一種用于長牡蠣親子鑒定的微衛(wèi)星多重pcr方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)動(dòng)物親子鑒定的方法，具體涉及了一種采用微衛(wèi)星多重PCR 方法進(jìn)行長牡蠣親子鑒定的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 微衛(wèi)星標(biāo)記方法具有多態(tài)性豐富、高度雜合、穩(wěn)定性好、遵循孟德爾分離定律、共 顯性遺傳、易于PCR擴(kuò)增等特點(diǎn)，是當(dāng)今最流行的分子標(biāo)記之一。在親子鑒定中，相比于SNP 標(biāo)記，使用微衛(wèi)星標(biāo)記所需位點(diǎn)數(shù)少，但相對(duì)鑒定力可達(dá)5倍以上;微衛(wèi)星標(biāo)記方法不需特 殊儀器，具有操作便捷、易于檢測、省時(shí)高效以及準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)。
[0003] 利用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行親子鑒定，傳統(tǒng)的分析方法是將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在變性或者非 變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳上進(jìn)行分型，利用銀染的方式對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行顯色，進(jìn)而獲得 所需要的目的條帶。這種方法存在許多不足之處，如判讀誤差較大、分辨率不高、操作無法 自動(dòng)化及存在有害物質(zhì)、處理通量低等問題，不適合于大量樣本的分析，也滿足不了親子鑒 定對(duì)基因型分型的精度要求。
[0004] 微衛(wèi)星多重PCR方法是指在同一反應(yīng)體系里加入多對(duì)引物，同時(shí)進(jìn)行多個(gè)擴(kuò)增反 應(yīng)，得到多個(gè)產(chǎn)物，因而具有提高反應(yīng)效率，避免樣品浪費(fèi)，節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本等優(yōu)點(diǎn)。微衛(wèi)星多 重PCR在大黃魚（Pseudosciaena crocea)，大菱鮮（Scophthalmus maximus)，斑節(jié)對(duì)奸 (Penaeus monodon)，以及!ti下夷扇貝（Patinopecten yessoensis)、皺紋盤鮑（Haliotis di scus hannai)等的親權(quán)分析及系譜認(rèn)證中均有應(yīng)用。
[0005] 長牡蠣(Crassostrea gigas)是世界上養(yǎng)殖范圍最廣、產(chǎn)量最大的經(jīng)濟(jì)貝類，素有 "海中牛奶"之美譽(yù)，深受消費(fèi)者青睞。為了確保食品安全和增強(qiáng)消費(fèi)者對(duì)養(yǎng)殖牡蠣產(chǎn)品的 信賴，建立牡蠣產(chǎn)品的跟蹤與溯源技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)從苗種到餐桌的全程質(zhì)量控制至關(guān)重要。長 期以來，養(yǎng)殖水產(chǎn)品大都采用物理方法進(jìn)行標(biāo)記，但是物理標(biāo)記容易丟失和改變，可靠性較 低。使用DNA標(biāo)記進(jìn)行跟蹤具有標(biāo)記穩(wěn)定、可靠，且易于檢測的優(yōu)勢。
[0006] 因此，開發(fā)精確的適用于長牡蠣親子鑒定的微衛(wèi)星多重PCR技術(shù)體系對(duì)于開展養(yǎng) 殖牡蠣產(chǎn)品的DNA鑒定具有重要意義。此外，牡蠣親子鑒定技術(shù)在牡蠣種質(zhì)資源保護(hù)、優(yōu)良 品種選育等方面也具有重要的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種高通量、鑒定準(zhǔn)確率高的長牡蠣親子鑒 定的多重PCR方法，該方法采用加尾引物，能夠快速、準(zhǔn)確的對(duì)未知親緣關(guān)系的長牡蠣親本 與子代間進(jìn)行親子鑒定，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0008] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取的具體技術(shù)方案如下：
[0009] -種用于長牡蠣親子鑒定的微衛(wèi)星多重PCR方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0010] (1)提取長牡蠣親本和子代個(gè)體的DNA，其中長牡蠣子代選取的是D形幼蟲，這是由 于在海洋貝類中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)偏分離的微衛(wèi)星等位基因，因此利用幼蟲進(jìn)行家系分析可以 減少或排除偏分離位點(diǎn)的影響；
[0011] (2)長牡蠣多態(tài)性微衛(wèi)星引物的篩選:根據(jù)引物篩選軟件以及現(xiàn)有文獻(xiàn)記載的長 牡蠣引物序列，合成引物，并通過對(duì)長牡蠣個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出擴(kuò)增穩(wěn)定、特異性強(qiáng)的 引物，所述引物包括正向引物、反向引物以及通用引物，所述通用引物上帶有熒光標(biāo)記；
[0012] (3)對(duì)步驟（1)得到的長牡蠣親本和子代個(gè)體的DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增:對(duì)步驟(2) 中篩選得到的引物首先兩兩組合，選出擴(kuò)增清晰的組合再進(jìn)行3個(gè)位點(diǎn)的多重PCR體系的構(gòu) 建;然后優(yōu)化退火溫度、引物濃度和反應(yīng)體系，最終將18個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)組成了 6組最佳多重 PCR體系，這使微衛(wèi)星標(biāo)記基因分型的工作量降低了 2/3,節(jié)省了大量的時(shí)間、人力和物力；
[0013] (4)獲得長牡蠣親本和子代的基因型數(shù)據(jù):對(duì)步驟(3)得到的多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn) 行熒光信號(hào)檢測，從而獲得親本和子代的基因型數(shù)據(jù)；
[0014] (5)通過基因序列分析軟件對(duì)上述得到的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析對(duì)比，從而對(duì)長牡 蠣親本和子代進(jìn)行親緣關(guān)系鑒定。
[0015]上述步驟⑵中篩選得到的引物序列如下：
[0016]
[0018] 該引物序列包括18種正、反向引物以及1種帶有熒光標(biāo)記的通用引物序列。
[0019]所述正向引物的5'端添加 M13(-21)通用引物序列，熒光標(biāo)記添加在單獨(dú)合成的 M13(-21)通用引物序列的5'端，所述熒光標(biāo)記為FAM、VIC、NED其中的一種;本發(fā)明使用了加 尾引物，相比于直接在正向引物5'端添加熒光標(biāo)記，本發(fā)明不僅大大降低了在每個(gè)位點(diǎn)添 加熒光標(biāo)記的昂貴費(fèi)用，同時(shí)也避免了只進(jìn)行了 10~30個(gè)反應(yīng)的帶熒光標(biāo)記的正向引物的 浪費(fèi)。
[0020] 根據(jù)步驟(2)中得到的引物序列，步驟(3)中所述的6個(gè)多重PCR組合如下：
[0021]
[0022]上述步驟（3)中的多重PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序分為兩步：前35個(gè)循環(huán)使用50°C~60 °C，的退火溫度，后8個(gè)循環(huán)使用53°C的退火溫度;優(yōu)選的，前35個(gè)循環(huán)6組中退火溫度為58 °C、50〇C、54〇C。
[0023] 上述步驟(4)中熒光信號(hào)檢測采用毛細(xì)管熒光電泳方法，毛細(xì)管電泳采用熒光標(biāo) 記的方式對(duì)位點(diǎn)進(jìn)行區(qū)分，不同的熒光染料在被激光激發(fā)后，會(huì)釋放出不同波長的熒光信 號(hào)，利用虛擬濾鏡技術(shù)，可使得不同熒光獲得區(qū)分，在同一根毛細(xì)管中可以同時(shí)混合多個(gè)位 點(diǎn)，大大增加了處理通量。
[0024] 所述的基因序列分析軟件為Genemapper ν4·0和Cervus 3.0。
[0025] 本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果如下：
[0026] 本發(fā)明利用多重PCR的方法，使用熒光標(biāo)記通用引物，結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)，可以 提高分析精度和實(shí)驗(yàn)效率。經(jīng)過已知遺傳背景的家系實(shí)際驗(yàn)證，使用本發(fā)明2組多重PCR組 合對(duì)12個(gè)長牡蠣全同胞家系進(jìn)行親子鑒定，即可達(dá)到100%的鑒定成功率。
[0027]為保證養(yǎng)殖牡蠣產(chǎn)品的食品安全，進(jìn)行牡蠣產(chǎn)品溯源具有重要意義。傳統(tǒng)的物理 標(biāo)記容易改變或者丟失，缺乏足夠高的可信度和準(zhǔn)確度。本發(fā)明的方法是基于DNA微衛(wèi)星標(biāo) 記的長牡蠣親子鑒定技術(shù)，采用親本重建法對(duì)養(yǎng)殖個(gè)體進(jìn)行家系分析，可以將長牡蠣個(gè)體 成功追溯到其產(chǎn)出地，為確保其食品安全、建立消費(fèi)者的信賴提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。