一種大鼠Kif11基因干擾shRNA及其重組腺相關(guān)病毒和抗腫瘤應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種大鼠Kifll基因干擾ShRNA及其重 組腺相關(guān)病毒干擾載體和抗腫瘤應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] Kifll化inesin family member 11，又稱Eg5)是驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員之一，通常認(rèn) 為其在增殖組織細(xì)胞中高表達(dá)，定位于有絲分裂期的微管，是細(xì)胞分裂過(guò)程中染色體的定 位、中屯、體的分離W及雙極紡鍵體的形成和分離的關(guān)鍵分子。隨著Kifll抑制劑monastrol 的發(fā)現(xiàn)，能夠用于抗腫瘤的Kifll小分子抑制劑已經(jīng)成為國(guó)際上眾多制藥公司的研發(fā)熱 點(diǎn)。有研究顯示Kifll在非分裂的神經(jīng)細(xì)胞中也有表達(dá)，與調(diào)節(jié)神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)有關(guān)，但是 否發(fā)揮其他功能尚未明確。
[0003] RNA干擾（RNA interference，RNAi)是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、由雙鏈 RNA (double-stranded RNA，dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的一種生物學(xué)現(xiàn)象， 能特異干擾祀基因的表達(dá)。其作用機(jī)制是：核糖核酸酶HI家族的Dicer酶，與dsRNA結(jié)合， 將其剪切成21-2：3nt及3'端突出的siRNA，隨后siRNA與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex,RISC)結(jié)合，解旋成單鏈，活化的RISC受已成單鏈的siRNA引導(dǎo)，序列 特異性地結(jié)合到祀信使RNA (mRNA)上并將其切斷，引發(fā)祀mRNA的特異性分解，能特異性阻 斷祀基因的表達(dá)。
[0004] 目前人工實(shí)現(xiàn)RNAi的主要方法之一是直接將體外合成的siRNA序列導(dǎo)入細(xì)胞，主 要缺點(diǎn)在于轉(zhuǎn)染效率低，效果不穩(wěn)定，作用持續(xù)時(shí)間短。另一種是通過(guò)轉(zhuǎn)染載體持續(xù)穩(wěn)定表 達(dá)siRNA，主要優(yōu)點(diǎn)在于穩(wěn)定大量的表達(dá)短發(fā)夾RNA (shRNA)，shRNA末端在體內(nèi)被加工、處 理成約2化P的類SiRNA分子，SiRNA將啟動(dòng)RNAi因此可用于長(zhǎng)時(shí)間干擾祀基因的表達(dá)。常 用的載體包括腺相關(guān)病毒（adeno-associated vi;rus，AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒。與后兩 者相比，腺相關(guān)病毒AAV的突出優(yōu)勢(shì)在于安全性高，免疫原性低，宿主范圍廣，攜帶的轉(zhuǎn)染 基因能長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，體外和體內(nèi)均可應(yīng)用，具有多種血清型，能滿足針對(duì)不同組織的轉(zhuǎn)染 要求，具有廣闊的應(yīng)用范圍和前景。
[0005] 目前已經(jīng)有針對(duì)Kifll的小干擾RNA產(chǎn)品，例如圣克魯斯的生產(chǎn)的SiRNA、shRNA 質(zhì)粒和慢病毒顆粒，但是祀基因針對(duì)小鼠Kifll,病毒滴度也不高，每毫升含有IX 1〇6慢病 毒轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種大鼠Kifll基因干擾ShRNA及其重組腺相關(guān)病毒干擾 載體和抗腫瘤應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明是通過(guò)W下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)： 陽(yáng)00引本發(fā)明公開(kāi)了一種大鼠Kifll基因干擾shRNA, shRNA正義鏈的核巧酸序列如SEA I化NO. 1所示；shRNA反義鏈的核巧酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。 W09] 本發(fā)明還公開(kāi)了含有大鼠Kifll基因干擾shRNA序列的重組腺相關(guān)病毒 rAAV9-ZsGreen-aiRNA-Kif11。
[0010] 該重組腺相關(guān)病毒rAAV9-ZsGreen-化RNA-Kifll為9型重組腺相關(guān)病毒。
[0011] 本發(fā)明還公開(kāi)了重組腺相關(guān)病毒rAAV9-ZsGreen-化RNA-Kifll在制備抗腫瘤藥 物中的應(yīng)用。
[0012] 所述的藥物為抑制腫瘤細(xì)胞Kifll基因表達(dá)的藥物。
[0013] 進(jìn)一步地，所述的藥物為抗腎上腺嗜銘細(xì)胞瘤的藥物。
[0014] 所述的藥物為抑制腫瘤細(xì)胞增殖的藥物
[0015] 進(jìn)一步地，所述的藥物為抗黑色素瘤的藥物。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下有益的技術(shù)效果：
[0017] 本發(fā)明提供的大鼠Kifll基因干擾shRNA，其正義鏈和反義鏈的核巧酸序列如 沈化I化NO. 1和沈Q. I化NO. 2所示。大鼠Kifll基因干擾shRNA能夠起到抑制Kifll基因 表達(dá)的作用。
[001引本發(fā)明提供的含有大鼠Kifll基因干擾shRNA序列的重組腺相關(guān)病毒 rAAV9-ZsGreen-化RNA-Kifll，具有抑制Kifll基因表達(dá)及抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。本發(fā) 明制備的含有Kifll基因干擾shRNA的重組腺相關(guān)病毒滴度高，每毫升含有1 X 10"病毒轉(zhuǎn) 導(dǎo)顆粒，能顯著抑制腫瘤細(xì)胞Kifll基因表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖反應(yīng)，在腫瘤治療方面具 有應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為干擾質(zhì)粒rAAV9-ZsGreen-aiRNA-Kifll酶切鑒定結(jié)果圖；
[0020] 圖2為PCR檢測(cè)rAAV9-ZsGreen-化RNA-Kif 11重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染腎上腺嗜銘細(xì) 胞瘤PC12后Kifll mRNA相對(duì)表達(dá)量； 陽(yáng)02U 其中，（a)為 Kifll, (b)為內(nèi)參 0 -actin ;
[0022] 圖3為MIT法檢測(cè)rAAV9-ZsGreen-化RNA-Kif 11重組腺相關(guān)病毒對(duì)黑素瘤細(xì)胞增 殖的影響結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的進(jìn)行詳細(xì)的描述，所用試劑如無(wú)特殊說(shuō)明均購(gòu)自 Invintrogen，實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法按照常規(guī)條件，參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第=版，J.薩 姆布魯克等著）和試劑說(shuō)明書中所述的條件。
[0024] 1、祀向大鼠Kifll基因shRNA序列的獲得 陽(yáng)0巧]根據(jù)NCBI公開(kāi)的大鼠Kifll基因序列（Genbank:NM_001169112. 1)設(shè)計(jì)shRNA序 列，具體設(shè)計(jì)參考美國(guó)Invintrogen公司網(wǎng)站（其網(wǎng)址ht1:p://;rnaidesigne;r. invitrogen. com/;rnaiexpress/so;rt. do)提供的 RNAi 在線設(shè)計(jì)軟件。
[0026]祀基因序列 5' -GTGCTGCAAGGATCGATTGAT-3'（SEQ. ID. NO. 3);
[0027] shRNA序列由Invinrogen公司合成，具體如下（下劃線字體為BamH I、Hindlll 酶切位點(diǎn)）：
[0037] 2、將干擾序列導(dǎo)入rAAV9-ZsGreen-shaiRNA質(zhì)粒載體
[0038] 將上述干擾序列在95°C條件下解鏈4分鐘，75°C條件下退火10分鐘，將單鏈序列 退火形成帶粘性末端的雙鏈序列。質(zhì)粒載體rAAV9-ZsGreen-shRNA(百恩維生物科技有限 公司）用限制性內(nèi)切酶BamHI+HindIII雙酶切。DNA連接酶進(jìn)行連接，22°C水浴反應(yīng)過(guò) 夜。連接體系見(jiàn)表1。
[0039] 表1質(zhì)粒載體連接反應(yīng)體系
[0040]
[0041] 3、rAAV9-ZsGreen-aiRNA-Kif11 干擾質(zhì)粒載體酶切鑒定
[0042] 轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，然后涂于Ampicillin抗性的LB平板上，倒置， 37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。挑取若干單克隆菌落，接種于Ampicillin抗性的培養(yǎng)液中， 37°C恒溫?fù)u床培養(yǎng)過(guò)夜，然后用小量質(zhì)粒提取試劑盒小提質(zhì)粒（具體步驟按試劑盒說(shuō)明操 作）。rAAV9-ZsGreen-化RNA-rEG5陽(yáng)性克隆可酶切得到90化P的條帶。如圖1所示，1為 DNA Marker,從上到下 SOOObp, 3000bp, 2000bp, lOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, lOObp。2-3 為 陽(yáng)性克隆。
[0043] 4、干擾載體rAAV9-ZsGreen-化RNA-Kifll重組9型腺相關(guān)病毒包裝 W44] 1)轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒到細(xì)胞
[0045] 常規(guī)復(fù)蘇和膜酶消化肥K293細(xì)胞，完全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至2X lOVml，37°C培養(yǎng) 箱中解育24h。轉(zhuǎn)染按試劑盒說(shuō)明書操作，在420 y L滅菌水中加入包裝質(zhì)粒及含目的基 因的質(zhì)粒DM共30 iil，再加入50 yL buffer B，使S者總體積達(dá)到500 iil。再將等體 積buffer A溶液逐滴加入，混勻后靜置2min后，將1ml混合液逐滴加入上述單層細(xì)胞的 細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕搖混勻。37°C培養(yǎng)箱中解育4-化后換液繼續(xù)培養(yǎng)。次日早上更換新鮮 完全培養(yǎng)基（含1%雙抗）。換液48小時(shí)后，用吸管將細(xì)胞從培養(yǎng)皿中吹下來(lái)收集到離 屯、管中，置于-80°C和37°C水浴鍋中反復(fù)凍融S次，300化pm離屯、lOmin，收集上清，濃縮； rAAV9-ZsGreen-aiRNA-Kifll第一代毒種（P1)可于-80°C長(zhǎng)期保存。2ml P1代病毒感染一 個(gè)75cm的細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞，可用于病毒擴(kuò)增。
[0046] 2)巧光定量PCR測(cè)定病毒滴度
[0047] 構(gòu)建的重組腺相關(guān)病毒載體中含有hGH polyA(184