基于AllGlo探針的rs2844682檢測(cè)分型試劑盒及其分型方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及單核巧酸多態(tài)性(SNP)，尤其是設(shè)及一種基于AllGlo探針的rs2844682 檢測(cè)分型試劑盒及其分型方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 單核巧酸多態(tài)性（single nucleotide polymor曲ism,SNP),主要是指在基因組水 平上由單個(gè)核巧酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類(lèi)可遺傳的變異中最常見(jiàn)的一 種。SNPs在人類(lèi)基因組中廣泛存在，平均每500~1000個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá) 300萬(wàn)個(gè)甚至更多。作為第Ξ代遺傳標(biāo)志，SNP與人體許多表型差異、藥物易感性與疾病易感 性密切相關(guān)。SNP在基因組中的大量存在，使其成為一個(gè)強(qiáng)有力的工具，在疾病定位與克隆、 藥物的設(shè)計(jì)和測(cè)試W及生物學(xué)的基礎(chǔ)研究中起了非常重要的作用。
[0003] 個(gè)體化診斷治療是未來(lái)醫(yī)學(xué)發(fā)展的大方向。將個(gè)體化的祀點(diǎn)定位于某個(gè)基因，甚 至是單個(gè)核巧酸，發(fā)現(xiàn)疾病的遺傳標(biāo)志物，將有助于根據(jù)每個(gè)患者的不同遺傳背景來(lái)開(kāi)展 疾病預(yù)防、診斷和治療?；虻腟NP是形成個(gè)體間差異的重要遺傳學(xué)基礎(chǔ)，通過(guò)SNP與疾病和 藥物治療的關(guān)聯(lián)性分析，使得醫(yī)生不僅可W通過(guò)所檢測(cè)出的SNP預(yù)測(cè)、確定與疾病有關(guān)的基 因，同時(shí)也將能夠事先把握患者個(gè)體對(duì)于某種藥物的反應(yīng)特點(diǎn)，并根據(jù)運(yùn)一特點(diǎn)選擇治療 效果最好，不良反應(yīng)等危險(xiǎn)性最小的藥物對(duì)患者進(jìn)行精準(zhǔn)治療。
[0004] SNP在疾病的預(yù)防、診斷、治療及個(gè)體化醫(yī)學(xué)發(fā)展中扮演著重要的角色，因此準(zhǔn)確 快速的進(jìn)行SNP檢測(cè)分型具有重大的意義。
[0005] 目前，SNP分型的方法主要有直接測(cè)序技術(shù)法、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù) (RFLP)、化gman巧光探針?lè)?、擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS)、高分辨烙解曲線(xiàn)分析法化RM)等。其 中，直接測(cè)序法是目前最直觀，準(zhǔn)確性相對(duì)而言最高的SNP分型方法，但其步驟多而分散，成 本較高，工作量大，周期長(zhǎng)，價(jià)格昂貴，不適合大樣本多位點(diǎn)檢測(cè);限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技 術(shù)(RFLP)作為一種最早的DNA標(biāo)記技術(shù)，對(duì)儀器要求低，只需要一臺(tái)PCR儀W及電泳儀器即 可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但其實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，不適合大樣本檢測(cè);Tagman巧光探針?lè)?zhǔn)確 度較好，但其設(shè)計(jì)合成程序復(fù)雜，并且不適合多位點(diǎn)少量樣本的分型，尤其是頻率偏低的位 點(diǎn)；擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS法)快速、簡(jiǎn)便，但是不能閉管操作，對(duì)基因多態(tài)性分析難W實(shí) 現(xiàn)高通量、自動(dòng)化;高分辨烙解曲線(xiàn)分析法化IM)具有簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn)，但該方法特異性不 足，儀器選擇少。
[0006] AllGlo探針作為新一代的巧光探針，在具備化qMan-MGB探針優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，大大 提高信噪比，減少背景巧光信號(hào)。目前，AllGlo探針已經(jīng)成功應(yīng)用于檢測(cè)瘤疹病毒、乙型肝 炎病毒基因突變巧611邑，2.1.￥11,乂.￥.1^11,2.]\1.66]1邑，0.￥.211日]1邑，1^.化6]1,5.]\1?日口1(1 detection of the hepatitis B virus YMDD mutant using AllGlo?probes[J].Clin Chim Acta,2011,412( 11-12) :1018-1021 )、侵襲性曲霉菌病(Wu，D.S. aienJ.Z. Zhou, X.Q.Shen,S.F.Wu,X.M.The establishment and evaluation of diagnostic accuracy of AllGlo(TM)probe-based techniques for invasive aspergillosis[J].Zhong hua Nei Ke Za Zhi,2010,49(2):142-145)〇
[0007] 藥物方面的研究發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)白細(xì)胞抗原HLA-B*15:02會(huì)顯著地增加卡馬西平藥物 不良反應(yīng)發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致嚴(yán)重的皮膚反應(yīng)，例如史蒂文斯一約翰遜綜合征(SJS)和中毒性 表皮壞死松解癥（TEN) (Grover S,Kukreti R(2014)HLA alleles and hypersensitivity to carbamazepine: an updated systematic review with meta-analysis.Pharmacogenet Genomics 24:94-112.doi:10.1097/FPC.0000000000000021)〇
[0008] 有報(bào)道表明HLA-B*15:02所導(dǎo)致的藥物不良反應(yīng)不僅局限于卡馬西平，在一些與 卡馬西平結(jié)構(gòu)類(lèi)似的藥物中也會(huì)出現(xiàn)SJS/TEN，例如苯妥英鋼、拉莫Ξ嗦等（Bloch KM， Sills GJ,Pirmohamed M,Alfirevic A(2014)Pharmacogenetics of antiepileptic drug-induced hypersensitivity .Pharmacogenomics 15:857-868.do1:10.2217/ pgs.l4.65)?；痯Map顯示，在中國(guó)漢族人群中單核巧酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2844682可W作為HLA-B*15:02的一個(gè)標(biāo)簽SNP，利用rs2844682的檢測(cè)分型能有效鑒別HLA-B*15:02,用藥前檢測(cè) 患者HLA-B*15:02,鑒別出藥物不良反應(yīng)個(gè)體，避免嚴(yán)重藥物毒副反應(yīng)，為臨床治療用藥提 供重要的參考依據(jù)。在個(gè)體化診斷與治療快速發(fā)展的背景下，rs2844682作為HLA-B*15:02 的標(biāo)簽SNP，與多種臨床藥物不良反應(yīng)的密切聯(lián)系使其成為了一個(gè)極具醫(yī)學(xué)潛力的SNP位 點(diǎn)，因此急需一種更快速高效的SNP分型方法來(lái)滿(mǎn)足精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的之一在于針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)SNP方法中使用的試劑盒和檢測(cè)方法存在的 上述缺陷，提供基于AllGlo探針的rs2844682檢測(cè)分型試劑盒。
[0010] 本發(fā)明的目的之二在于提供基于AllGlo探針的rs2844682檢測(cè)分型方法。
[0011] 所述基于AllGlo探針rs2844682檢測(cè)分型試劑盒，包括實(shí)時(shí)巧光定量PCR試劑、陽(yáng) 性對(duì)照及陰性對(duì)照；
[0012] 所述rs2844682為美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中屯、(NCBI)所提供的SNP位點(diǎn)編號(hào)。
[001引所述實(shí)時(shí)巧光定量PCR試劑包括W下組份：10 X Taq緩沖液、10m mol的MgCl2、加 /μ L的Taq Hotstad DNA聚合酶、10m mol dNTPs混合液、50XLOW ROXaOOmL無(wú)核酶水、10μ mol/L rs2844682的特異正向引物、10ymol/L rs2844682的特異反向引物和AllGlo探針；所 述lOXTaq緩沖液包括 100m mol Tris-HCl和500m mol KC1。
[0014] 所述rs2844682的特異正向引物的核巧酸序列為：
[0015] 沈Q ID NO.1:5 >-ATAAAATGGGTCAGGATGGGC-3 >;
[0016] 所述rsl799945的特異反向引物的核巧酸序列為：
[0017] SEQ ID N0.2:5'-TTCTGACTGTCCCGTTGGC-3'。
[001引所述A1 IGlo探針為rs2844682的特異探針，其核巧酸序列為：
[0019] SEQ ID N0.3：rs2844682-G:MAR-CTCCAAGGGATTG-MAR；
[0020] SEQ ID N0.4：rs2844682-A:JUP-CTCCAAGGAATTG-JUP〇
[0021 ] 所述陽(yáng)性對(duì)照包括：陽(yáng)性純合對(duì)照品1、陽(yáng)性純合對(duì)照品2、陽(yáng)性雜合對(duì)照品；所述 陽(yáng)性純合對(duì)照品1為rs2844682分型為GG的DNA樣品，所述陽(yáng)性純合對(duì)照品2為rs2844682分 型為AA的DNA樣品，所述陽(yáng)性雜合對(duì)照品為rs2844682分型為GA的DNA樣品。
[0022]所述陰性對(duì)照為ImL的無(wú)核酶水。
[0023] 所述基于AllGlo探針的rs2844682檢測(cè)分型方法，包括W下步驟：
[0024] 1)采用常規(guī)方法提取邸TA抗凝全血樣本中的DNA;
[0025] 2)采用所述基于AllGlo探針的rs2844682檢測(cè)分型試劑盒提供的實(shí)時(shí)巧光定量 PCR試劑將DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光定量PCR擴(kuò)增；
[00%] 3)根據(jù)檢測(cè)到的巧光信號(hào)對(duì)rs2844682SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型。
[0027] 所述AllGlo探針可采用美國(guó)AlleLogic Biosciences Co巧oration公司的巧光定 量探針，它擁有普通化qman，化qman-MGB及分子信標(biāo)(molecular beacon)探針?biāo)袃?yōu)點(diǎn)，克 服了目前運(yùn)幾種探針的最大弊端，它打破了傳統(tǒng)Taqman-端報(bào)告基團(tuán)一端澤滅基團(tuán)的限 審ij，利用了美國(guó)AlleLogic Biosciences Corporation公司研制的幾種常見(jiàn)波長(zhǎng)的特制巧 光染料，標(biāo)記在寡核巧酸上面互為報(bào)告基團(tuán)和粹滅基團(tuán)，而且上面含有特殊的可W提高Tm 值(退火溫度)的化學(xué)基團(tuán)，提高探針特異性，雜交特異性大大提高，在雜交水解之后兩端標(biāo) 記的染料又全部變?yōu)閳?bào)告基團(tuán)，提高巧光增量。
[00%]所述AllGlo探針具有W下優(yōu)勢(shì)：①提高Tm值(可達(dá)10°CW上），探針更短可W達(dá)到 15~16個(gè)堿基，可W適用A，T含量比較高的序列設(shè)計(jì)探針;②加大了多重巧光定量的選擇， 因?yàn)槊糠N染料即是報(bào)告基團(tuán)又是澤滅基團(tuán)，打破傳統(tǒng)化qman探針因波長(zhǎng)原因標(biāo)記選擇困 難，不受澤滅基團(tuán)波長(zhǎng)限制；③大大提高信噪比，無(wú)背景信號(hào)，空間距離近，更好的澤滅效 果;④成本較低，價(jià)格僅相當(dāng)于化qman-MGB探針的一半，具有MGB探針?biāo)袃?yōu)勢(shì)。
[0029] 本發(fā)明采用了 AllGlo探針技術(shù)，設(shè)計(jì)了特異性引物和相應(yīng)的AllGlo探針，探針?lè)?別標(biāo)記巧巾特殊巧光基團(tuán)(MAR、