一種應(yīng)用于矮馬遺傳多樣性檢測的微衛(wèi)星標(biāo)記方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動(dòng)物分子遺傳學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及矮馬的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]微衛(wèi)星是近十幾年來發(fā)展起來的一種新的分子標(biāo)記，它是指以少數(shù)幾個(gè)核苷酸(1?6個(gè))為單位多次重復(fù)的簡單序列，其中以雙核苷酸重復(fù)最為常見。應(yīng)用于相關(guān)種群的遺傳多樣性檢測和遺傳圖譜的構(gòu)建。目前微衛(wèi)星序列的獲得主要有兩種途徑:一種是用經(jīng)典的分子生物學(xué)方法構(gòu)建富含有微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因組文庫，通過雜交篩選出含有微衛(wèi)星序列的陽性克隆，但是篩選過程較復(fù)雜，篩選效率低，需要大量的人力和資金的投入;另一種是從已知的核酸序列中進(jìn)行檢索，但是可檢索的資源相對有限。中國矮馬是我國的珍稀瀕危物種，對其遺傳多樣性的評價(jià)具有重要意義。目前，涉及矮馬的微衛(wèi)星分離制備方法還十分少見。因此，尋求新的矮馬微衛(wèi)星分離方法十分重要。
[0003]目前本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠獲知的比較相近的已公開技術(shù)主要有如下這些:
1、申請?zhí)柼枮?1106477.3，名稱為適用于豬品種分類的豬微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的公開中國發(fā)明專利文獻(xiàn)，該發(fā)明的特征是，構(gòu)建部分小插入片段基因組文庫，分離鑒定豬新微衛(wèi)星標(biāo)記，篩選其中適用于豬品種分類的豬微衛(wèi)星標(biāo)記HAU01、HAU02、HAU03，確定了該三個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記DNA順序，設(shè)計(jì)了三個(gè)位點(diǎn)的引物。該發(fā)明為豬的品種分類、親緣鑒定和標(biāo)記輔助育種提供新的分子標(biāo)記。
[0004]2、申請?zhí)枮?01410022080.0，名稱為草魚親子鑒定微衛(wèi)星熒光多重PCR的方法的中國公開專利文獻(xiàn)，該發(fā)明利用微衛(wèi)星標(biāo)記與多重?zé)晒釶CR技術(shù)結(jié)合，篩選了 13個(gè)高度多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)，組建3個(gè)多重?zé)晒釶CR體系，通過測序儀分型，對草魚家系進(jìn)行高通量個(gè)體識(shí)別和親子關(guān)系分析;本發(fā)明的建立為草魚種質(zhì)鑒定、家系管理和增殖放流效果評估提供了一種新的技術(shù)手段。
[0005 ]以上這些這些技術(shù)的缺點(diǎn)是:應(yīng)用多種內(nèi)切酶共同切割基因組DNA的方法。此方法可以產(chǎn)生比較理想的片段，得到足夠的側(cè)翼序列來設(shè)計(jì)引物，但是如果用多酶切會(huì)產(chǎn)生不是平端的酶切產(chǎn)物，產(chǎn)物需要進(jìn)行末端補(bǔ)平。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明擬通過構(gòu)建微衛(wèi)星DNA文庫、微衛(wèi)星序列篩選、引物設(shè)計(jì)與優(yōu)化和微衛(wèi)星檢測等步驟來實(shí)現(xiàn)來獲得可靠的微衛(wèi)星標(biāo)記序列，為中國矮馬的遺傳多樣性檢測提供分子標(biāo)記手段。
[0007]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:
一種應(yīng)用于矮馬遺傳多樣性檢測的微衛(wèi)星標(biāo)記方法，該方法包括如下步驟:
步驟1:矮馬基因組PCR文庫創(chuàng)建；
步驟2:磁珠法進(jìn)行微衛(wèi)星序列篩選；
步驟3:矮馬微衛(wèi)星標(biāo)記序列分類與驗(yàn)證。
[0008]其中，步驟1中矮馬基因組PCR文庫創(chuàng)建包括如下步驟:
步驟1.1:矮馬基因組DNA的提?。?br> 步驟1.2:超聲波破碎基因組DNA;
步驟1.3:根據(jù)目的片段的大小調(diào)整樣本處理儀參數(shù)；
步驟1.4:超聲波破碎后的DNA電泳檢測；
步驟1.5:創(chuàng)建基因組PCR文庫。
[0009]步驟1.5中，用獲得的DNA片段作為模板，設(shè)計(jì)引物(5’-G ATCGTCGACGGTACCGAATTC T;5，_G TCAAGAATTCGGTACCGTCGA C)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，創(chuàng)建基因組PCR文庫。
[0010]步驟2中磁珠法進(jìn)行微衛(wèi)星序列篩選包括如下步驟:
步驟2.1:用生物素標(biāo)記的微衛(wèi)星探針和Dynal磁珠與微衛(wèi)星文庫雜交；
步驟2.2:磁珠的平衡；
步驟2.3:磁珠吸附富集；
步驟2.4:捕獲含有微衛(wèi)星序列的單鏈DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
步驟2.5:連接T-載體，克?。?br> 步驟2.6:原位雜交，用同位素探針進(jìn)行二次篩選。
[0011 ]步驟2.1采用以下方法實(shí)現(xiàn):根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料建立50HL反應(yīng)體系，1.5μ?生物素標(biāo)記的(CA)15 探針、5yL(50ymol/L)引物、15yL20XSSC、0.5yL10%SDS和 16yL ddH20，混合，68°C預(yù)熱;將12nL (276ng)DNA95°C變性5min，加入預(yù)熱的雜交混合液，68°C雜交lh;雜交過程中平衡磁珠。
[0012]步驟2.4采用以下方法實(shí)現(xiàn):用200μL0.1XTE在室溫快速洗2次，加入50μL0.1 XTE 95°C變性10 min，釋放出含有微衛(wèi)星序列的單鏈DNA，放在磁力架上吸出備用;PCR反應(yīng)體系25nL，內(nèi)含4種dNTP的混合PCR緩沖液18nL，引物0.5燦，TaqDNA聚合酶0.5仙，根據(jù)DNA模板的濃度加入不多于4tiL的模板，加無菌水補(bǔ)足PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增;反應(yīng)完畢后，過旋離柱以去除多余的引物和沒有參加反應(yīng)的dNTP，并濃縮到15仙左右，電泳檢測。
[0013]步驟2.5采用以下方法實(shí)現(xiàn):建立lOyL連接反應(yīng)體系:2 X連接酶緩沖液，pGEM-T vector lyL，插入DNA片段2yL，T4DNA連接酶lyL(3U/yL )，加無菌去離子水補(bǔ)足10μL，同時(shí)Τ載體自身連接作為對照，4°C連接過夜；用CaCl2制備的感受態(tài)大腸桿菌DH5a進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到微衛(wèi)星基因組文庫。
[0014]步驟2.6采用以下方法實(shí)現(xiàn):通過原位雜交對微衛(wèi)星文庫進(jìn)行二次篩選;將轉(zhuǎn)化所得的克隆轉(zhuǎn)化到雜交膜上，同時(shí)保留完全相同大小的菌板，以待雜交結(jié)果出來后挑取陽性克隆；用同位素標(biāo)記的(CA) 15進(jìn)行雜交，壓X光片，70°C放射自顯影7d;挑取陽性克隆進(jìn)行測序分析。
[0015]步驟3中矮馬微衛(wèi)星標(biāo)記序列分類與驗(yàn)證包括如下步驟:
步驟3.1:序列分類；
步驟3.2:微衛(wèi)星標(biāo)記序列的重復(fù)性、穩(wěn)定性、多態(tài)性檢驗(yàn)。
[0016]本發(fā)明的技術(shù)效果是能夠快速、有效、大量的獲得應(yīng)用于矮馬遺傳多樣性檢測的微衛(wèi)星標(biāo)記。此方法所獲得的矮馬微衛(wèi)星標(biāo)記還可應(yīng)用于矮馬遺傳圖譜的構(gòu)建和其它分子生物學(xué)、分子生態(tài)學(xué)檢測。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，實(shí)施例中有關(guān)數(shù)量份數(shù)、百分比、數(shù)量比例等，若無特殊說明，均指質(zhì)量單位。
[0018]實(shí)施例1:
具體步驟如下:
一、矮馬基因組PCR文庫創(chuàng)建:
1、矮馬基因組DNA的提取:
將5ml新鮮矮馬血液或經(jīng)EDTA抗凝的冷凍矮馬血樣(或肌肉組織)，應(yīng)用基因組試劑盒提取基因組DNA，然后用分光光度計(jì)檢測定量。
[0019]2、超聲波破碎基因組DNA:
將100yL、2 yg基因組DNA放入自動(dòng)聚焦聲波樣本處理儀Covaris 220(美國Covaris公司)專用小玻璃管(520045)中，蓋好備用。
[0020]3、根據(jù)目的片段的大小調(diào)整樣本處理儀參數(shù):
目的片段為300?500bp之間，Covaris 220操作軟件中參數(shù)設(shè)置如下:Duty factor10%,peak incident power 140 ff, Cycle per Brust 200,Tim 80 s.4、超聲波破碎后的DNA電泳檢測:
將破碎后的DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色，然后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察分析，將峰值在300bp左右的DNA，用生物分析儀進(jìn)行DNA破碎效果檢測。
[0021 ] 5、創(chuàng)建基因組PCR文庫:
用獲得的DNA片段作為模板，設(shè)計(jì)引物(5’-G ATCGTCGACGGTACCGAAT T C T;5’-G TCAAGAATTCGGTACCGTCGA C)，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，創(chuàng)建基因組PCR文庫。PCR反應(yīng)體系為:94°C預(yù)變性3min，94°C lmin，58°C lmin，72°C lmin，30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。反應(yīng)完畢后，過旋離柱以去除多余的引物和沒有參加反應(yīng)dNTP，并濃縮到15tiL左右。電泳檢測。
[0022]二、磁珠法進(jìn)行微衛(wèi)星序列篩選:
1、用生物素標(biāo)記的微衛(wèi)星探針和Dynal磁珠與微衛(wèi)星文庫雜交:
根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料建立50仙反應(yīng)體系，1.5仙(10 ymol/L)生物素標(biāo)記的(CA)15探針、5仙(50ymol/L)引物、15yL20XSSC、0.5yL10%SDS 和 16yL ddH20，混合，68°C 預(yù)熱。將 12yL(276ng)DNA95°C變性5min，加入預(yù)熱的雜交混合液，68°