測，具有重要的現(xiàn)實意義。


圖1是黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例中所使用試劑如下:包被液:將1.69g碳酸鈉和2.95g碳酸氫鈉溶于IL雙蒸水中得到。20倍濃縮洗滌液:體積分?jǐn)?shù)0.5%Tween20的pH7.40.4mol/L的磷酸鹽緩沖液，使用時用去離子水稀釋成I倍。封閉液:取0.1g BSA (牛血清白蛋白)、5g甘氨酸溶于IOOmL PBS溶液(0.0lmol/L pH7.4)得到。黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)溶液:用色譜級こ腈將黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成lmg/mL備用；再用0.0lmol/L PBST稀釋為濃度分別為0.0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3 y g/L的黃曲霉
毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品溶液,4°C保存?；瘜W(xué)發(fā)光液:化學(xué)發(fā)光液由A液和B液組成，A液為將20mg對碘苯酚、8mg魯米諾、
1.21gTris溶于IOOmL去離子水，用鹽酸調(diào)pH至8.4得到；B液為將體積分?jǐn)?shù)0.40%H202、
1.21gTris溶于IOOmL去離子水，用鹽酸調(diào)pH至7.0得到；使用時將A液和B液按體積比1:1的比例混合。黃曲霉毒素M1單克隆抗體(2mg/mL):購自北京為康惠華生物技術(shù)有限公司。辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG (10mg/mL):購自武漢博士德生物工程有限公司。實施例1黃曲霉毒素M1單克隆抗體、包被抗原的制備
(I)包被抗原的制備0.3mg AFM1溶于400 y L無水吡啶中，加入Img羥甲氧基羥氨半鹽酸(CMO)，37°C避光振搖反應(yīng)，每4h取出微量進(jìn)行薄層層析定性分析，直至AFM1完全轉(zhuǎn)化為AFM1肟；取6mgAFM1肟溶于20mL25% (V/V)甲醇水溶液中，加入367mg EDAC (こ基ニ甲基胺丙基碳化ニ亞胺)，再加入lmLlOmg/mL BSA，室溫下避光振蕩48h。反應(yīng)過程中，兩次分別再加入367mgEDACo反應(yīng)結(jié)束后，將混合物用去離子水透析5天，姆天換水,取透析完的溶液,過0.45 ii m濾膜得到黃曲霉毒素M1與牛血清白蛋白的偶聯(lián)物(包被抗原)，于_20°C凍存。(2)黃曲霉毒素M1單克隆抗體的制備購自北京為康惠華生物技術(shù)有限公司。實施例2化學(xué)發(fā)光酶免疫方法的建立( I)包被抗原與抗體濃度的優(yōu)選I)將包被抗原按 2.5mg/L、l.25mg/L、0.833mg/L、0.625mg/L、0.5mg/L 用包被液(0.05mol/L pH5.0碳酸鹽緩沖液)稀釋并縱向包被不透明白色發(fā)光板，100 U I/孔，370C 24h，用洗液洗滌2次，在吸水紙上拍干。2)加入配制好的封閉液150 y L/孔進(jìn)行封閉，37°C過夜，甩干后放入烘箱烘干。3)加入50 u L/孔用0.0lmol/L PBST稀釋的黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液4)加入50 ii L/孔用0.0lmol/L PBST系列稀釋的黃曲霉毒素M1單克隆抗體(1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000)，37°C 60min,洗板 5 次，在吸水紙上拍干。5)加入IOOii L/孔已稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37°C 30min，用洗液洗板5次，在吸水紙上拍干。6)加入現(xiàn)配的化學(xué)發(fā)光液，100 U L/孔，用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定發(fā)光值。以發(fā)光值隨包被抗原濃度有明顯梯度變化的包被抗原濃度和抗體稀釋度為最佳濃度進(jìn)行特異性測定。得到包被抗原最佳濃度為0.625mg/L,抗體(濃度2mg/mL)稀釋倍數(shù)為1:6000。(2)抗體靈敏度的測定以包被抗原濃度為0.625mg/L,黃曲霉毒素M1單克隆抗體(濃度2mg/mL)稀釋倍數(shù)為1: 6000，進(jìn)行抗體靈敏度的測定。I)取96孔不透明白色發(fā)光板，將包被抗原用包被液稀釋至0.625mg/L，每孔內(nèi)加入IOOii L，37°C過夜，用洗滌液洗滌2次，在吸水紙上拍干。2)加入封閉液150 y L/孔進(jìn)行封閉，37°C過夜，甩干后放入烘箱烘干。3)加稀釋倍數(shù)為1:6000的黃曲霉毒素M1單克隆抗體50 U L/孔與不同濃度的黃曲霉毒素M1溶液50 u L/孔于相應(yīng)孔內(nèi)，370C 60min,洗板5次，在吸水紙上拍干。4)加入IOOiiL/孔稀釋度為1:6000的辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37°C 30min，洗板5次，在吸水紙上拍干。5)加入現(xiàn)配的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)液，100 U L/孔，測定發(fā)光值。檢測結(jié)果以抑制率計算，抑制率(％)=B/BqX100 (%)，B是不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液競爭的發(fā)光值，B0是不加標(biāo)準(zhǔn)品的發(fā)光值。計算50%抑制率時標(biāo)準(zhǔn)品的濃度即為黃曲霉毒素M1單克隆抗體的靈敏度，為0.048ng/mL。 實施例3黃曲霉毒素M1化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(I)試劑盒的組成
I)包被有黃曲霉毒素M1抗原的化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板:酶標(biāo)板為96孔可拆不透明白色發(fā)光板，已包被黃曲霉毒素M1抗原和封閉液；黃曲霉毒素M1抗原為黃曲霉毒素M1與牛血清白蛋白的偶聯(lián)物，包被濃度為0.625mg/L。酶標(biāo)板的制備:取96孔可拆不透明白色發(fā)光板，包被抗原用包被液稀釋至
0.625mg/L，每孔內(nèi)加入100 y L，37°C過夜，傾去孔內(nèi)液體，洗滌液洗滌2次，在吸水紙上拍干。然后每孔加入封閉液150y L，37°C孵育過夜，傾去孔內(nèi)液體，置于37°C烘箱中烘干后用鋁箔袋真空密封4°C保存。2)黃曲霉毒素 M1 系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度 0.0,0.01,0.03,0.1,0.3、1、3 ii g/L)。3)黃曲霉毒素M1單克隆抗體2mg/mL，其工作濃度為1:6000。4)辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgGlOmg/mL:其工作濃度為1:6000。5 )化學(xué)發(fā)光液:由A液和B液組成。6) 20倍濃縮洗滌液。(2)試劑分裝:將各試劑測定合格后無菌分裝,黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品(IOii g/mL)lmL/瓶，已稀釋的黃曲霉毒素M1單克隆抗體7mL/瓶，已稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG7mL/瓶，A液7mL/瓶，B液7mL/瓶，20倍濃縮洗滌液50mL/瓶。分裝后貼標(biāo)簽，注明批號和有效期，4 °C保存。(3)試劑盒的組裝:分別將步驟(I)的包被有黃曲霉毒素M1抗原的化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板I塊和黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品、黃曲霉毒素M1單克隆抗體、辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG, A液、B液、20倍濃縮洗滌液各I瓶及使用說明書I份置試劑盒內(nèi)指定位置，試劑盒檢驗合格后封裝，4 C保存。 實施例4黃曲霉毒素M1化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的使用方法(I)樣品前處理I)液態(tài)乳將待測樣品搖勻，稱取5.0g試樣到IOmL離心管中，2 8°C以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心lOmin，用脫脂棉簽除去上層脂肪。加入150i!L0.36mOl/L亞鐵氰化鉀溶液，短暫渦旋混合后加入150 u L1.04mol/L硫酸鋅溶液，渦旋振蕩3min后，于10 15°C以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心lOmin，上清液即可用于檢測。2)乳粉稱取10.0g待測乳粉于小燒杯中，加50°C熱水溶解，轉(zhuǎn)移到IOOmL容量瓶中，定容至刻度，以下同液態(tài)乳處理。(2)試劑盒的檢測方法I)取出試劑盒，置于室溫(20 24°C)平衡30min以上，取出化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板，用
0.0lmol/L PBST將黃曲霉韋素M1標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成一系列不冋濃度的黃曲霉韋素M1標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.0,0.01,0.03,0.1,0.3、l、3ii g/L)。2)在標(biāo)準(zhǔn)孔加入50 ii L不同濃度的黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，樣品孔加入50 ii L待測樣品，然后每孔加入50 ii L用0.0lmol/L PBST稀釋好的黃曲霉毒素M1單克隆抗體，蓋上蓋板膜在微量振蕩器上振搖IOmin后,置于37°C孵育50min。3)吸除板孔中的反應(yīng)液，各孔加入洗滌液約300ii L，靜置20秒左右，除去其中液體，如此共洗5次，最后ー次將板拍干；也可用自動洗板機洗板5次。洗完后將微孔架倒置在吸水紙上拍打(每輪洗板拍打3次)以保證完全除去孔中的液體。4)在酶標(biāo)板中加入100 UL稀釋好的辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，輕拍混勻后，置于37°C孵育30min。5)每孔加入100 u L底物緩沖液與底物液等體積混合后的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)液，輕拍混勻，蓋上蓋板膜，I 2min后用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定各孔的發(fā)光值RLU，保存數(shù)據(jù)。(3)檢測結(jié)果計算與分析抑制率(％)=B/BqX100 (%)式中:B—不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液孔(或樣品孔)的發(fā)光值^tl-O濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)光值。以抑制率為縱坐標(biāo)，黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而確定樣品中黃曲霉毒素M1的含量。實施例5試劑盒精密度與準(zhǔn)確度試驗( I)黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品溶液的重復(fù)性試驗從3批按照實施例3中的方法制備的酶標(biāo)板中，各抽出20個微孔，按照實施例4中試劑盒的檢測方法測定0.1 u g/L黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)溶液的發(fā)光值，重復(fù)20次，計算變異系數(shù)CV%，結(jié)果見表I。表I黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)性試驗
權(quán)利要求
1.種黃曲霉毒素M1的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于:所述檢測試劑盒包括包被有黃曲霉毒素M1抗原的化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板，黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品，黃曲霉毒素M1抗體，酶標(biāo)抗抗體，化學(xué)發(fā)光液和洗漆液。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的黃曲霉毒素M1的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于:所述的化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板為96孔可拆不透明白色發(fā)光板；所述的黃曲霉毒素M1抗原為黃曲霉毒素M1與牛血清白蛋白的偶聯(lián)物；所述的黃曲霉毒素M1抗原的包被濃度為0.625mg/し
3.據(jù)權(quán)利要求1所述的黃曲霉毒素M1的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于:所述的黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為lmg/mL，使用時用0.01mol/L PBST將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成濃度為0.0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3 ii g/L的一系列黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
4.據(jù)權(quán)利要求1所述的黃曲霉毒素M1的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于: 所述的黃曲霉毒素M1抗體為黃曲霉毒素M1單克隆抗體或兔多克隆抗體； 所述的酶標(biāo)抗抗體為辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG。
5.據(jù)權(quán)利要求4所述的黃曲霉毒素M1的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于: 所述的黃曲霉毒素M1抗體 為黃曲霉毒素M1單克隆抗體，其原濃度為2mg/mL，使用時用0.01mol/L PBST 稀釋 6000 倍； 所述的酶標(biāo)抗抗體為辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，其原濃度為10mg/mL，使用時用0.01mol/L PBST 稀釋 6000 倍。
6.據(jù)權(quán)利要求1所述的黃曲霉毒素M1的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于:所述的化學(xué)發(fā)光液由A液和B液組成,A液為將20mg對碘苯酹、8mg魯米諾、1.21g Tris溶于IOOmL去離子水，用鹽酸調(diào)pH至8.4得到；B液為將體積分?jǐn)?shù)0.40%H202、1.21g Tris溶于IOOmL去離子水，用鹽酸調(diào)pH至7.0得到；使用時將A液和B液按體積比1:1的比例混合。
7.據(jù)權(quán)利要求1所述的黃曲霉毒素M1的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于:所述的洗滌液為20倍濃縮洗滌液，為含有體積濃度0.5%Tween20的pH7.40.4mol/L的磷酸鹽緩沖液，使用時用去離子水稀釋成I倍洗滌液。
8.利要求1 7任一項所述的黃曲霉毒素M1的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的使用方法，其特征在于包含如下步驟: (1)將試劑盒置于15 35°C平衡30min以上； (2)取出化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板，往標(biāo)準(zhǔn)孔中加入不同濃度的黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，樣品孔中加入待測樣品，然后每孔加入黃曲霉毒素M1抗體，蓋上蓋板膜振搖混勻，孵育； (3)吸除板孔中的反應(yīng)液，加入洗滌液洗滌，將酶標(biāo)板拍干； (4)往各孔中加入酶標(biāo)抗抗體，輕拍混勻，孵育； (5)每孔加入化學(xué)發(fā)光反應(yīng)液，輕拍混勻，蓋上蓋板膜，I 2min后用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定各孔的發(fā)光值RLU ； (6)檢測結(jié)果計算與分析:抑制率(GzO=Bz^lX100 (%)，式中:B—不同濃度黃曲霉毒素M1-準(zhǔn)溶液孔或樣品孔的發(fā)光值一0濃度黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)光值；以抑制率為縱坐標(biāo)，黃曲霉毒素M1濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而確定樣品中黃曲霉毒素M1的含量。
9.據(jù)權(quán)利要求8所述的黃曲霉毒素M1的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的使用方法，其特征在于步驟(2)中所述的待測樣品為液態(tài)乳或乳粉，其處理方法如下: 液態(tài)乳:將待測液態(tài)乳搖勻，稱取5.0g試樣到IOmL離心管中，2 8°C以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心lOmin，用脫脂棉簽除去上層脂肪；加入150 y L0.36mol/L亞鐵氰化鉀溶液，短暫渦旋混合后加入150 u L1.04mol/L硫酸鋅溶液，渦旋振蕩3min后，于10 15°C以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心lOmin，上清液即可用于檢測； 乳粉:稱取10.0g待測乳粉于小燒杯中，加50°C熱水溶解，轉(zhuǎn)移到IOOmL容量瓶中，定容至刻度，以下處理同液態(tài)乳。
10.據(jù)權(quán)利要求8所述的黃曲霉毒素M1的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的使用方法，其特征在于包含如下步驟: (1)將試劑盒置于室溫平衡30min以上，用0.0lmol/L PBST將黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成濃度分別為0.0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3 ii g/L的黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品溶液； (2)取出化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板，在標(biāo)準(zhǔn)孔加入50y L不同濃度的黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，樣品孔加入50 y L待測樣品，然后每孔加入50 y L稀釋好的黃曲霉毒素M1單克隆抗體，蓋上蓋板膜在微量振蕩器上振搖IOmin后,置于37°C孵育50min ； (3)吸除板孔中的反應(yīng)液，各孔加入洗滌液約300yL，靜置20秒左右，除去其中液體，如此共洗5次，最后ー次將板 拍干；也可用自動洗板機洗板5次，洗完后將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去孔中的液體； (4)往各孔中加入100u L稀釋好的辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG酶標(biāo)抗抗體，輕拍混勻后，置于37°C孵育30min; (5)每孔加入100y L A液與B液等體積混合后的化學(xué)發(fā)光液，輕拍混勻，蓋上蓋板膜，I 2min后用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定各孔的發(fā)光值RLU，保存數(shù)據(jù)； (6)檢測結(jié)果計算與分析:抑制率(GzO=Bz^lX100 (%)，式中:B—不同濃度黃曲霉毒素M1-準(zhǔn)溶液孔或樣品孔的發(fā)光值一0濃度黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)光值；以抑制率為縱坐標(biāo)，黃曲霉毒素M1濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而確定樣品中黃曲霉毒素M1的含量。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃曲霉毒素M1的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及使用方法，屬于化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域。該檢測試劑盒包括包被有黃曲霉毒素M1抗原的化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板，黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品，黃曲霉毒素M1抗體，酶標(biāo)抗抗體，化學(xué)發(fā)光液A液和B液。該試劑盒的使用方法包括如下步驟(1)待測樣品的前處理；(2)依次加入黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品、黃曲霉毒素M1抗體，競爭反應(yīng)后加入酶標(biāo)抗抗體，最后加入化學(xué)發(fā)光液通過化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進(jìn)行黃曲霉毒素M1的定量檢測；(3)結(jié)果處理與分析。本發(fā)明提供的檢測試劑盒靈敏度高、穩(wěn)定性好，適合大量樣品的篩查，具有重要的實際應(yīng)用推廣意義。
文檔編號G01N33/577GK103091494SQ20131001360
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月14日
發(fā)明者楊金易, 孫遠(yuǎn)明, 王弘, 雷紅濤, 沈玉棟, 徐振林, 李萍 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)