一種靶向腫瘤的雙調(diào)控重組腺相關(guān)病毒包裝系統(tǒng)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種靶向腫瘤的雙調(diào)控重組腺相關(guān)病毒 包裝系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤是當(dāng)前嚴(yán)重影響人類健康、威脅人類生命的重大疾病之一，目前臨床治 療方法主要是采用放射治療及化學(xué)療法。然而，有些惡性腫瘤對放射治療不敏感，對化療易 產(chǎn)生耐藥性，而且這種治療方案通常伴有明顯的毒性作用。因此，研究選擇性殺滅腫瘤細(xì)胞 而不影響正常細(xì)胞的方法對腫瘤治療非常重要，這種選擇性殺滅腫瘤細(xì)胞的方法主要依賴 于腫瘤細(xì)胞的特異性標(biāo)記，其療效也取決于該特異性標(biāo)記是否嚴(yán)格限制于腫瘤細(xì)胞內(nèi)。
[0003] 端粒是真核細(xì)胞保護(hù)染色體末端的結(jié)構(gòu)，正常細(xì)胞每分裂一次，端粒就會縮短， 當(dāng)端?？s短至一定程度時會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生惡變時，其端粒酶被激活，使腫 瘤細(xì)胞分裂所致端粒的縮短進(jìn)一步延長，從而維持染色體的穩(wěn)定，使細(xì)胞逃逸死亡獲得永 生，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不斷增值，因此端粒酶激活在腫瘤細(xì)胞發(fā)生及發(fā)展過程中其關(guān)鍵作 用。端粒酶在大約90%腫瘤細(xì)胞均陽性，而極大多數(shù)正常細(xì)胞端粒酶均為陰性，因此端粒 酶可作為腫瘤細(xì)胞一種特征性標(biāo)記。到目前為止，人的端粒酶由三個部分組成：1)RNA組分 (hTERC) ;2)端粒酶結(jié)合蛋白（TEP1) ;3)端粒逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT)。最近研究表明端粒逆轉(zhuǎn)錄 酶（hTERT)在端粒酶活性中起決定作用，在極大多數(shù)腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞株中端粒逆轉(zhuǎn)錄 酶呈高水平表達(dá)，而正常細(xì)胞中不表達(dá)或低水平表達(dá)。
[0004] 正常細(xì)胞的能量主要來源于葡萄糖，氧供應(yīng)充足的情況下正常的細(xì)胞組織主要通 過糖酵解和線粒體呼吸兩個步驟，將葡萄糖氧化成二氧化碳和水，為細(xì)胞生物活動提供能 量，氧供應(yīng)不足的時候依靠糖酵解供應(yīng)能量。惡性腫瘤細(xì)胞即使在氧供應(yīng)充足的條件下，仍 然有高的糖酵解比例是惡性腫瘤能量代謝方面的一個特異性的表現(xiàn)，80年前OttoWarburg 在肝癌細(xì)胞中首先發(fā)現(xiàn)這個現(xiàn)象，該現(xiàn)象被稱為Warburg效應(yīng)。己糖激酶是糖酵解和能 量代謝的調(diào)節(jié)者，惡性腫瘤細(xì)胞中己糖激酶II (HKII)表達(dá)增高。HKII是目前研究最多 的腫瘤細(xì)胞糖酵解酶。Ko等人通過動物實驗顯示，HKII藥物抑制劑（3-BrPA)局部和全 身用藥可殺滅大部分肝移植瘤和肺轉(zhuǎn)移瘤，但對癌周正常肝組織和其他主要臟器無損害 作用，抑制HKII對化療耐藥的腫瘤細(xì)胞同樣有明顯的殺傷作用（Ko YH，Pedersen PL， Geschwind JF. Glucose catabolism in the rabbit VX2tumor model for liver cancer ： characterization and targeting hexokinase[J]. Cancer Lett. 2001，173(1) :83_91)〇 HKII在惡性腫瘤中的高度表達(dá)，是惡性腫瘤的生物學(xué)特征，也是腫瘤生存的需要。
[0005] 近年來，由于病毒學(xué)、分子生物學(xué)及腫瘤學(xué)的飛速發(fā)展，人們已完成了多個病毒全 部基因組的測序工作，并對其基因的結(jié)構(gòu)及其功能進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究，能有效地對病 毒基因進(jìn)行改造，改造后的病毒對腫瘤細(xì)胞的感染、復(fù)制增殖和溶解細(xì)胞的能力有效增強(qiáng)， 而對正常細(xì)胞這種能力減弱甚至消失，因此這種病毒能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行選擇性復(fù)制。目 前研究最深入的溶瘤病毒包括I型單純皰疹病毒-l(HSV-l)和腺病毒（ADV)等。腺相關(guān)病 毒（AAV)是一類微小、無被膜及具有二十面體結(jié)構(gòu)的細(xì)小單鏈DNA病毒，AAV具有安全性好、 宿主范圍廣、免疫源性低、在體內(nèi)表達(dá)外源基因時間長等特點，被視為最有前途的基因轉(zhuǎn)載 體之一，但是其在溶瘤方面的應(yīng)用研宄還未見有報道。
[0006] 構(gòu)建重組AAV需要有AAV ITR序列（倒轉(zhuǎn)末端重復(fù)序列）、Rep和Cap基因、宿主 細(xì)胞和輔助病毒。目前在基因治療研究中所用的AAV載體多數(shù)由2型AAV改造而來，AAV-2 的ITR序列中包含了復(fù)制、包裝、拯救及整合的信號；外源基因表達(dá)盒可完全取代AAV的編 碼序列，Rep和Cap基因產(chǎn)物則可由另一個質(zhì)粒反式提供；AAV復(fù)制常用的輔助病毒為腺病 毒，而腺病毒的輔助功能由Ela、Elb、E2a、E4和VA RNA基因提供。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明利用端粒酶和糖酵解作為腫瘤細(xì)胞的特異性標(biāo)記，采用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn) 染細(xì)胞包裝腺相關(guān)病毒，其中Adv-hTERT-Ep-Ela輔助質(zhì)粒攜帶有腺相關(guān)病毒增殖必須的 輔助腺病毒Ela、Elb、E2a、E4和VA RNA基因，pHKII-AAV-RC包裝質(zhì)粒攜帶有腺相關(guān)病毒 增殖必須的Rep和Cap基因，表達(dá)載體質(zhì)粒攜帶有腺相關(guān)病毒復(fù)制必須的ITR序列。同 時，應(yīng)用端粒逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT)啟動子來調(diào)控Ela、Elb、E2a、E4和VA RNA基因，己糖激酶 II (HKII)啟動子來調(diào)控Rep基因，從而使該腺相關(guān)病毒包裝系統(tǒng)只能在同時具有端粒逆轉(zhuǎn) 錄酶（hTERT)活性和己糖激酶II (HKII)活性的靶細(xì)胞中表達(dá)，這種修飾后的腺相關(guān)病毒包 裝系統(tǒng)具有極高的腫瘤細(xì)胞靶向性。
[0008] 本發(fā)明公開的一種靶向腫瘤的雙調(diào)控重組腺相關(guān)病毒包裝系統(tǒng)，其特征在于：該 包裝系統(tǒng)中腺相關(guān)病毒增殖必須的輔助腺病毒Ela、Elb、E2a、E4和VARNA基因受端粒逆 轉(zhuǎn)錄酶（hTERT)啟動子的有效控制，包裝質(zhì)粒的R印基因受己糖激酶II(HKII)啟動子的有 效控制。
[0009] 上述的一種靶向腫瘤的雙調(diào)控重組腺相關(guān)病毒包裝系統(tǒng)，其特征在于該包裝系統(tǒng) 由以下質(zhì)粒構(gòu)成：
[0010] (1) hTERT啟動子調(diào)控的腺相關(guān)病毒輔助質(zhì)粒Adv-hTERT-Ep-Ela ;
[0011] (2)HKII啟動子調(diào)控的腺相關(guān)病毒包裝質(zhì)粒pHKII-AAV-RC
[0012] (3)腺相關(guān)病毒表達(dá)載體質(zhì)粒。
[0013] 上述的一種靶向腫瘤的雙調(diào)控重組腺相關(guān)病毒包裝系統(tǒng)，其特征在于采用三質(zhì)粒 共轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染細(xì)胞包裝腺相關(guān)病毒。
[0014] 上述的一種靶向腫瘤的雙調(diào)控重組腺相關(guān)病毒包裝系統(tǒng)，其特征在于所述的共轉(zhuǎn) 染方法是電穿孔法、磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、多種陽離子物質(zhì)或病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方 法。
[0015] 上述的一種靶向腫瘤的雙調(diào)控重組腺相關(guān)病毒包裝系統(tǒng)，其特征在于所述的共轉(zhuǎn) 染方法是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。
[0016] 上述的一種靶向腫瘤的雙調(diào)控重組腺相關(guān)病毒包裝系統(tǒng)，其特征在于所述的包裝 細(xì)胞為J1EK293細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞（HepG2)、人肺癌細(xì)胞（A549)、MCF-7 (人乳腺癌細(xì)胞）和 支氣管氣道上皮細(xì)胞（NHBEC)中的任意一種。
[0017] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明公開腺相關(guān)病毒包裝系統(tǒng)只能在同時具有端粒逆 轉(zhuǎn)錄酶（hTERT)活性和己糖激酶II(HKII)活性的靶細(xì)胞中表達(dá)，這種修飾后的腺相關(guān)病毒 包裝系統(tǒng)能在腫瘤細(xì)胞中正常表達(dá)，包裝出腺相關(guān)病毒，而在正常細(xì)胞中表達(dá)極低，具有極 高的腫瘤細(xì)胞靶向性；本發(fā)明公開的腺相關(guān)病毒包裝系統(tǒng)為研究溶瘤腺相關(guān)病毒奠定了基 礎(chǔ)，對生物治療腫瘤具有極大的促進(jìn)作用。
【附圖說明】
[0018] 圖1為pHKII-AAV-RC質(zhì)粒構(gòu)建過程圖；
[0019] 圖2為病毒滴度結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0020] 下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實施例中未注明具體 條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南（算三版，J.薩姆布魯克等 著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0021] 實施例1構(gòu)建hTERT啟動子調(diào)控的腺相關(guān)病毒輔助質(zhì)粒
[0022] 構(gòu)建含有端粒逆轉(zhuǎn)錄酶基因啟動子質(zhì)粒Adv-hTERT-Ep-Ela(具體方法參見張琪， 一種高效表達(dá)抗癌基因的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒及其用途，CN1219055C)。
[0023] 實施例2構(gòu)建HK-II啟動子調(diào)控的腺相關(guān)病毒包裝質(zhì)粒
[0024] 構(gòu)建含有HK-II啟動子質(zhì)粒pUC-HK-II (由上海生工合成，具體參見MathupalaSP. Glucose catabolism in cancer cells. Isolation, sequence, and aetivity of the promoter for type II hexokinase[J]. BiolChem，1995,270:16918-16925)，用Hindlll單 酶切線性化，并回收pUC-HK-II質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，詳細(xì)步驟參見（TAKARA膠回收試劑盒）。
[0025] 將pAAV-RC質(zhì)粒（Stratagene公司）用限制性內(nèi)切酶Xmal和Xbal雙酶 切（TAKARA)，膠回收片段大小4253bp的片段。采用補(bǔ)平連接試劑盒，將pAAV-RC質(zhì)粒 的酶切回收片段，經(jīng)連接插入線性化的pUC-HK-II質(zhì)粒中，測序驗證（詳細(xì)步驟參見 TAKARA，BluntingKination Liagtion(BKL)Kit)，其構(gòu)建過程如圖 2 所示，構(gòu)建出質(zhì)粒 pUC-HK-11-AAV-RC，命名為 pHKII-AAV-RC。