基于二代測序平臺的結(jié)腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種結(jié)腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測試劑盒，尤其是設(shè)及一種基于二代測 序平臺對結(jié)腸癌患者微衛(wèi)星不穩(wěn)定性進(jìn)行檢測的檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)直腸癌發(fā)病率在我國高居各類癌癥發(fā)病率的第3位，占癌癥死因的第5位， 其根治性切除后5年生存率為50%左右，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是其死亡的重要原因。早期 結(jié)腸癌患者通常可借手術(shù)切除，一旦轉(zhuǎn)移，其治療的方法并不多，患者五年生存率也不理 想。研究發(fā)現(xiàn)，基因組的不穩(wěn)定性與結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)，基因組的不穩(wěn)定性包 括染色體不穩(wěn)定性（C虹omosomalinst油ility，CI)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI)。
[0003] 微衛(wèi)星是指基因上含有重復(fù)的DM短小序列或單核巧酸區(qū)域。在腫瘤細(xì)胞中，當(dāng) DNA發(fā)生甲基化或基因突變致錯配修復(fù)基因缺失時，可導(dǎo)致微衛(wèi)星重復(fù)序列錯配（微衛(wèi)星 突變），導(dǎo)致其序列縮短或延長，從而引起微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatelliteinst油ility， MSI)。根據(jù)MSI不穩(wěn)定性的程度，可分為高不穩(wěn)定性（MSI-H)和低不穩(wěn)定性（MSI-L)，正常 情況下稱為微衛(wèi)星穩(wěn)定（microsatellitest油ility，MS巧。
[0004] 大量研究表明，MSI參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，與結(jié)腸癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌等 等發(fā)生密切相關(guān)。約15%的結(jié)直腸癌患者存在MSI現(xiàn)象，其中典型的遺傳性非息肉病性結(jié) 直腸癌化ereditary no噸olyposis colerectal cancer, HNPCC)患者90%W上為MSI瘤， 表明MSI可作為檢測是否為HNPCC患者的重要標(biāo)志物；與MSS(即微衛(wèi)星穩(wěn)定）的結(jié)腸癌相 比，攜帶有MSI的結(jié)直腸癌患者其預(yù)后更好，并且二者藥物反應(yīng)也不一樣，提示MSI可作為 結(jié)直腸癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子，因此，MSI檢測對結(jié)直腸癌患者意義重大。
[0005] 美國國家腫瘤研究所（化tionalCancerInstitute,NCI)曾經(jīng)通過一個針對腫 瘤的微衛(wèi)星不穩(wěn)定及復(fù)制錯誤表型檢測的國際專題會議制定了MSI檢測的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)（即 BethesdaGuidelines)，作為設(shè)及檢測MSI的參考Panel(即NCIPanel)，它包含2個單核 巧酸重復(fù)的位點度AT-25、BAT-26)和3個2核巧酸重復(fù)的位點值2S123、D5S346、D17S250)。 據(jù)此對腫瘤MSI狀態(tài)進(jìn)行檢測時，5個STR位點如果檢測出2個或2個W上的位點有MSI, 則為MSI-H，MSI-H腫瘤表現(xiàn)出特有的臨床及病理學(xué)表型；若只檢測出1個位點有MSI,則為 MSI-L無任何位點變化者為MSS。然而，MSI-L與MSS的腫瘤表型差異不大，要區(qū)別MSI-L 與MSS的腫瘤表型，需要選用更多位點來進(jìn)行檢測時才能實現(xiàn)。
[0006] 在2002年的第二次相關(guān)專題會議上，針對之前采納的檢測MSI的參考Panel來檢 巧。MSI出現(xiàn)了爭議，因為NCIPanel使用的3個2核巧酸重復(fù)的位點具有高多態(tài)性的特征， 在檢測時必須用與腫瘤組織相匹配的正常組織來作比較才能得出結(jié)果，使其在檢測存在錯 配修復(fù)缺陷的腫瘤時表現(xiàn)出較低的特異性和靈敏度。因此采用NCIPanel來檢測MSI存在 一定的局限性，大會建議增加單核巧酸重復(fù)位點來檢測MSIW提高檢測的靈敏度。
[0007] 2015年最新發(fā)布的藥物代謝酶和藥物作用祀點基因檢測技術(shù)指南（試行）中 明確規(guī)定，MSI的檢測可用于氣尿喀晚類藥物的輔助療效預(yù)測。近期研究發(fā)現(xiàn)，MSI-H較MSI-L和MSS的結(jié)腸癌患者在接受PD-1抗體〔即抑A批準(zhǔn)的兩種免疫檢查點抑制藥物 (Nivolumab(MDX1106)和化mbrolizum油））治療后具有更好的臨床反應(yīng)性，表明結(jié)直腸癌 患者的MSI水平可作為一個對PD-1/PD-L1抗體響應(yīng)的獨(dú)立預(yù)測因子來預(yù)測篩選從PD-1抗 體免疫治療獲益的結(jié)腸癌患者群體。對檢測結(jié)直腸癌患者的MSI水平，可用于免疫檢查點 抑制劑類藥物的輔助療效預(yù)測。
[0008] 因此，建立MSI檢測體系W尋找高度靈敏性及特異性的用來檢測MSI的相關(guān)位點 已成為近年來研究MSI檢測領(lǐng)域的熱點。
[0009] 現(xiàn)有檢測MSI的方法主要為：
[0010]1)免疫組化方法，該方法僅用于腫瘤細(xì)胞中的MLH1、Μ甜2、MS冊和PMS2蛋白結(jié)合， 如果沒有結(jié)合任何的蛋白，則證明發(fā)生了MSI;該方法的靈敏度雖然接近90%，但特異性和 可重復(fù)性較低，操作比較復(fù)雜；
[0011] 2)毛細(xì)管電泳法，該方法主要針對MSI相關(guān)的基因序列上簡單的重復(fù)結(jié)構(gòu)，通過 片段分析可W判斷重復(fù)堿基的重復(fù)數(shù)目，從而進(jìn)行MSI基因分型；該方法使用相對成熟，進(jìn) 樣量少、分辨率和自動化程度較高，然而由于進(jìn)樣量少，因而制備能力差；而毛細(xì)管直徑小 導(dǎo)致光路太短，用一些檢測方法（如紫外吸收光譜法）時，靈敏度較低；此外，電滲會因樣品 組成而變化，進(jìn)而影響分離重現(xiàn)性；
[0012] 3)PCR法，該方法通過選定特異的引物，W自身正常組織為對照，在體外對微衛(wèi)星 位點進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)聚丙締酷胺凝膠電泳，經(jīng)放射自顯影等分析有無遷移 率的改變；該方法是目前常用的檢測方法且已經(jīng)被證實為最有效的初篩手段，但PCR法只 檢測五個微衛(wèi)星基因，產(chǎn)物做凝膠電泳的方法，存在操作繁瑣、成本高等諸多缺陷；
[0013] 4)多重巧光PCR，該方法主要針對NCI建議的位點進(jìn)行擴(kuò)增，W確定MSI狀態(tài)；采 用該方法檢測微衛(wèi)星，其引物間的競爭與干擾因素較為復(fù)雜，擴(kuò)增產(chǎn)物不容易錯開，會直接 導(dǎo)致檢測結(jié)果的不確定性，因此該方法對引物特異性和引物濃度都有很高的要求；
[0014]W直接測序法，該方法針對MMR基因各區(qū)域（MLH1、Μ甜2、MS冊和PMS2等）的擴(kuò) 增產(chǎn)物進(jìn)行sanger法測序來確定其MSI狀態(tài)；該方法的檢測周期較長，成本相對較高。
[0015] 因此急需開發(fā)更多位點和更好靈敏度的MSI檢測系統(tǒng)勢W滿足市場和醫(yī)療的迫 切需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于二代測序平臺 的結(jié)腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測試劑盒，使用該試劑盒對結(jié)腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性進(jìn)行檢測， 檢測通量高，靈敏度強(qiáng)，特異性強(qiáng)，能夠一次性檢測所有位點。
[0017] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是，基于二代測序平臺的結(jié)腸癌微衛(wèi)星不 穩(wěn)定性檢測試劑盒，包括4. 5 - 6. 5μ1 (優(yōu)選5μ1)的引物panel溶液，所述引物panel溶 液中各溶質(zhì)的濃度均為45 - 55mmol/L(優(yōu)選50mmol/L)。
[001引所述引物panel包括10個微衛(wèi)星位點的引物，其正向引物與反向引物序列如下：
[0019]
[0020] 所述試劑盒中，還包括8 - 10μ1 (優(yōu)選9. 5μ1)的MasterMixW及1. 3 - 1. 7血（優(yōu)選1. 5血）無酶水；
[0021] 所述MasterMix包括 3 ~7μ1 (優(yōu)選 5μ1) 10禮ATaqBuffer和 3 ~5μ1 (優(yōu) 選 4μ]_) 2 ~4mmol/L的dNTPs，W及 0. 5 ~1μ1LATaqenzyme。
[0022] 所述基于二代測序平臺的結(jié)腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測試劑盒的多重PCR反應(yīng)條 件為：93°C~98°C預(yù)變性2~3min，然后進(jìn)入聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增階段：93°C~96°C變性 20~30s，55°C~65°C退火20~30s，70°C~75°C延伸20~45s;最后70°C~74°C延伸 lOmin，并進(jìn)行10~12個循環(huán)，4°C靜置。
[0023] 多重PCR過程同時進(jìn)行陰性對照實驗，所用對照樣本為正常人基因組DNA。
[0024] 所述的基于二代測序平臺的結(jié)腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測試劑盒的檢測基因包括 NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26、M0N0-27,D2S123,D5S346 和D17S250。
[00巧]二代測序反應(yīng)體系的組成為：DNA樣本多重PCR反應(yīng)、模板文庫構(gòu)建、上機(jī)模板準(zhǔn) 備和富集反應(yīng)、上機(jī)測序反應(yīng)和測試數(shù)據(jù)處理分析。
[0026] 本發(fā)明之基于Illumina公司的MiSeq二代測序平臺對結(jié)腸癌患者微衛(wèi)星不穩(wěn)定 性的檢測試劑盒的使用方法，包括進(jìn)行MSI相關(guān)的10個標(biāo)記基因的多重PCR反應(yīng)、模板文 庫構(gòu)建、上機(jī)測序W及基于測序結(jié)果對微衛(wèi)星狀態(tài)的結(jié)果判定。具體內(nèi)容如下：
[0027] (1)挑選MSI相關(guān)的10個標(biāo)記基因并進(jìn)行多重PCR反應(yīng)：
[0028] ①根據(jù)Besthesta guideline,調(diào)取敏感性和特異性最好的10個MSI標(biāo)記基因位 點序列（其中包括7個單核巧酸重復(fù)位點和3個雙核巧酸重復(fù)位點），見表1 :
[0029] 表1 10個微衛(wèi)星位點信息
[0030]
[0031] 表2微衛(wèi)星位點測序引物
[0032]
[0033] ②對運(yùn)10個MSI相關(guān)的基因位點通過設(shè)計引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)，所述的擴(kuò) 增引物見表2。
[0034] 似進(jìn)行文庫構(gòu)建和測序反應(yīng)
[0035] 模板文庫構(gòu)建過程包括DNA隨機(jī)打斷、末端補(bǔ)平修復(fù)及純化、末端連接測序接頭、 模板擴(kuò)增和純化、純化后富集，所述反應(yīng)體系中包含末端補(bǔ)平酶混合物20μ1、0. 4-1U連 接酶、0. 4-lU擴(kuò)增Taq酶、5-lOmM測序接頭A和Pl、5-10mM測序接頭A和PI通用引物、 10-15XBuffer和2-5XAmpure純化磁珠等試劑。
[0036] 上述測序反應(yīng)包括MiSeq測序反應(yīng)過程，其原理是采用可逆性末端邊合成邊測 序反應(yīng)，首先在DNA片段兩端加上序列已知的通用接頭構(gòu)建文庫，文庫加載到測序忍片 Flowcell上，文庫兩端的已知序列與Flowcell基底上的Oligo序列互補(bǔ)，每條文庫片段都 經(jīng)過橋式PCR擴(kuò)增形成一個簇，測序時采用邊合成邊測序反應(yīng)，即在堿基延伸過程中，每個 循環(huán)反應(yīng)只能延伸一個正確互補(bǔ)的堿基，根據(jù)四種不同的巧光信號確認(rèn)堿基種類，保證最 終的核酸序列質(zhì)量，經(jīng)過多個循環(huán)后，完整讀取核酸序列。上機(jī)反應(yīng)獲得的數(shù)據(jù)結(jié)果通過序 列篩選、拼接和比對等方法W及生物信息學(xué)分析，最終獲得測試樣本的SNP位點信息。
[0037] 本發(fā)明采用二代測序技術(shù)來檢測MSI基因位點，即，首先進(jìn)行MSI相關(guān)的10個標(biāo) 記基因的多重PCR反應(yīng)，接著構(gòu)建模板文庫、通過一系列上機(jī)模板準(zhǔn)備和富集反應(yīng)后獲得 測序文庫，然后基于Illumina公司的MiSeq二代測序平臺對含MSI相關(guān)標(biāo)記基因位點進(jìn)行 測序，能夠一次性獲得所有微衛(wèi)星位點的變異信息，檢測結(jié)果具有通量高，靈敏度強(qiáng)、特異 性好等優(yōu)點。運(yùn)種方法隨著試劑盒開發(fā)成功可W批量生產(chǎn)，使用條件可W模式化，全部過程 都有自動化設(shè)備。此外，用此試劑盒檢測結(jié)直腸癌患者的MSI水平后，還可應(yīng)用于篩選適合 PD-L1抗體治療的結(jié)直腸癌患者人群。
[0038] 本發(fā)明之基于Illumina公司的MiSeq二代測序平臺對國內(nèi)外發(fā)病率較高的結(jié) 腸癌患者的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性位點（包括NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26、 M0N0-27,D2S123,D5S346和D17S250)進(jìn)行檢測的試劑盒，該試劑盒能夠一次性檢測所有 MSI位點，其結(jié)果比5位點檢測更為準(zhǔn)確，特異性更好，人為干擾因素小，運(yùn)種方法隨著試劑 盒開發(fā)成功可W批量生產(chǎn)，使用條件可W模式化，全部過程都有自動化設(shè)備，能大大提高腫 瘤相關(guān)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的檢測水平。此外，用此試劑盒檢測結(jié)直腸癌患者的MSI水平后， 還可應(yīng)用于篩選適合PD-L1抗體治療的結(jié)直腸癌患者人群。
[0039