一種靶向沉寂cdk2基因的重組腺相關(guān)病毒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種靶向沉寂⑶K2基因 的重組腺相關(guān)病毒。 技術(shù)背景
[0002] 肝癌由于發(fā)病率高、治療困難、死亡率高等特點(diǎn)在我國(guó)惡性腫瘤疾病中居第二位 死因，每年死于肝癌的人數(shù)占全世界肝癌年死亡總數(shù)的53 %，其發(fā)病機(jī)制至今仍不明了，治 療方法主要包括放化療、手術(shù)及肝移植，然而，80%以上的肝癌患者病情已到晚期，無(wú)法應(yīng) 用上述治療方法，即使能夠?qū)嵤┦中g(shù)切除，術(shù)后的復(fù)發(fā)率也比較高，而且術(shù)后的長(zhǎng)期預(yù)后不 能令人滿意，因此尚需盡快找到有效的早期診斷方法和治療靶點(diǎn)。
[0003] 研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的失控性增殖是惡性腫瘤細(xì)胞侵襲性生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的最基本特征，而 其根本原因就是細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的破壞，已發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)的分子主要 有細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependentkinase，Q)Ks)、細(xì)胞周期蛋白（Cyclin) 以及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（cyclin-dependentkinaseinhibitor，CKI)三大 類(lèi)。CDK2是細(xì)胞周期過(guò)程關(guān)鍵的限速因子，在整個(gè)細(xì)胞周期中表達(dá)水平保持不變，如果單 獨(dú)存在是沒(méi)有活性的，只有在不同的細(xì)胞周期進(jìn)程中，與相應(yīng)的Cyclin結(jié)合后才會(huì)呈現(xiàn)出 蛋白激酶的活性，磷酸化不同的底物，從而啟動(dòng)或調(diào)控細(xì)胞周期的主要事件，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期 進(jìn)程。在細(xì)胞周期中主要有兩個(gè)檢查點(diǎn)：G1/S期和G2/M期，這些檢查點(diǎn)對(duì)細(xì)胞周期起著 監(jiān)控作用，其中，G1/S檢查點(diǎn)是細(xì)胞周期中的主要限制點(diǎn)（restrictionpoint)，而CDK2/ CyclinE復(fù)合物在此過(guò)程中起關(guān)鍵性作用。CyclinE是⑶K2的調(diào)節(jié)亞基，調(diào)節(jié)著⑶K2的 活性，當(dāng)細(xì)胞由Gl期進(jìn)入S期，首先⑶K2會(huì)與CyclinE結(jié)合成復(fù)合物，激活⑶K2,使視 網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因（retinoblastoma，Rb)磷酸化，高磷酸化后的Rb會(huì)完全釋放出游離的 轉(zhuǎn)錄因子E2F，啟動(dòng)DNA的合成，加速細(xì)胞從Gl期進(jìn)入S期。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入S期后，⑶K2/ CyclinE復(fù)合體降解，⑶K2轉(zhuǎn)而與CyclinA結(jié)合成新的復(fù)合體，從而推進(jìn)細(xì)胞周期由S期 越過(guò)限制點(diǎn)進(jìn)入G2期；因此CDK2活性增高，可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，是細(xì)胞周期的正 調(diào)節(jié)因子，可通過(guò)抑制相應(yīng)的CDK或CDK/Cyclin復(fù)合物的活性，阻止細(xì)胞周期進(jìn)程（詳見(jiàn) 文南犬：[1]KusumotoK.Structuralfeaturesofglutamate-basedlipidicmaterials forsmallinterferingRNAdeliverysystem[J].JBiomedMaterResA,2009,89(3)： 739-750 ； [2]YangX，ZuX，TangJ，etal.Zbtb7suppressestheexpressionofCDK2 andE2F4inlivercancercellsimplicationsfortheroleofZbtb7incellcycle regulation[J].MolMedReport，2012,5 (6) :1475_1480)〇
[0004] 大量研究表明腫瘤的發(fā)生與CDK2和其它細(xì)胞周期相關(guān)因子的異常表達(dá)有關(guān)， CDK2基因表達(dá)異常，會(huì)引起細(xì)胞周期紊亂、細(xì)胞增殖失控，最終導(dǎo)致癌癥。張桂東等研究證 實(shí)，CDK2蛋白的異常表達(dá)會(huì)引起早期胃癌的發(fā)生，為臨床上胃癌早期診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 此外還發(fā)現(xiàn)肺癌、結(jié)直腸癌、鼻咽癌等腫瘤細(xì)胞中CDK2都呈高表達(dá)狀態(tài)。新近研究發(fā)現(xiàn)， 靶向⑶K2的shRNA能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖，因此，通過(guò)⑶K2基因的深入研究，不僅有助 于揭示腫瘤的發(fā)生機(jī)理，還能為腫瘤的預(yù)防和治療提供新的思路和手段，由此將CDK2作為 腫瘤治療祀點(diǎn)是一種可行的方法（詳見(jiàn)文獻(xiàn)：[3]KusumotoK.Structuralfeaturesof glutamate-basedlipidicmaterialsforsmallinterferingRNAdeliverysystem[J]. JBiomedMaterResA,2009,89(3) :739-750 ； [4]YangX,ZuX,TangJ,etal.Zbtb7 suppressestheexpressionofCDK2andE2F4inlivercancercellsimplications fortheroleofZbtb7incellcycleregulation[J].MolMedReport，2012,5(6)： 1475-1480 ； [5]GaoJJ，F(xiàn)engXB，YoshinoriI，etal.Des-y-carboxyprothrombinand c-Metwereconcurrentlyandextensivelyexpressedinhepatocellularcarcinoma andassociatedwithtumorrecurrence[J].BiosciTrends，2012,6 (4) :153-159; [6]JangKY，NohSJ，LehwaldN，etal.SIRTlandc_Mycpromotelivertumorcell survivalandpredictpoorsurvivalofhumanhepatocellularcarcinomas[J].PLOS 0ne，2012,7(9) :e45119)。
[0005] 基因治療是通過(guò)一定的載體，將外源基因?qū)氚屑?xì)胞，并可有效的進(jìn)行表達(dá)，達(dá)到 治療疾病的目的。腺相關(guān)病毒（AAV)因其可以長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白以及高度的安全性得 到了越來(lái)越多的關(guān)注。作為基因治療載體AAV有如下優(yōu)點(diǎn)=(I)AAV感染范圍比較廣，能感 染分裂期細(xì)胞和非分裂期細(xì)胞；（2)AAV引起的免疫反應(yīng)低，致病性低；(3)定點(diǎn)整合，避免 了隨機(jī)整合導(dǎo)致的宿主細(xì)胞發(fā)生突變的危險(xiǎn)性；(4)攜帶的外源基因可持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)；（5) AAV理化性質(zhì)穩(wěn)定，抗酸堿性和熱穩(wěn)定性好，便于保存?；谶@些特性，使AAV成為基因轉(zhuǎn)移 最為理想的載體之一。
[0006] 8型腺相關(guān)病毒（AAV8)屬于"雜合"載體，將AAV8的cap基因與攜帶r印基因、 ITR結(jié)構(gòu)的AAV2組合可得到重組AAV2/8,簡(jiǎn)稱rAAV8。AAV8對(duì)肝臟的轉(zhuǎn)染效率較其它血 清型高出10~100倍，因其在肝臟組織顯示了高效穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)染而備受關(guān)注。重組 AAV8(rAAV8)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于腫瘤、遺傳性疾病、自身免疫性疾病以及抗病毒的基因治療 研究中。Nakai等研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)小鼠尾靜脈注射給藥，rAAV8在體內(nèi)的轉(zhuǎn)染率及表達(dá)水平 和給藥量成線性關(guān)系，轉(zhuǎn)染效果可以達(dá)到100%，并且可持續(xù)至少1年以上的時(shí)間（詳見(jiàn) 文南犬：[7]NakaiH，F(xiàn)uessS，StormTA，etal.Unrestrictedhepatocytetransduction withadeno-associatedvirusserotype8vectorsinmice[J].JVirol，2005,79(I)： 214-224 ； [8]SarkarR，TetreaultR，GaoG，etal.Totalcorrectionofhemophilia AmicewithcanineFVIIIusinganAAV8serotype[J].Blood,2004,103 (4)： 1253-1260 ； [9]Lvfeta.Adeno-associatedvirus-mediatedanti-DR5chimericantibody expressionsuppresseshumantumorgrowthinnudemice[J] ?Cancerlett，2011，302 : 119-127 ； [10]SimonelliF，MaguireAM,TestaF，etal.GenetherapyforLeber's congenitalamaurosisissafeandeffectivethroughI. 5yearsaftervector administration[J] ?MolTher，2010,18 (3) :643-650)。但是，關(guān)于針對(duì)CDK2 基因的重組腺 相關(guān)病毒用于體內(nèi)靶向治療肝癌的應(yīng)用目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種靶向沉寂⑶K2基因的重組腺相關(guān)病毒。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種靶向沉寂⑶K2基因的重組腺相 關(guān)病毒是由下列方法構(gòu)建得到的：
[0009] a根據(jù)人肝癌細(xì)胞⑶K2基因序列，設(shè)計(jì)針對(duì)⑶K2特異性的SiRNA序列，構(gòu)建重組 質(zhì)粒pAKD-shRNA-CDK2,利用菌落PCR技術(shù)進(jìn)行DNA測(cè)序分析；
[0010] b將重組質(zhì)粒pAKD-shRNA-CDK2、包裝質(zhì)粒PAAV-RC和輔助質(zhì)粒pHelper用磷酸鈣 法共轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞，收獲重組腺相關(guān)病毒rAAV-shRNA-⑶K2,采用定量PCR方法對(duì)病毒 進(jìn)行滴度測(cè)定。
[0011] 所述的步驟a中針對(duì)CDK2特異性siRNA序列為：GACCCTAACAAGCGGATTTCG。
[0012] 所述的步驟a中在選定的靶點(diǎn)序列基礎(chǔ)上添加KpnI (-GTAC-)和BgI II (-GATC-) 內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)序列與轉(zhuǎn)錄終止序列，合成完整的shDNA序列：
[0013] shDNA-1-GATCCCCCGACCCTAACAAGCGGATTTCGCTCGAGCGAAATCCGCTTGTTAGGGTCTTTTT TTGTAC-
[0014] shDNA-2-AAAAAAAGACCCTAACAAGCGGATTTCGCTCGAGCGAAATCCGCTTGTTAGGGTCGGGG-
[0015] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0016] 1.本發(fā)明構(gòu)建了一種靶向沉寂⑶K2基因的重組腺相關(guān)病毒rAAV-shRNA-⑶K2,采 用可以長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白以及高度的生物安全性的8型腺相關(guān)病毒（AAV8)為轉(zhuǎn)導(dǎo)載 體，利用AAV8對(duì)肝細(xì)胞的高度親嗜性感染肝癌細(xì)胞，使其在體內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，從而起到 沉寂⑶K2基因、抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。
[0017] 2.通過(guò)建立人肝癌IfepG2細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)重組腺相關(guān)病毒 rAAV-shRNA-CDK2具有抑制肝癌細(xì)胞增值的作用，建立了一種有效治療肝癌的手段和方法。
【附圖說(shuō)明】
[0018]附圖1是質(zhì)粒載體pAKD-CMV/bGlobin-eGFP-Hl-shRNA。
[0019] 附圖2是質(zhì)粒載體的酶切鑒定結(jié)果：1.質(zhì)粒載體；2.DNA Marker。
[0020] 附圖3是菌落PCR鑒定結(jié)果：N為陰性對(duì)照組，M為Marker DL2000,第1-10泳道 為轉(zhuǎn)化子樣本。
[0021] 附圖4是DNA全序列測(cè)序報(bào)告：寡核苷酸片段位于測(cè)序圖中177位至241位（65 個(gè)堿基）。
[0022] 附圖5是測(cè)序比對(duì)報(bào)