用于預(yù)防和治療癌癥的msi-特異性移碼肽(fsp)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防和治療以微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI)為特征的癌癥的疫 苗。該疫苗包含一種MSI-特異性移碼肽（FSP)或編碼所述FSP的核酸，所述FSP產(chǎn)生針對 腫瘤細胞的體液應(yīng)答或細胞應(yīng)答。
【背景技術(shù)】
[0002] 人類腫瘤通過兩種主要的基因組不穩(wěn)定性的路徑形成：染色體不穩(wěn)定性和由于 DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)的缺陷導(dǎo)致的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI)。15%的結(jié)直腸癌和各種顯示有缺 陷的DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)的腸外惡性腫瘤，包括子宮內(nèi)膜癌、胃癌、小腸癌和其他器官的腫瘤 都呈現(xiàn) MSI。MSI癌癥可偶發(fā)地形成或出現(xiàn)在遺傳性腫瘤綜合征、遺傳性非息肉病性結(jié)直腸 癌（HNPCC)或Lynch綜合征中。
[0003] MSI結(jié)直腸腫瘤的特征是高免疫原性，其源自當基因編碼區(qū)的微衛(wèi)星受到突變影 響時，作為導(dǎo)致翻譯閱讀框改變的錯配修復(fù)缺陷的直接結(jié)果，在MSI腫瘤的形成過程中產(chǎn) 生了許多移碼肽（FSP)(圖1)。
[0004] 大量可預(yù)見的MSI-特異性FSP抗原以及它們直接來自惡性轉(zhuǎn)化過程的事實使FSP 成為免疫治療極具潛力的靶標。人們相信人類免疫系統(tǒng)是一種潛在的可以消除腫瘤細胞的 資源，并且如果適當刺激免疫系統(tǒng)的組件來識別并清除癌細胞，則可以形成有效的治療。因 此，免疫療法，其包括直接或間接地激活人體的免疫系統(tǒng)的組成物和方法以縮小或消除癌 癥，已經(jīng)作為傳統(tǒng)癌癥治療方法的輔助方法被研宄多年。
[0005] 人們普遍承認腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移主要取決于它們逃避宿主免疫系統(tǒng)的能力。大多 數(shù)腫瘤表達在不同程度上能被宿主免疫系統(tǒng)識別的抗原，但在許多情況下，免疫應(yīng)答是不 充分的。腫瘤抗原的弱免疫原性或腫瘤細胞共刺激分子的不恰當表達或者表達缺失可導(dǎo)致 不能夠引發(fā)效應(yīng)T-細胞的強烈活化。對于大多數(shù)的T-細胞，白細胞介素（IL)-2的生產(chǎn)和 增殖需要一個T細胞抗原受體（TCR)同時參與的共同刺激信號，否則，T細胞會進入一個被 稱作克隆無能的功能無反應(yīng)狀態(tài)。
[0006] 盡管研宄這些治療方法很長時間，但仍需要改進方案以增強針對腫瘤抗原的免疫 應(yīng)答。
[0007] 然而，在本領(lǐng)域存在能夠刺激免疫系統(tǒng)成為腫瘤免疫療法的安全且有效的組合的 需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 根據(jù)本發(fā)明，作為腫瘤免疫療法的免疫系統(tǒng)的安全且有效的刺激物通過在權(quán)利 要求書中限定的主題而實現(xiàn)。體外數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)SP具有高免疫原性，在體外能誘發(fā)顯著的 FSP-特異性 T 細胞應(yīng)答（Linnebacher 等，2001，Ripberger 等，2003, Schwitalle 等，2004)。 對采自MSI結(jié)腸癌患者的外周血的進一步研宄證明FSP-特異性T細胞應(yīng)答頻率較高。盡 管腫瘤和外周血中有大量的FSP-特異性T細胞，患者并沒有任何自身免疫體征，這暗示FSP 疫苗接種途徑在自身免疫方面預(yù)期不會產(chǎn)生副作用。
[0009] 對于攜帶易患遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌（HNPCC)的DNA錯配修復(fù)基因的種系突變 的個體的免疫分析，也被發(fā)現(xiàn)具有針對FSP的細胞免疫應(yīng)答，即使未出現(xiàn)臨床可檢測到的 腫瘤。這暗示FSP-特異性免疫應(yīng)答對于HNPCC個體可具有保護作用，表明FSP疫苗接種也 可作為非遺傳性癌癥的第一個特異性預(yù)防途徑用于預(yù)防性設(shè)置（setting)中。
[0010] 簡要地說：
[0011] (a)移碼肽（FSP)是MSI-特異性的且由MSI腫瘤發(fā)病機制直接導(dǎo)致；
[0012] (b)預(yù)計沒有臨床相關(guān)副作用；
[0013] (c)FSP的組合被預(yù)計靶向全部具有MSI的腫瘤；
[0014] (d)FSP疫苗接種已被設(shè)計成治療15%的結(jié)腸癌和子宮內(nèi)膜腫瘤、胃腫瘤、小腸腫 瘤和其他器官腫瘤；
[0015] (e)分子腫瘤分析能夠確定可受益于FSP疫苗接種（靶向治療）的患者；以及
[0016] (f)FSP疫苗接種可被用作高危群體的預(yù)防性疫苗接種。
【附圖說明】
[0017] 圖1為DNA錯配修復(fù)缺陷導(dǎo)致的編碼微衛(wèi)星不穩(wěn)宙件的示意件說明（Kloor等， 2010)
[0018] 當編碼微衛(wèi)星突變導(dǎo)致翻譯閱讀框改變時產(chǎn)生包括FSP序列的截短蛋白（紅色）
[0019] (例如：TGFBR2 蛋白）。
[0020] 圖2為針對新設(shè)計的在來自三個MSI結(jié)腸癌患者的外周血中的FSP的示例件T細 朐應(yīng)答。
[0021] S 3 ^#ΜΑλΑΙΜ2(-1).HT001 (-1).TAFlB (-1) TGFBR2 (~1) 免痔應(yīng)答。
[0022] 酶聯(lián)免疫吸附試驗實驗（ELISA)揭示針對來自ΑΜ2(-1)、ΗΤ001 (-1)、TAFlB (-1) 和TGFBR2(-1)的新肽（neop印tide)的FSP-特異性抗體應(yīng)答。如先前所述通過預(yù)吸收各 自的血清抗體證明了肽的特異性（Reuschenbach等，2008)。
[0023] 圖4為通i寸CD107a表而表汰確宙的細朐毒件應(yīng)答。
[0024] ㈧在用抗原刺激T細胞四個星期后，在不同健康個體中觀察到顯著的FSP-特異 性應(yīng)答。應(yīng)答只發(fā)生在存在抗原提呈B細胞和FSP抗原的情況下。代表性應(yīng)答如條形圖所 不O
[0025] (B)在不存在（左面板）或存在（右面板）FSP抗原HT001 (-1)的情況下，對于接 種作為抗原提呈細胞的B細胞的T細胞的CD107a測試的代表性FACS (熒光激活細胞分選 儀）分析。
【具體實施方式】
[0026] 因此，本發(fā)明提供了一種包含MSI腫瘤特異性移碼肽（FSP)或編碼所述FSP的核 酸的疫苗，該移碼肽例如源自TAFlB (登記號L39061)、HT001 (登記號AFl 13539)、AM2 (登 記號AF024714)、或TGFBR2 (登記號NM_ 003242)，其中FSP能誘發(fā)針對呈現(xiàn)MSI的癌癥的 免疫應(yīng)答。
[0027] 在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的疫苗包含
[0028] (a)包含以下氨基酸序列的FSP或者由以下氨基酸序列構(gòu)成的FSP :
[0029] NTQIKALNRGLKKKTILKKAGIGMCVKVSSIFFINKQP (TAF1B (~1))；
[0030] EIFLPKGRSNSKKKGRRNRIPAVLRTEGEPLHTPSVGMRETTGLGC(ΗΤ001(~1))；
[0031] HSTIKVIKAKKKHREVKRTNSSQLV(AIM2(-1))；
[0032] 或
[0033] ASPKCIMKEKKSLVRLSSCVPVALMSAMTTSSSQKNITPAILTCC(TGFBR2(~1))：
[0034] (b) (b)的FSP的功能等同物；或
[0035] (c) (a)的 FSP 和 / 或（b)的 FSP 的組合。
[0036] 這里使用的術(shù)語"功能等同物"涉及例如FSP的變體或片段，其仍能誘發(fā)對抗腫瘤 的免疫應(yīng)答，即仍可以作為有效疫苗。免疫應(yīng)答被定義為滿足下列標準中的至少一個標準 的條件：1.誘導(dǎo)⑶8-陽性T細胞，如通過細胞毒性試驗或干擾素（IFN)-Y分泌或穿孔素 的表達或顆粒酶B表達或可由CD8-陽性T細胞產(chǎn)生的其他細胞因子可檢測到，其可通過酶 聯(lián)免疫斑點（ELISpot)或細胞內(nèi)細胞因子染色或細胞因子酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA)或 其他等效方法測量作為上述背景。2.誘導(dǎo)⑶4-陽性T細胞，其可通過由ELISpot或細胞 內(nèi)細胞因子染色或細胞因子ELISA或其他等效方法測量作為上述背景的細胞因子檢測到。 細胞因子可包括IFN-a、IFN-γ、白細胞介素（IL)-2、白細胞介素-4、白細胞介素-5、白細 胞介素-6、白細胞介素-10、白細胞介素-12、白細胞介素-13、白介素-17、腫瘤壞死因子 (TNF)-α、腫瘤壞死因子-β或其他可由CD4-陽性T細胞產(chǎn)生的細胞因子。3.誘導(dǎo)抗體， 其可以通過蛋白質(zhì)印跡、ELISA和其他等效或相關(guān)的方法檢測。4.誘導(dǎo)不被如在1和2中 所述的CD8-陽性T細胞或CD4-陽性T細胞介導(dǎo)的任何類型的細胞免疫應(yīng)答。
[0037] 變體的特征在于氨基酸缺失、替換、和/或添加。優(yōu)選地，氨基酸差異是由于一 個或多個保守氨基酸替換。術(shù)語"保守氨基酸替換"涉及脂肪族的或疏水性氨基酸丙氨酸 (Ala)、纈氨酸（Val)、亮氨酸（Leu)和異亮氨酸（lie)的替代；羥基殘基絲氨酸（Ser)和蘇 氨酸（Thr)的替換；酸性殘基天冬氨酸（Asp)和谷氨酸（Glu)的替換；酰胺殘基天冬酰胺 (Asn)和谷氨酰胺（Gln)的替換；堿性殘基賴氨酸（Lys)、精氨酸（Arg)和組氨酸（His)的 替換；芳香殘基苯丙氨酸（Phe)、酪氨酸（Tyr)和色氨酸（Trp)的替換；和小型氨基酸丙氨 酸（Ala)、絲氨酸（Ser)、蘇氨酸（Thr)、甲硫氨酸（Met)、和甘氨酸（Gly)的替換。
[0038] 為了生成對于FSP具有一定程度的同源性的多肽，例如可利用基因工程以在克隆 的DNA序列的特定位置處引入氨基酸變化，進而識別肽功能的關(guān)鍵區(qū)域。例如，可以使用定 點誘變或丙氨酸掃描誘變（在分子中的每個殘基處引入單一丙氨酸突變）（Cunningham和 Wells，1989年）。由此產(chǎn)生的突變分子可以使用實施例1的測試來測定免疫原性。
[0039] 優(yōu)選地，變體的特征在于不超過8個氨基酸（aa)，更優(yōu)選地不多于6個氨基酸，和 甚至更優(yōu)選地不多于4個氨基酸的替換、刪除和/或添加。
[0040] 在FSP片段中，特定的氨基酸序列的至少5個連續(xù)氨基酸、最好至少10個連續(xù)氨 基酸、更優(yōu)選至少連續(xù)15個氨基酸，甚至最好是至少20個連續(xù)氨基酸被剩留（left)。該片 段仍能引發(fā)免疫應(yīng)答。
[0041] 在更優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的疫苗另外包括佐劑和/或免疫刺激的細胞因子 和趨化因子。
[0042] 合適的佐劑包括鋁鹽，如氫氧化鋁凝膠（明礬）或磷酸鋁，但也可是鈣鹽、鐵鹽或 鋅鹽，或者可以是?；野彼峄蝓；?、陽離子化或陰離子化衍生多糖或聚磷腈的不溶懸 浮液。其他已知佐劑包括含胞嘧啶鳥嘌呤（CpG)的寡核苷酸。寡核苷酸的特征在于胞嘧啶 鳥嘌呤二核苷酸是非甲基化的。這種寡核苷酸是眾所周知的且例如在WO 96/02555中所 不O
[0043] 免疫刺激的細胞因子的使用已成為腫瘤免疫治療中越來越有前景的方法。主要目 標是激活腫瘤特異性T淋巴細胞，其能夠使腫瘤細胞遠離具有低腫瘤水平的患者，或防止 患者疾病復(fù)發(fā)。在抗原位點局部提供高水平的免疫刺激細胞因子的策略已經(jīng)證實了臨床 前療效和臨床療效。優(yōu)選的免疫刺激細胞因子包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、干擾素、粒細 胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF)和TNF-α。
[0044] 趨化因子是小型的（7_16kD)、分泌的和結(jié)構(gòu)上相關(guān)的可溶性蛋白，其涉及白細胞 和樹突狀細胞趨化性、多形核白細胞（PMN)脫顆粒和血管形成。趨化因子在宿主對損傷、過 敏原、抗原或入侵微生物應(yīng)答的初始階段期間產(chǎn)生。趨化因子有選擇性地吸引白細胞到炎 癥病灶，誘導(dǎo)細胞迀移和活化。趨化因子可增強先天的或特定的宿主抗腫瘤免疫性，因而也 可用于與FSP結(jié)合。
[0045] 本發(fā)明的疫苗還可包含編碼用于DNA免疫的FSP的核酸，DN