一種利用issr分子標記檢測花生種子純度的方法
【技術領域】
[0001]—種利用ISSR分子標記檢測花生種子純度的方法屬于花生種子純度鑒定技術領域，具體地說是利用ISSR分子標記檢測花生種子純度技術領域。
【背景技術】
[0002]花生是我國重要的油料作物和經(jīng)濟作物，我國年均種植花生7000多萬畝，年需要花生種子160萬噸，花生用種量大，不同品種間種子差異性較小，單純從植株和莢果等外部性狀很難區(qū)分品種間的差異，導致我國花生種子市場混亂，種子純度很低，很多種業(yè)公司甚至出現(xiàn)張冠李戴現(xiàn)象，一個品種的種子當成多個品種的種子來售賣。急需要一種方便快捷準確的花生種子純度鑒定方法。
[0003]簡單重復序列間擴增(ISSR)是一種在簡單重復序(SSR)基礎上發(fā)展起來的新型的分子標記。該技術以錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，在SSR序列的3’或5’端加錨2.4個隨機核苷酸，在PCR反應中，錨定引物可以引起特定位點退火，導致與錨定引物互補的間隔不太大的重復序列間DNA片斷進行PCR擴增。所擴增的Inter.SSR區(qū)域的多個條帶可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳或者瓊脂糖凝膠電泳得以分辨。它結合RAPD標記技術冪HSSR標記技術的優(yōu)點，能夠提供更多的基因組DNA信息?，F(xiàn)己廣泛應用于植物種質資源鑒定、進化與親緣關系分析、遺傳多樣性與居群遺傳結構檢測、遺傳作圖、基因定位、分子標記輔助育種等方面的研究。ISSR標記技術試驗操作簡單、快速、高效，不需要繁瑣的構建基因文庫、雜交和同位素顯示等步驟；重復序列和錨定堿基的選擇是隨機的，無需知道任何靶標序列的SSR背景信息，從而降低了技術難度和實驗成本；無需活材料，無組織器官特異性，能實現(xiàn)全基因組無編碼取樣:采用了較長的引物(17。24bp)，退火溫度較高，因此，引物具有更強的專一性，增強了實驗可重復性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]解決花生種子鑒定困難且不準確的難題，本發(fā)明利用ISSR分子標記鑒定花生純度。
[0005]本發(fā)明通過以下技術方案來實現(xiàn):
通過 4 條 ISSR 引物 WLS1:AGA GTT GGT AGC TCT TGA TC ；WLS2:CAT GGT GTT GGT CATTGT TCC A ；WLS3:AGA GAG AGA GAG AGA GYC 和 WLS4:AGA GAG AGA GAG AGA GCL 來鑒別花生種子的純度。鑒別種子純度的ISSR-PCR反應的最優(yōu)體系(20 μ 1)為1.4U Taq DNA聚合酶，0.35mmol/L dNTP，0.7 μ mol/L 引物，25ng 模板 DNA, 1.75mmol/L MgC12，lOxPCRBuffer 2.Ομ?，加ddH20至25μ1。鑒別種子純度的ISSR-PCR反應條件為:在PCR儀中預變性94°C 120秒，然后循環(huán):94°C 50秒，70°C 30秒，72°C 130秒，共38輪循環(huán)。循環(huán)結束后，72°C 15分鐘，4°C保存。電泳結束后，取PCR產(chǎn)物15ul加3ul上樣緩沖液(6x)于1.6%或1.8%瓊脂糖膠上電泳，穩(wěn)壓50-100V(電壓低帶型整齊，分辨率高)；電泳結束，溴化乙錠染色20分鐘，用凝膠成像儀觀察、拍照，觀察電泳條帶數(shù)和位置來鑒別花生種子純度。如果樣品電泳條帶數(shù)一樣多而且位置相同，則表明是同一個品種。
[0006]本發(fā)明的有益效果是利用ISSR分子標記鑒定花生種子純度，可以有效防止假雜種摻入，不僅可以使種子播后苗情一致，充分發(fā)揮良種的增產(chǎn)潛力，作物生長整齊，成熟期一致，有利于機械化作業(yè)。
【具體實施方式】
[0007]下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的說明，實施例僅為對
【發(fā)明內(nèi)容】
的詳細說明，并不用于限定本發(fā)明，任何本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下，對本發(fā)明專利內(nèi)容的修改，都將等價落在本發(fā)明專利的保護范圍內(nèi)。
[0008]實施例1
隨機抽取大花生新品種花育33號的種子樣品100份，通過4條ISSR引物WLS1:AGA GTTGGT AGC TCT TGA TC ；WLS2:CAT GGT GTT GGT CAT TGT TCC A ；WLS3:AGA GAG AGA GAG AGAGYC和WLS4:AGA GAG AGA GAG AGA GCL來鑒別種子的純度。鑒別種子純度的ISSR-PCR反應的最優(yōu)體系(20 μ 1)為 1.4U Taq DNA 聚合酶，0.35mmol/L dNTP，0.7 μ mol/L 引物，25ng模板 DNA，1.75mmol/L MgC12，lOxPCR Buffer 2.0 μ 1，加 ddH20 至 25 μ 1。鑒別種子純度的ISSR-PCR反應條件為:在PCR儀中預變性94°C 120秒，然后循環(huán):94°C 50秒，70°C 30秒，72°C 130秒，共38輪循環(huán)。循環(huán)結束后，72°C 15分鐘，4°C保存。電泳結束后，取PCR產(chǎn)物15ul加3ul上樣緩沖液^x)于1.6%瓊脂糖膠上電泳，穩(wěn)壓50-100V(電壓低帶型整齊，分辨率高)；電泳結束，溴化乙錠染色20分鐘，用凝膠成像儀觀察、拍照，觀察電泳條帶數(shù)和位置來鑒別花生種子純度?；ㄓ?3號100份樣品中，WLS1引物條帶位置和數(shù)目完全相同，WLS2引物只有1個樣品條帶位置不同，WLS3引物1個樣品條帶數(shù)目不同，WLS4引物1個樣品條帶位置和數(shù)目不相同。檢測結果表明花育33號花生新品種種子純度在98%以上。
[0009]實施例2
隨機抽取小花生新品種花育20號的種子樣品100份，通過4條ISSR引物WLS1:AGA GTTGGT AGC TCT TGA TC ；WLS2:CAT GGT GTT GGT CAT TGT TCC A ；WLS3:AGA GAG AGA GAG AGAGYC和WLS4:AGA GAG AGA GAG AGA GCL來鑒別種子的純度。鑒別種子純度的ISSR-PCR反應的最優(yōu)體系(20 μ 1)為 1.4U Taq DNA 聚合酶，0.35mmol/L dNTP，0.7 μ mol/L 引物，25ng模板 DNA，1.75mmol/L MgC12，lOxPCR Buffer 2.0 μ 1，加 ddH20 至 25 μ 1。鑒別種子純度的ISSR-PCR反應條件為:在PCR儀中預變性94°C 120秒，然后循環(huán):94°C 50秒，70°C 30秒，72°C 130秒，共38輪循環(huán)。循環(huán)結束后，72°C 15分鐘，4°C保存。電泳結束后，取PCR產(chǎn)物15ul加3ul上樣緩沖液^x)于1.8%瓊脂糖膠上電泳，穩(wěn)壓50-100V(電壓低帶型整齊，分辨率高)；電泳結束，溴化乙錠染色20分鐘，用凝膠成像儀觀察、拍照，觀察電泳條帶數(shù)和位置來鑒別花生種子純度。花育20號100份樣品中，WLS1引物條帶位置和數(shù)目完全相同的有96份，WLS2引物有5個樣品條帶位置不同，WLS3引物3個樣品條帶數(shù)目不同，WLS4引物3個樣品條帶位置和數(shù)目不相同。檢測結果表明花育20號花生新品種種子純度在95%以上。
【主權項】
1.一種利用ISSR分子標記檢測花生種子純度的方法，其特征在于它通過4條ISSR引物 WLSI:AGA GTT GGT AGC TCT TGA TC ；WLS2:CAT GGT GTT GGT CAT TGT TCC A ；WLS3:AGAGAG AGA GAG AGA GYC 和 WLS4:AGA GAG AGA GAG AGA GCL 來鑒別花生種子的純度。2.鑒別種子純度的ISSR-PCR反應的最優(yōu)體系(20μ I)為1.4U Taq DNA聚合酶，0.35mmol/L dNTP，0.7 ymol/L 引物，25ng 模板 DNA, 1.75mmol/L MgCl2, 1xPCR Buffer2.0 μ 1，加 ddH20 至 25 μ L.3.鑒別種子純度的ISSR-PCR反應條件為:在PCR儀中預變性94°C120秒，然后循環(huán):94°C 50秒，70°C 30秒，72°C 130秒，共38輪循；循環(huán)結束后，72°C 15分鐘，4°C保存。4.電泳鑒定，取PCR產(chǎn)物15ul加3ul上樣緩沖液(6x)于1.6%或1.8%瓊脂糖膠上電泳，穩(wěn)壓50-100V(電壓低帶型整齊，分辨率高)；電泳結束，溴化乙錠染色20分鐘，用凝膠成像儀觀察、拍照，觀察電泳條帶數(shù)和位置來鑒別花生種子純度。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用ISSR分子標記檢測花生種子純度的方法，它通過4條ISSR引物WLS1：AGA？GTT？GGT？AGC？TCT？TGA？TC；WLS2：CAT？GGT？GTT？GGT？CAT？TGT？TCC？A；WLS3：AGA？GAG？AGA？GAG？AGA？GYC和WLS4：AGA？GAG？AGA？GAG？AGA？GCL來鑒別花生種子的純度。鑒別種子純度的ISSR-PCR反應的最優(yōu)體系(20μl)為1.4U？Taq？DNA聚合酶，0.35mmol/L？dNTP，0.7μmol/L引物，25ng模板DNA，1.75mmol/L？MgCl2，10xPCR？Buffer？2.0μl，加ddH2O至25μl。利用ISSR分子標記技術可以快速鑒別花生種子的純度，充分發(fā)揮花生新品種增產(chǎn)的潛力，增加種植戶的積極性。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105256016
【申請?zhí)枴緾N201510646566
【發(fā)明人】鄭輝, 王玉春, 黃翔
【申請人】山東臥龍種業(yè)有限責任公司
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2015年10月9日