長(zhǎng)牡蠣快速生長(zhǎng)相關(guān)的snp標(biāo)記及其鑒定方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種與長(zhǎng)牡頗快速生長(zhǎng)相關(guān)的SNP標(biāo)記 及其鑒定方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 長(zhǎng)牡頗(Crassostrea gigas)又稱太平洋牡頗，屬于瓣觸綱，珍珠貝目，牡頗科，自 然分布于日本、中國(guó)和韓國(guó)沿海。長(zhǎng)牡頗具有環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)快、肉質(zhì)細(xì)膩和營(yíng)養(yǎng)豐富 等優(yōu)點(diǎn)，是世界上養(yǎng)殖范圍最廣、產(chǎn)量最高的經(jīng)濟(jì)貝類。長(zhǎng)牡頗是我國(guó)傳統(tǒng)的重要養(yǎng)殖品 種，但是近年來(lái)隨著養(yǎng)殖集約化程度的提高和養(yǎng)殖海區(qū)環(huán)境的惡化，長(zhǎng)牡頗出現(xiàn)死亡率高、 出肉率低、個(gè)體小型化等問題，嚴(yán)重影響了牡頗養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。因此，進(jìn)行長(zhǎng)牡頗的遺 傳改良，培育具有優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆等優(yōu)良性狀的新品種，已成為牡頗養(yǎng)殖業(yè)亟待解決的問 題。
[0003] 傳統(tǒng)的雜交、選擇等育種手段在貝類的品種遺傳改良中已初見成效。但是傳統(tǒng)雜 交方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，育種效率低，且受人為因素影響較大，育種效果并不十分理想。隨著分子 生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，W分子標(biāo)記為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)為水產(chǎn)動(dòng)物的遺 傳改良提供了有力工具，可顯著提高選擇育種的效率和精確性。其中，SNP作為目前最具發(fā) 展?jié)摿Φ姆肿訕?biāo)記，因其在基因組中數(shù)量多、分布廣且遺傳穩(wěn)定性高，易于實(shí)現(xiàn)高通量自動(dòng) 化分析的優(yōu)勢(shì)，已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物遺傳育種研究中。如果SNP標(biāo)記可W與長(zhǎng)牡頗生長(zhǎng)性 狀相關(guān)聯(lián)，就可W實(shí)現(xiàn)從DNA水平上進(jìn)行選擇育種，克服傳統(tǒng)方法受人為因素影響較大的缺 點(diǎn)，大大提高選擇的準(zhǔn)確性，并可在早期鑒定出具有優(yōu)良性狀的個(gè)體，從而縮短育種周期， 加快育種進(jìn)程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)發(fā)展的現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供了3個(gè)與長(zhǎng)牡頗快速生長(zhǎng)相關(guān)的 SNP等位基因，并建立了一種快速、準(zhǔn)確、有效地利用SNP標(biāo)記檢測(cè)長(zhǎng)牡頗優(yōu)良個(gè)體的方法， 能夠在早期就鑒定出具有生長(zhǎng)優(yōu)良性狀的長(zhǎng)牡頗個(gè)體，大大縮短了長(zhǎng)牡頗育種周期。
[0005] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取的具體技術(shù)方案如下：
[0006] 長(zhǎng)牡頗快速生長(zhǎng)相關(guān)的SNP標(biāo)記，其特征在于：
[0007] 第一個(gè)SNP標(biāo)記命名為jl027,其位于NCBI網(wǎng)站上登錄號(hào)為FQ668499的EST序列的 第514個(gè)堿基處，突變類型為:4/6;
[000引第二個(gè)SNP標(biāo)記命名為jl090,其位于NCBI網(wǎng)站上登錄號(hào)為HS232693的EST序列的 第615個(gè)堿基處，突變類型為:C/T;
[0009] 第Ξ個(gè)SNP標(biāo)記命名為jl615,其位于NCBI網(wǎng)站上登錄號(hào)為HS189919的EST序列的 第557個(gè)堿基處，突變類型為:C/T。
[0010] 所述的；種5順標(biāo)記的篩選方法，包括如下步驟：
[0011] 1)實(shí)驗(yàn)群體的獲得：W長(zhǎng)牡頗養(yǎng)殖群體作為繁殖親本，通過(guò)連續(xù)5代的選擇育種而 培育出的長(zhǎng)牡頗快速生長(zhǎng)系;對(duì)照組為隨機(jī)選擇的長(zhǎng)牡頗養(yǎng)殖群體;快速生長(zhǎng)系在殼高、殼 長(zhǎng)、殼寬、總重及軟體部重5項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)上顯著優(yōu)于對(duì)照組(P<0.01);
[0012] 2)驗(yàn)證群體的獲得:在長(zhǎng)牡頗養(yǎng)殖群體中，W殼高和總重為選擇指標(biāo)，選出表型值 的極大群體和極小群體，記為驗(yàn)證群體，用于驗(yàn)證通過(guò)步驟1)實(shí)驗(yàn)群體篩選得到的SNP位 占 . '?、、，
[OOU] 3)利用從EST序列中開發(fā)的具有多態(tài)性且分型效果好的SNP標(biāo)記進(jìn)行基因分型，運(yùn) 用卡方檢驗(yàn)分析SNP標(biāo)記在快速生長(zhǎng)系和對(duì)照組中的等位基因頻率分布差異，初步篩選出9 個(gè)SNP位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀相關(guān)聯(lián)(P<0.0001);
[0014] 4)用步驟3)中篩選出的9個(gè)SNP位點(diǎn)在驗(yàn)證群體中進(jìn)行驗(yàn)證，經(jīng)卡方檢驗(yàn)最終得到 3個(gè)與長(zhǎng)牡頗生長(zhǎng)性狀相關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)(P<0.01);3個(gè)SNP位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)閖l027位 點(diǎn)的等位基因 G、jl090位點(diǎn)的等位基因 C和jl615位點(diǎn)的等位基因 C。
[00巧]所述的3個(gè)SNP標(biāo)記的擴(kuò)增引物分別為：
[0016] j1027-F：GACCAGACCTGGAGCGAGAAC,
[0017] j1027-R:TTCACTGCATTGGTAGAATCCTC；
[0018] j1090-F:GCGACAGATACCAACAACGTACAG，
[0019] j1090-R:CACAGTCCTTGAGATTGTTCTTGAT；
[0020] j1615-F:ACTCAAGTCAGCGTACAAATCGTT,
[0021] jl615-R:GACACGTTCTGTAGCGGTAGGAG。
[0022] 所述的SNP標(biāo)記在篩選快速生長(zhǎng)長(zhǎng)牡頗親本中的應(yīng)用，其特征在于，該應(yīng)用為:檢 測(cè)長(zhǎng)牡頗親本在所述jl〇27、jl090和jl6153位點(diǎn)的等位基因，將同時(shí)具有jl027位點(diǎn)的等位 基因 G、jl090位點(diǎn)的等位基因 C和jl615位點(diǎn)的等位基因 C的個(gè)體選作親本。
[0023] 進(jìn)一步的，上述應(yīng)用的具體方法為:1)從待測(cè)親本中剪取閉殼肌樣品，提取DNA;
[0024] 2似提取得到的DNA為模板，利用所述3個(gè)SNP標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和高分辨率 烙解曲線分析技術(shù)對(duì)每個(gè)親本樣品進(jìn)行基因分型，將同時(shí)存在jl027的等位基因 G、jl090的 等位基因 C、jl615的等位基因 C的個(gè)體保留，即為長(zhǎng)牡頗快速生長(zhǎng)親本。利用本方法將生產(chǎn) 中同時(shí)具有運(yùn)3個(gè)優(yōu)勢(shì)等位基因的個(gè)體選作親本，可實(shí)現(xiàn)在早期鑒定出具有優(yōu)良性狀的個(gè) 體，從而縮短育種周期，加快育種進(jìn)程。
[0025] 進(jìn)一步的，所述的高分辨率烙解曲線分析的反應(yīng)體系為： 10 X Buffer 1μ1 dNTP 0.2mM Μ gel 2 l'5mM 上下雜引物 0.2μΜ
[0026] , Τ叫酶 0.25U DNA 權(quán)扳 iOng SY-rert) 5μΜ cidH：0 補(bǔ) ?? ΙΟμ!
[0027] 高分辨率烙解曲線分析的反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5mim，95°C變性10s; touchdown 程序10s，為63°c-60°c，每個(gè)循環(huán)下降ο. 5°C; 72°C延伸10s，10s末收集單個(gè)巧光，40個(gè)循環(huán)； 95°C反應(yīng)lmin，40°C反應(yīng)Imin，同時(shí)收集巧光信號(hào)，1個(gè)循環(huán);70-90°C讀取巧光曲線，25次/ °C〇
[002引本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0029] 1)本發(fā)明選用的SNP標(biāo)記是從保守性較高的EST序列中開發(fā)得到的，運(yùn)些標(biāo)記與表 達(dá)基因緊密連鎖或直接位于基因的編碼區(qū)內(nèi)，提高了篩選相關(guān)基因的效率。
[0030] 2)本發(fā)明通過(guò)HRM分析進(jìn)行基因分型，既保證了檢測(cè)結(jié)果的可靠性，也避免了測(cè)序 分析的繁瑣操作，極大地提高了實(shí)驗(yàn)效率。
[0031] 3)與傳統(tǒng)的選育方法相比，本發(fā)明具有目的性強(qiáng)、作用效果直接的特點(diǎn)，能夠快速 獲得生長(zhǎng)速度快且遺傳穩(wěn)定的長(zhǎng)牡頗個(gè)體;本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速成本低，便于廣泛推 廣使用。
【附圖說(shuō)明】
[0032] 圖1為長(zhǎng)牡頗生長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記篩選流程圖。
[0033 ]圖2為SNP位點(diǎn)j 127的高分辨率烙解曲線圖。
[0034]圖3為SNP位點(diǎn)j 190的高分辨率烙解曲線圖。
[003引圖4為SNP位點(diǎn)j 1615的高分辨率烙解曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面通過(guò)具體實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)闡述。
[0037] 實(shí)施例：
[0038] 1、與長(zhǎng)牡頗快速生長(zhǎng)相關(guān)的SNP標(biāo)記篩選，篩選流程如圖1所示：
[0039] 1)2014年7月選取24月齡的經(jīng)連續(xù)選育5代的長(zhǎng)牡頗快速生長(zhǎng)系的96個(gè)個(gè)體，對(duì)照 組為取自榮成市普通養(yǎng)殖群體的96個(gè)個(gè)體，共計(jì)192個(gè)個(gè)體作為實(shí)驗(yàn)群體，用于與生長(zhǎng)相關(guān) SNP位點(diǎn)的初步篩選;快速生長(zhǎng)系群體在殼高、殼長(zhǎng)等5項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)上顯著優(yōu)于普通養(yǎng)殖群 體(P<0.01)，見表 1。
[0040] 表1快速生長(zhǎng)系與普通養(yǎng)殖群體生長(zhǎng)性狀的比較
[0041]
[0042] 注:表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，同列間標(biāo)注不同字母的表示該生長(zhǎng)性狀在兩 個(gè)群體中差異極顯著(P<〇.01)。
[0043] 2) 2015年12月，在取自乳山市的長(zhǎng)牡頗養(yǎng)殖群體中隨機(jī)選擇300個(gè)個(gè)體，取48個(gè)殼 高大于92.24mm且總重大于101.1?的高值個(gè)體，作為極大群體，取48個(gè)殼高小于90.75mm且 總重小于86.55g的低值個(gè)體，作為極小群體，此96個(gè)個(gè)體作為驗(yàn)證群體，用于驗(yàn)證通過(guò)步驟 1)的實(shí)驗(yàn)群體篩選出的SNP位點(diǎn)；