專利名稱：用于胰島素產(chǎn)生細(xì)胞的方法、組合物及生長與分化因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使非胰島素產(chǎn)生胰細(xì)胞轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞的培養(yǎng)基、培養(yǎng)模式、培養(yǎng)條件和方法，所述干細(xì)胞能被增殖和分化為胰激素產(chǎn)生細(xì)胞。
相關(guān)技術(shù)描述選擇性地控制非胰島素產(chǎn)生胰細(xì)胞，例如腺泡細(xì)胞或?qū)Ч芗?xì)胞擴展和轉(zhuǎn)化為胰島素產(chǎn)生細(xì)胞的能力，將創(chuàng)造新的糖尿病治療方案，該方案避免現(xiàn)行糖尿病治療的許多缺點。
糖尿病是一種由喪失將葡萄糖轉(zhuǎn)運到身體細(xì)胞中的能力而引起的疾病，或者是因為沒有產(chǎn)生足夠的胰島素，或者是因為減少了對胰島素的應(yīng)答。在健康人中，血糖微小升高刺激胰島素的產(chǎn)生和分泌，其作用是增加葡萄糖攝入細(xì)胞，使血糖恢復(fù)到最佳水平。胰島素刺激肝和骨骼肌細(xì)胞從血液中吸收葡萄糖并將其轉(zhuǎn)化為能量貯藏分子糖原。它還刺激骨骼肌纖維從血液中吸收氨基酸并將它們轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)，以及它作用于脂肪細(xì)胞刺激脂肪的合成。在糖尿病中，血流可被葡萄糖飽和，但葡萄糖不能到達細(xì)胞內(nèi)需要和利用它的位置。結(jié)果身體細(xì)胞缺乏需要的能量，導(dǎo)致許多患受控不好的胰島素依賴性糖尿病患者的消瘦外觀。
在發(fā)現(xiàn)胰島素及其作為糖尿病的治療以前，唯一的出路是饑餓，可預(yù)測接著是死亡。用胰島素治療的今天，在過高劑量胰島素的情況下，死亡仍會發(fā)生，過高劑量胰島素導(dǎo)致極度低血糖和昏迷，然后死亡，除非通過葡萄糖的攝取而被逆轉(zhuǎn)。在太低劑量胰島素的情況下，死亡也仍會發(fā)生，太低劑量胰島素導(dǎo)致酮酸中毒，如果不適當(dāng)治療，在緊急情況下也將導(dǎo)致昏迷和死亡。
雖然因為現(xiàn)在有適用于糖尿病的治療，糖尿病通常不是一種致命的疾病，但沒有一種標(biāo)準(zhǔn)的治療能夠取代身體的胰島素微小量—微小量地產(chǎn)生和葡萄糖代謝的精確控制。結(jié)果，糖尿病人中的平均血糖水平一般仍然太高。長期高血糖水平隨時間引起許多長期并發(fā)癥。糖尿病是失明、腎衰竭、心臟病或中風(fēng)的過早發(fā)展、壞疽并切除、陽痿的主要原因，而且它減少患者總估計壽命一至二十年。
糖尿病是世界上最常見的慢性疾病之一。在美國，糖尿病影響了大約一千六百萬人-45歲以上成年人群的12％還多。新病例數(shù)以每年約150,000增加。除了那些患有臨床糖尿病的人以外，表現(xiàn)出異常葡萄糖耐受癥狀的大約有二千萬人。這些人是邊緣的糖尿病人，在那些正常人和那些清楚為糖尿病人之間的中間。他們中的許多人早晚將發(fā)展為糖尿病而且一些估計糖尿病的潛在數(shù)目高達三千六百萬或45歲以上成年人群的25～30％。
糖尿病及其并發(fā)癥對現(xiàn)代社會具有較大的社會經(jīng)濟學(xué)影響。現(xiàn)在在美國花費在衛(wèi)生保健上的費用是大約7000億美元，其中大約1000億被花費用于治療糖尿病及其并發(fā)癥。因為糖尿病的發(fā)病率正在提高，糖尿病保健的成本將占總衛(wèi)生保健支出的不斷增加部分，除非及時采取措施迎接挑戰(zhàn)。糖尿病的醫(yī)療、情感和財政代價是巨大的，并且隨著那些患糖尿病的人數(shù)增加而增加。
可以將糖尿病細(xì)分為兩種不同類型1型糖尿病和2型糖尿病。1型糖尿病以很少或沒有循環(huán)胰島素為特征并且它最常見于兒童或早期青少年。它是由胰島產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞的破壞引起的。因為對β細(xì)胞的自動免疫攻擊導(dǎo)致所述破壞，1型糖尿病具有遺傳誘因，它由一些還未鑒別的環(huán)境事件，例如病毒感染，或非感染劑的作用(毒素或食物)觸發(fā)，該事件激發(fā)免疫系統(tǒng)對患者胰中的β細(xì)胞反應(yīng)并且損壞患者胰中的β細(xì)胞?，F(xiàn)認(rèn)為導(dǎo)致1型糖尿病事件的致病順序由幾步組成。第一，認(rèn)為遺傳易感性是致病過程開始的基礎(chǔ)要件。第二，由病毒或非感染劑，例如毒素或食物介導(dǎo)的環(huán)境損害激發(fā)第三步，在遺傳易感個體胰島中的炎性反應(yīng)(胰島炎)。第四步是β細(xì)胞的改變或轉(zhuǎn)換，使得它們不再被免疫系統(tǒng)認(rèn)為是“自己”，而是被看作是外來細(xì)胞或“非自己”。最后一步是針對“作為靶的”β細(xì)胞的完全損壞免疫應(yīng)答的發(fā)展，其中細(xì)胞介導(dǎo)的免疫機制與細(xì)胞毒性抗體在產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞的破壞中相互配合。盡管這種免疫攻擊，一段時間內(nèi)，新β細(xì)胞的產(chǎn)生是快的，足以位于被免疫系統(tǒng)破壞之前，從而存在大量的β細(xì)胞以控制血糖水平。但是，逐步地，β細(xì)胞的數(shù)目下降。當(dāng)β細(xì)胞數(shù)降至臨界水平(正常的10％)時，不能再控制血糖水平，以及進展為胰島素產(chǎn)生的完全衰竭幾乎是不可避免?，F(xiàn)認(rèn)為，β細(xì)胞的再產(chǎn)生持續(xù)幾年，甚至在功能胰島素產(chǎn)生停止以后，但當(dāng)所述細(xì)胞發(fā)展成熟時，它們被破壞。
為了生存，患有1型糖尿病的人必須每天進行多次胰島素注射并且每天多次通過刺破他們的手指取血測試他們的血糖。胰島素的每天多次注射不足以模擬身體的微小量—微小量的胰島素產(chǎn)生和葡萄糖代謝的精確控制。血糖水平通常比正常更高，引起并發(fā)癥，包括失明、心臟病發(fā)作、腎衰竭、中風(fēng)、神經(jīng)損傷，和切除術(shù)。即使用胰島素，糖尿病人的平均壽命比健康人少15-20年。
2型糖尿病通常出現(xiàn)在中年或中年后，特別影響那些超重的人。但是，在過去的幾年間，年輕成年人中2型糖尿病的發(fā)病率顯著地增加。在最近幾年中，2型糖尿病發(fā)作的年齡已從40歲降至30歲，那些肥胖人成為這種疾病新的更年輕的受害者。在2型糖尿病中，正常需要胰島素的身體細(xì)胞喪失了他們的敏感性并且不能對胰島素正常應(yīng)答。通過由胰β細(xì)胞產(chǎn)生額外的胰島素可克服這種胰島素耐受達許多年。但是，最終，由于升高的血糖水平，β細(xì)胞不得不產(chǎn)生大量的過量胰島素，所以它們逐漸地衰竭。最后，過度工作的β細(xì)胞死亡以及胰島素分泌停止，同時帶來血糖升高至足夠的水平，只能通過外源性胰島素注射來控制它。高血壓和異常膽固醇水平通常伴隨2型糖尿病。這些狀況，與高血糖一起，增加了心臟病發(fā)作、中風(fēng)和導(dǎo)致切除術(shù)的腿部循環(huán)阻滯的風(fēng)險。治療2型糖尿病的藥物包括起減少從腸的葡萄糖吸收或者由肝臟的葡萄糖產(chǎn)生作用的一些藥物和直接刺激β細(xì)胞產(chǎn)生更多胰島素的其他藥物。但是，高水平葡萄糖對β細(xì)胞是毒性的，引起功能的進行性下降和細(xì)胞死亡。因此，許多2型糖尿病患者最終需要外源性胰島素。最近令人不安的發(fā)現(xiàn)是最終需要胰島素治療的2型糖尿病人的估計從20％增加至40％。
糖尿病的另一種形式被稱為年輕人成熟發(fā)作糖尿病(MODY)。這種形式的糖尿病是由于在胰島素產(chǎn)生細(xì)胞中的遺傳誤差，該誤差限制它加工通過特異性葡萄糖受體進入該這種細(xì)胞的葡萄糖的能力。MODY患者中的β細(xì)胞不能響應(yīng)葡萄糖正確地產(chǎn)生胰島素，導(dǎo)致高血糖癥并且需要治療，該治療最終也需要胰島素注射。
目前可適用于胰島素依賴性糖尿病的醫(yī)學(xué)治療限于胰島素施用和用整個胰或胰部分的胰移植。到目前為止，胰島素治療比胰移植更流行，通常需要通過多次皮下注射，或通過連續(xù)皮下注射給予胰島素。常規(guī)胰島素治療涉及一天施用一次或兩次注射中效胰島素，添加或不添加小量常規(guī)胰島素。多次皮下胰島素注射技術(shù)涉及中效或長效胰島素的施用，然后在晚上和/或早晨作為單劑量在每次飯前一起給予常規(guī)胰島素。連續(xù)皮下胰島素輸注涉及小的電池驅(qū)動泵的應(yīng)用，該泵通常通過27規(guī)格的蝶型針將胰島素皮下遞送至腹壁。用這種治療樣式，整個白天和晚上以基礎(chǔ)速率，程序化的飯前以增加速率連續(xù)地遞送胰島素。在這些方法的每一種中，需要患者頻繁地檢測他的或她的血糖水平并且必要時調(diào)整胰島素劑量。但是，控制血糖并不簡單。盡管嚴(yán)格注意維持健康飲食、運動方案和總是注射合適量的胰島素，但許多其它因素能不利地影響一個人的血糖控制，包括應(yīng)激、激素變化、生長期、疾病或感染以及疲勞?；加?型糖尿病的人必須經(jīng)常對生命威脅性低血糖和高血糖反應(yīng)作好準(zhǔn)備。胰島素依賴性糖尿病是一種生命威脅性疾病，它需要永不終止的警惕。
相比于胰島素施用，已知整個胰移植或胰部分的移植治愈了患者中的糖尿病。但是，由于需要終生的免疫抑制治療，通常僅在需要腎移植時進行胰移植，使單純胰移植成為相對少見的手術(shù)。雖然胰移植在幫助胰島素依賴性糖尿病人改善他們的血糖至他們不再需要胰島素注射和減少長期并發(fā)癥方面非常成功，但對整個胰移植來說有許多缺點。最重要地，進行胰移植涉及大手術(shù)并且需要終生應(yīng)用免疫抑制藥物以防止身體的免疫系統(tǒng)破壞作為外來移植物的胰。不用這些藥物，幾天間胰就被破壞。服用這些免疫抑制藥物的風(fēng)險是感染和腫瘤發(fā)病率的增加，二者各自都可以是生命威脅性的。手術(shù)操作中的內(nèi)在風(fēng)險，為防止移植排斥患者終生免疫抑制的需要以及與這種侵害性操作有關(guān)的發(fā)病率和死亡率，說明與整個胰移植用于治療糖尿病有關(guān)的嚴(yán)重缺點。因此，對胰島素注射和胰移植的替代將滿足巨大的公眾健康需要。
胰島移植是比整個胰移植更簡單(和更安全)得多的操作并且通過取代失去的β細(xì)胞能獲得相同效果。胰島素產(chǎn)生性β細(xì)胞存在于散布在整個胰中的朗格漢斯胰島，一個橫向位于胃后面的延長腺中。胰將1.5-3升含有用于消化的酶和酶原的堿液分泌到膽總管中。從組織學(xué)上看，胰由三類功能細(xì)胞組成a)將它們的酶分泌到腔中的外分泌細(xì)胞，b)將所述酶攜帶至腸的導(dǎo)管細(xì)胞，和c)將它們的激素分泌到血流中的內(nèi)分泌細(xì)胞。所述外分泌部分被排列為許多含有稱為腺泡細(xì)胞的柱狀至錐狀上皮細(xì)胞的小腺(腺泡)。腺泡細(xì)胞占大約80％胰細(xì)胞并且負(fù)責(zé)將消化酶，例如淀粉酶、脂肪酶、磷脂酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、氨肽酶、彈性蛋白酶和各種其它蛋白分泌到胰管系統(tǒng)中。所述胰管系統(tǒng)由相互聯(lián)系的導(dǎo)管的錯綜、支流樣網(wǎng)絡(luò)組成，這些導(dǎo)管排出每種分泌腺泡、向前排入更大的導(dǎo)管，最后排入主胰管。胰管系統(tǒng)的襯上皮細(xì)胞由導(dǎo)管細(xì)胞、占大約10％胰細(xì)胞的細(xì)胞型組成。導(dǎo)管細(xì)胞形態(tài)學(xué)從排出分泌腺泡的精細(xì)胚根中的立方型變化至主導(dǎo)管系統(tǒng)中高、柱狀粘液分泌型。
胰的內(nèi)分泌部分由約一百萬個小內(nèi)分泌腺，即散布在整個外分泌胰中的朗格漢斯胰島組成。雖然胰島細(xì)胞僅占大約2％胰細(xì)胞，但胰島細(xì)胞通過適當(dāng)?shù)胤置谝葝u素負(fù)責(zé)維持血糖水平并且是胰中最重要的細(xì)胞。按照所分泌的內(nèi)分泌激素的類型分類，有七類胰島細(xì)胞。胰島β細(xì)胞產(chǎn)生胰島素。如上文所討論的，當(dāng)沒有足夠的β細(xì)胞，或沒有足夠的胰島素分泌時，不管潛在的原因，導(dǎo)致糖尿病。將糖尿病患者中的胰島β細(xì)胞重構(gòu)至足以恢復(fù)正常葡萄糖響應(yīng)胰島素產(chǎn)生的數(shù)目，將解決與胰島素注射和大器官移植有關(guān)的問題。
在局部麻醉下，胰島移植門診操作允許病人在通過小導(dǎo)管將2-3毫升純胰島細(xì)胞的等效體輸送到肝臟時完全保留意識。操作后不久患者可以回家或者恢復(fù)常規(guī)活動。因此，移植胰島而不移植整個胰或其部分提供了許多繞開整個器官移植風(fēng)險的方式。但是，缺乏適用于移植的胰島細(xì)胞在胰島細(xì)胞移植中仍然是一個未解決的問題。因為胰島僅構(gòu)成整個胰的約2％，將它們與不產(chǎn)生胰島素的胰余下部分分離花費約6小時。雖然自動化的分離方法使從一個胰中分離足夠移植到一個患者中的胰島成為可能，但如與以前進行一次移植需要5或6個器官相反，對胰島的需要仍然超過從尸體收獲目前可獲得的器官供應(yīng)。在美國，由于低器官供體率和不斷增加的胰島素依賴性糖尿病發(fā)生的結(jié)合，僅有大約6,000份胰適用于移植的胰或胰島細(xì)胞分離，同時每年被診斷為胰島素依賴性糖尿病的新病例數(shù)大約有35,000(Hering，B.J.& Ricordi，C.(1999)Graft 2，12-27)。
解決嚴(yán)重胰島細(xì)胞缺乏問題的一個方案是其它細(xì)胞的遺傳改造以產(chǎn)生胰島素。遺傳改造其它細(xì)胞以產(chǎn)生胰島素已經(jīng)在肌肉和肝臟細(xì)胞中表現(xiàn)出一些成功，所述細(xì)胞能夠被修飾以產(chǎn)生胰島素的前體，胰島素原。但是，改進這些遺傳工程細(xì)胞中的胰島素分泌將仍然需要相當(dāng)大的研究努力以及它們的低胰島素產(chǎn)生使它們還不適用于移植。另一種策略，異體移植，即從一個物種到另一個物種的器官(在糖尿病的情況下，或組織或細(xì)胞)移植要成為人移植胰島素注射的可靠替代面臨許多基本障礙。與異體移植有關(guān)的風(fēng)險包括朊病毒例如引起瘋牛病(牛海綿形腦病或BSE)的那些的轉(zhuǎn)移，以及動物逆轉(zhuǎn)錄病毒例如PoERV(豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒)的傳遞。另一個障礙是超急性排斥的問題。從進化角度看，移植中涉及的兩個物種相距越遠，當(dāng)將一個物種的器官移植到另一個物種中時排斥過程越快和越嚴(yán)重并且需要更強和更大風(fēng)險的免疫抑制。涉及遺傳改造動物胰島以使它們更不可能死于免疫系統(tǒng)攻擊和破壞的策略具有干預(yù)沉默人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒序列(HERVs)的風(fēng)險，大量所述序列分布在整個人基因組中。通過重組這些序列的激活以及跟著發(fā)生的HERV蛋白表達可導(dǎo)致癌或免疫系統(tǒng)功能失調(diào)(Romano等，Stem Cells 2000；1819-39)。最后，動物和人器官和細(xì)胞在許多方面不同在它們的解剖或結(jié)構(gòu)，激素的產(chǎn)生，過濾速率，酶和其它化學(xué)物質(zhì)的分泌和吸收方面，在它們的對疾病的耐受，和預(yù)計壽命方面。
解決關(guān)于胰島細(xì)胞移植的組織可獲得性問題的另一種策略是胚胎干細(xì)胞或全能干細(xì)胞的分離。全能干細(xì)胞是能夠生長為身體中任何其它類型細(xì)胞的細(xì)胞，包括生長為整個生物。利用這類干細(xì)胞生長滿足糖尿病移植需要所需的胰島的問題在于它們從流產(chǎn)或體外受精的獲得具有固有的倫理和政治風(fēng)險。而且，使全能干細(xì)胞分化為正常胰島素產(chǎn)生性細(xì)胞的技術(shù)從它們大量常規(guī)分化為將來所需要的胰島素產(chǎn)生性細(xì)胞看，該技術(shù)還不完美以及還不受控制。它們響應(yīng)葡萄糖濃度(該濃度激發(fā)正常β細(xì)胞中的胰島素分泌)升高產(chǎn)生胰島素的能力，顯示它們不表現(xiàn)為正常胰島β細(xì)胞(Vogel，Science，2001 292615-617)。最后，為治療目的在患者中應(yīng)用胚胎干細(xì)胞帶有腫瘤生長的內(nèi)在危險。小鼠胚胎干細(xì)胞當(dāng)被注射到成年小鼠中時是致瘤的，人胚胎干細(xì)胞當(dāng)被注射到免疫機能不全的小鼠中時也證實相似的致瘤潛能。胚胎干細(xì)胞的潛在應(yīng)用需要未分化干細(xì)胞與所想要的分化子代的精確分離，這是臨床應(yīng)用防止?jié)撛谀[瘤形成的關(guān)鍵和還未完成的前提(Solter和Gearhart，Science 1999，2831468-1470)。
因此，存在對大量非致瘤人β細(xì)胞的重要未滿足的醫(yī)療需求以治療世界上數(shù)以百萬計的糖尿病患者。由輕易可得的原材料例如被轉(zhuǎn)化為臨床上有關(guān)干細(xì)胞的胰腺泡和導(dǎo)管細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)人胰島素產(chǎn)生性β細(xì)胞的策略將克服目前方法所面臨的障礙。
根據(jù)從原代胰細(xì)胞開始，使它們轉(zhuǎn)化為胰島素產(chǎn)生性細(xì)胞調(diào)查現(xiàn)有技術(shù)，基于起始目的細(xì)胞，經(jīng)驗歷史上分成三類胰島細(xì)胞、導(dǎo)管細(xì)胞或腺泡細(xì)胞。有許多從胰島細(xì)胞開始體外生長和擴展胰島細(xì)胞群的現(xiàn)有經(jīng)驗。基本上所有這些方法分離純化的胰島并主要將它們置入貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述胰島失去它們的胰島表型，平鋪為單細(xì)胞以及生長至匯合。大多數(shù)體外誘導(dǎo)直接分化胰島細(xì)胞復(fù)制的努力表明有限的增殖胰島細(xì)胞群同時保持它們分化狀態(tài)的能力。匯集的這些研究的經(jīng)驗在于，在大多數(shù)情況下，培養(yǎng)這些貼壁胰島細(xì)胞一段時間后，它們失去了它們的胰島表型并分化為更原始的細(xì)胞型，該細(xì)胞型不好表征但體外擴展一段時間。然而，因為培養(yǎng)物的失去，這些細(xì)胞不可避免地進入衰老。
現(xiàn)證明，使這些更原始的細(xì)胞再分化回分化的胰島非常困難(Nielson 92，Brelje 93，Bonner Weir 93，Otonkoski 91，Otonkoski94)。但是，在一種方法(Cornelius 97)中，允許將來自NOD小鼠的胰島培養(yǎng)物鋪板然后不更換培養(yǎng)基放置數(shù)周。不好鑒別的上皮細(xì)胞型的少數(shù)細(xì)胞是所有生存下來并可被生長出的細(xì)胞，它證實了增殖和在不同培養(yǎng)條件和試劑的狀態(tài)下被分化為胰島細(xì)胞的能力。所述的美國專利5,834,308和6,001,647，聲稱這些不好描述的上皮細(xì)胞為干細(xì)胞，該細(xì)胞需要這種培養(yǎng)以分離、生長和使它們發(fā)育為功能胰島素產(chǎn)生性細(xì)胞的方法。雖然用這種胰細(xì)胞貼壁培養(yǎng)的方法證實了干細(xì)胞的存在，但細(xì)胞饑餓至最小存活以及生長和分化為胰島細(xì)胞的技術(shù)是有問題的。這種方法需要胰島細(xì)胞的廣泛生長以達到生產(chǎn)用于糖尿病治療的大規(guī)模移植物所需要的水平。至今沒有證據(jù)表明，該方法可應(yīng)用于人細(xì)胞以及可能擴大規(guī)模并同時保留臨床產(chǎn)品所需這些胰島細(xì)胞的分化表型。因此，我們轉(zhuǎn)向如本發(fā)明中所述的一種替代方法，它在以下方面顯著不同，它不從原代胰島細(xì)胞開始形成可被擴展和分化為胰島素產(chǎn)生性細(xì)胞的干細(xì)胞。取而代之的是，我們從非胰島素產(chǎn)生性胰細(xì)胞開始，使它們轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞，該干細(xì)胞擴展然后分化為胰島細(xì)胞。
其它方法將胰島細(xì)胞置入MATRIGEL，膠原或瓊脂糖，而不是利用貼壁培養(yǎng)物(Kerr-Conte 96)。這導(dǎo)致膽囊管結(jié)構(gòu)的形成，伴隨胰島組織的退化以及導(dǎo)管結(jié)構(gòu)和導(dǎo)管表型的細(xì)胞的生長和分化。本申請的發(fā)明人也將分離的人胰島置入MATRIGEL并且證實導(dǎo)管細(xì)胞的誘導(dǎo)，所述導(dǎo)管細(xì)胞取代分化的胰島細(xì)胞群。不同的基質(zhì)也能使胰島細(xì)胞轉(zhuǎn)化為導(dǎo)管細(xì)胞，特別是在HGF的存在下(Lefrbvre 98)，但還是不能產(chǎn)生胰島。雖然要求保護由這些結(jié)構(gòu)形成的胰島細(xì)胞，但不清楚它們的來源是來自存在于起始細(xì)胞中的殘留胰島組織還是新的胰島素產(chǎn)生性細(xì)胞。導(dǎo)管結(jié)構(gòu)和胰島細(xì)胞還可以從還沒有被特異鑒別的干細(xì)胞發(fā)育。
已被開發(fā)的下一種方法是從胰管細(xì)胞開始測定形成新胰島細(xì)胞的能力。它基于在被疾病或操作被誘導(dǎo)損傷的發(fā)育性胎兒胰和成人胰中的觀察，其中一個觀察到了芽出導(dǎo)管結(jié)構(gòu)的新胰島的形成，它產(chǎn)生這樣一種觀念，即存在與導(dǎo)管結(jié)構(gòu)有關(guān)的胰干細(xì)胞，該導(dǎo)管結(jié)構(gòu)可被胎兒發(fā)育，或?qū)Τ扇艘戎械囊葝u群的損傷或損失激活。
從來自小鼠和大鼠胰而不是來自人胰的分離和純化的導(dǎo)管結(jié)構(gòu)開始(Fung，US 6,326,201)，單細(xì)胞開始體外形成單細(xì)胞層，該單細(xì)胞層主要為成纖維細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的混合物。最終一些胰島素產(chǎn)生性細(xì)胞開始出現(xiàn)在這些貼壁培養(yǎng)物中，但在單細(xì)胞層中仍然是低水平。少數(shù)生長因子的添加最小化地增加單細(xì)胞層中的胰島素細(xì)胞數(shù)。但是，單細(xì)胞至被稱為非粘附細(xì)胞(NAC)的細(xì)胞群開始出現(xiàn)漂浮在含有胰島激素細(xì)胞型的單細(xì)胞層培養(yǎng)物上。在收獲前通過利用生長因子脈沖可增加這些NAC’s。他們還描述了pdx1陽性細(xì)胞，一些與作為β細(xì)胞所需的胰島素共染色，其它只具有pdx1染色，他們將其描述為祖細(xì)胞。上述NAC’s還能顯示出葡萄糖刺激的胰島素釋放。他們還能向單細(xì)胞層中添加不同的生長因子，誘導(dǎo)增殖和表型變化。他們描述了應(yīng)用凝集素純化這些他們生產(chǎn)的祖細(xì)胞。因此，他們的結(jié)果支持來自大胰管的純化胰管細(xì)胞被去分化為祖細(xì)胞的能力，通過利用他們的特異方法，所述祖細(xì)胞能分化為胰島素產(chǎn)生性細(xì)胞。本發(fā)明在以下方面與Fung的工作顯著不同我們的起始胰細(xì)胞是人胰細(xì)胞而不是從純化的導(dǎo)管結(jié)構(gòu)中分離的。事實上，他聲稱僅由胰管組織生產(chǎn)導(dǎo)管細(xì)胞，他將該胰管組織定義為包括主胰管、副胰管、背胰管和腹胰管。他將小頁間導(dǎo)管和閏管分別定義為他的胰管定義中不包括的單獨實體。我們的起始胰組織排除了他定義為胰管的組織，因為這些更大的結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)部分在細(xì)胞分離過程中被篩選出我們的制備物并且在原材料的組織切片中觀察不到。只有CK19染色陽性的胰管組織是位于腺泡細(xì)胞集合體內(nèi)并且被腺泡細(xì)胞完全包圍的閏管。
因此，我們的起始胰細(xì)胞是腺泡細(xì)胞、被腺泡細(xì)胞包圍的閏管細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的混合物，這些細(xì)胞是在從起始細(xì)胞混合物中純化胰島之后被收獲的，在胰起始細(xì)胞中余下非常少的胰島細(xì)胞。另外，我們的培養(yǎng)技術(shù)在不同的培養(yǎng)模式、多重培養(yǎng)基以及生長因子方面顯著不同，這些生長因子顯著不同，并被描述如下。
另一項工作是Bonner-Weir 2000的工作，該工作也從富含導(dǎo)管的胰組織開始，并陳述他們的方法實際上不對我們利用的起始胰細(xì)胞起作用。他們的培養(yǎng)方法還依賴于不是我們主要方法主題的MATRIGEL，以允許新細(xì)胞遷入和形成胰島素產(chǎn)生性細(xì)胞。
發(fā)展大量胰島素產(chǎn)生性細(xì)胞的第三種方法從腺泡細(xì)胞開始。用腺泡細(xì)胞的大多數(shù)早期工作是維持它在培養(yǎng)物中的表型以更好地了解這些細(xì)胞(Oliver 87，Brannon 88)。然后企圖了解胰癌細(xì)胞的來源，將注意轉(zhuǎn)到導(dǎo)管細(xì)胞和腺泡細(xì)胞明顯使表型變?yōu)橐恍╊愋蛯?dǎo)管細(xì)胞的能力，如所描述的。在膠原凝膠中培養(yǎng)腺泡細(xì)胞，Lisle & Losdon 1990描述了這種現(xiàn)象培養(yǎng)6-12天，腺泡細(xì)胞在這種培養(yǎng)物中失去它們的特異性細(xì)胞標(biāo)記并獲得與導(dǎo)管細(xì)胞類似的標(biāo)記(利用他們自己的單克隆抗體)，但后來隨著培養(yǎng)繼續(xù)，回復(fù)到它們的原始腺泡細(xì)胞標(biāo)記。
再有，對胰癌感興趣的Hall & Limoine 1992，描述了腺泡細(xì)胞在塑料皿上的培養(yǎng)，由此細(xì)胞經(jīng)過5-10天開始變化為開始表達導(dǎo)管細(xì)胞標(biāo)記之一CK19，但到3周時死亡。Arias & Bendayan 1993在MATRIGEL上培養(yǎng)了大鼠和豚鼠腺泡細(xì)胞，維持了它們的腺泡表型，但到一周時損失細(xì)胞。向MATRIGEL中腺泡細(xì)胞的培養(yǎng)物中添加2％DMSO使表型變?yōu)閷?dǎo)管樣細(xì)胞，該導(dǎo)管樣細(xì)胞在MATRIGEL內(nèi)開始形成孢囊(cyst)和小管(tubule)。另外，當(dāng)在孢囊結(jié)構(gòu)中時，所述細(xì)胞開始表達CAII，被導(dǎo)管細(xì)胞用來釋放碳酸氫鹽和水的一種特異酶。蛋白質(zhì)抑制劑阻止所述向?qū)Ч軜颖硇偷淖兓??？雌饋?，MATRIGEL和DMSO的組合朝更原始階段向前推動了去分化的胰島細(xì)胞并進一步使它們分化為具有功能標(biāo)記和形成三維結(jié)構(gòu)能力的成熟導(dǎo)管細(xì)胞。提出了機制的問題是否涉及干細(xì)胞或是否這表示轉(zhuǎn)分化。
然后，Bouwens 1994研究了新生大鼠中潛在的導(dǎo)管細(xì)胞標(biāo)記并描述，CK7是大胰管的標(biāo)記而CK19在更小的導(dǎo)管，閏管，以及腺泡的泡心細(xì)胞中被表達。大鼠獨有的另一種標(biāo)記，CK20，與CK19標(biāo)記類似細(xì)胞。他還注意到，當(dāng)增殖繼續(xù)進行時，一些鄰近擴展性胰島的細(xì)胞也表達CK19或CK20。檢查在平板上培養(yǎng)的小鼠胰細(xì)胞，Vila 1994證實，人腺泡細(xì)胞在開始時表達CK18，但隨時間，它們的表達變換為CK7和CK19，伴有淀粉酶水平下降。另外粘蛋白1表達和另一種導(dǎo)管細(xì)胞標(biāo)記，CFTR(導(dǎo)管細(xì)胞的氯化物轉(zhuǎn)運蛋白的標(biāo)記)升高。而且，提出了問題是否這種變化的機制表示轉(zhuǎn)分化或涉及干細(xì)胞。他們還發(fā)現(xiàn)，HGF和TGFa暴露都引起這些細(xì)胞增殖，這暗示干細(xì)胞可能引起胰島管惡性腫瘤以及可能在胰導(dǎo)管惡性腫瘤的發(fā)育中具有影響。但是，未觀察到胰島素產(chǎn)生。
Kerr-Conte 1996證實，將純化的人胰島置入MATRIGEL產(chǎn)生膽囊管樣結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)含有小芽狀的胰島細(xì)胞。至于這些可明顯增殖的導(dǎo)管樣細(xì)胞的來源可能是什么，從這項工作中還不清楚，但沒有胰島細(xì)胞增殖的證據(jù)。而且，如前文所討論的，這表明這些可能使胰島細(xì)胞去分化為導(dǎo)管樣細(xì)胞，盡管分化的細(xì)胞不增殖，但這些細(xì)胞增殖的能力提高了這種可能性這些細(xì)胞代表干細(xì)胞。但是，未觀察到胰島素產(chǎn)生。
Bouwens 1998比較了轉(zhuǎn)分化的可能性與干細(xì)胞引起來自導(dǎo)管、腺泡或胰島分化細(xì)胞的去分化細(xì)胞增殖的干細(xì)胞作用。雖然由于表現(xiàn)出不同細(xì)胞類型表達的細(xì)胞標(biāo)記，他贊成轉(zhuǎn)分化機制，但他的主要理由是因為這些細(xì)胞的確定性干細(xì)胞標(biāo)記還沒有被發(fā)育，因此要特異性地鑒別它們是不可能的。然而，他承認(rèn)，間接證據(jù)能輕易地提示干細(xì)胞的存在以及所述特異性標(biāo)記僅僅是還沒有被完善。而且，在他的觀察中也未觀察到胰島素產(chǎn)生。
Kerr-Conte 2000和在美國專利申請(20020155598)中顯示，“多能胰干細(xì)胞”的存在是使終未分化的人胰細(xì)胞變?yōu)楦技?xì)胞型的能力的主要原因，所述更原始細(xì)胞型具有擴展然后被分化為終未分化的另一種類型特異細(xì)胞的能力。作為這種干細(xì)胞的一種被認(rèn)可的標(biāo)記，她認(rèn)為共表達CK19和pdx1的導(dǎo)管樣細(xì)胞(Fung類似地建議)是那些干細(xì)胞。她在貼壁培養(yǎng)物中培養(yǎng)了人腺泡細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞的混合物，所述培養(yǎng)物顯示淀粉酶的喪失，CK19的增加，以及pdx1在所得扁平為單細(xì)胞層的導(dǎo)管樣細(xì)胞中的表達增加。但是，她不能顯示向胰島素產(chǎn)生性細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，卻能顯示神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞標(biāo)記，嗜鉻粒蛋白A的新表達。事實上，她的pdx1和CK19染色細(xì)胞是胰島素產(chǎn)生性細(xì)胞的前體細(xì)胞的證據(jù)的聲稱與Fung和我們自己以及他們作為干細(xì)胞一致。但是她在她的專利申請中的聲稱，這些確實是胰島素產(chǎn)生性細(xì)胞，仍未被圖4和5中所表示的她自己的數(shù)據(jù)證明，這些數(shù)據(jù)沒有提供通過這些轉(zhuǎn)化的細(xì)胞增加胰島素產(chǎn)生的任何直接證據(jù)。因此，她證實了干細(xì)胞的存在但沒有證實它們向胰島素產(chǎn)生性細(xì)胞的分化。與本發(fā)明相比，這是一個顯著的區(qū)別，在本發(fā)明中我們清楚地證實了胰島素產(chǎn)生性細(xì)胞的產(chǎn)生。這兩個出版物中所描述的方法利用了胰島含量減少、在單細(xì)胞層中培養(yǎng)的單胰細(xì)胞，使腺泡表型轉(zhuǎn)變?yōu)楸环Q為導(dǎo)管前體的導(dǎo)管樣表型。根據(jù)她的定義，這些導(dǎo)管前體細(xì)胞具有被分化為胰島素產(chǎn)生性細(xì)胞的能力。她試圖通過將導(dǎo)管前體細(xì)胞置入MATRIGEL或膠原的基質(zhì)再分化。她清楚地證實了導(dǎo)管前體細(xì)胞增殖的能力，但在專利申請中，沒有證實任何新胰島素產(chǎn)生性細(xì)胞的形成。
在她的技術(shù)與本發(fā)明中的技術(shù)之間存在顯著區(qū)別。該發(fā)明中的第一步，即使非胰島素產(chǎn)生性胰細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞，除了利用幾種不同類型生長因子的貼壁培養(yǎng)以外，可在幾種不同的培養(yǎng)模式中利用幾種不同的培養(yǎng)基。如通過它經(jīng)歷復(fù)制為中間、更原始細(xì)胞的能力證實，形成了干細(xì)胞，所述更原始的細(xì)胞攜帶至今被認(rèn)可用來鑒別這種干細(xì)胞的獨特標(biāo)記，這些標(biāo)記是導(dǎo)管細(xì)胞標(biāo)記如CK19和pdx1在復(fù)制細(xì)胞中的表達。她的第二步不產(chǎn)生胰島素產(chǎn)生性細(xì)胞。在我們的第二步中，然后通過不同的生長因子和條件組使這些干細(xì)胞分化為胰島素產(chǎn)生性細(xì)胞，在不同的細(xì)胞培養(yǎng)模式中再次證實。我們的發(fā)明還利用了比她的出版物和專利申請中所述的更復(fù)雜的生長和分化因子(表？？？)。下文還顯示了我們的新胰島素產(chǎn)生性細(xì)胞的正常組織學(xué)和功能。本發(fā)明中所用干細(xì)胞的定義是基于美國國家醫(yī)學(xué)圖書館(National Library of Medicine)的定義它是一種未終末分化的，經(jīng)歷復(fù)制以及能分化為一種以上類型分化細(xì)胞的細(xì)胞。我們的實施例顯示，起始非胰島素產(chǎn)生性胰細(xì)胞在第一組培養(yǎng)條件下被轉(zhuǎn)化為復(fù)制并攜帶CK19和pdx1標(biāo)記的干細(xì)胞。這些干細(xì)胞然后能被分化為激素產(chǎn)生性胰島細(xì)胞例如胰島素或胰高血糖素以及在如下文所述的各種分化條件下分化為導(dǎo)管結(jié)構(gòu)。
定義這些定義的許多的一般出處是OMIM，National Center forBiotechnology Information，National Library of Medicine，National Institute of Health。
腺泡細(xì)胞—胰細(xì)胞，占胰的80％并產(chǎn)生許多不同的酶，包括淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶和許多其它酶。通過它們的酶含量，通過特異的細(xì)胞角蛋白例如CK18，以及通過抗表面唾酸糖蛋白的凝集素可鑒別腺泡細(xì)胞。腺泡細(xì)胞形成胰中被稱為腺泡的球形結(jié)構(gòu)單元，腺泡由極化的細(xì)胞組成，該極化的細(xì)胞將它們的酶產(chǎn)物釋放到位于每個腺泡中心的小、中央化的閏管中。在初級細(xì)胞檢查的任何時候，許多腺泡細(xì)胞含有兩個核。
導(dǎo)管細(xì)胞—胰細(xì)胞，占胰的10％，界定更大的小葉間導(dǎo)管和小葉內(nèi)導(dǎo)管以及最小的閏管，從腺泡中排出胰酶。導(dǎo)管細(xì)胞還產(chǎn)生碳酸氫鹽和水以稀釋酶和從這些導(dǎo)管結(jié)構(gòu)釋放到腸中后改變腸pH。通過細(xì)胞角蛋白亞型例如CK19和通過負(fù)責(zé)酸氫鹽產(chǎn)生的酶可鑒別導(dǎo)管細(xì)胞。
胰島細(xì)胞—內(nèi)分泌細(xì)胞，占胰的2％并作為被稱為胰島的單獨的細(xì)胞集合體(aggregate)存在，含有制造不同激素的不同細(xì)胞型。為所述胰島集合體50-60％的β細(xì)胞制造允許葡萄糖進入身體大多數(shù)細(xì)胞的胰島素。為所述胰島30％的α細(xì)胞制造在禁食期間被釋放的胰高血糖素，以允許葡萄糖從肝臟的送遞以維持正常血糖。胰島細(xì)胞10％的δ細(xì)胞制造精細(xì)協(xié)調(diào)葡萄糖水平的促生長素抑制素。胰多肽產(chǎn)生性細(xì)胞(胰島細(xì)胞的5-10％)釋放它們的改變外分泌和胃腸功能的激素。除這些主要的胰島細(xì)胞型以外，還有其它制造許多其它激素的胰島細(xì)胞型，其它激素包括GIP、VIP、胃泌素、鈴蟾肽和其它。另外，所述胰島含有作為富含毛細(xì)管床網(wǎng)狀(fenestrated)的內(nèi)皮，每種胰島細(xì)胞將它的激素產(chǎn)物釋放到毛細(xì)管床中。
胰細(xì)胞—含有腺泡、導(dǎo)管和胰島細(xì)胞類型以及支持細(xì)胞和血管細(xì)胞的來自人供體(或其它哺乳動物物種)的初級胰細(xì)胞。
胰島缺失(islet-depleted)的胰細(xì)胞—利用不連續(xù)或連續(xù)密度梯度從消化的胰細(xì)胞的懸液中分離胰島后余下的細(xì)胞。該種群主要由具有腺泡集合體內(nèi)小百分比的閏管的腺泡細(xì)胞(＞90％)、血管和神經(jīng)組織，以及殘留量的污染性胰島物質(zhì)組成。
胰腺泡—將它們的酶產(chǎn)物排空到中央腺泡區(qū)的任何小球形腺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)，中央腺泡區(qū)排空到閏胰管中。
閏管—來自胰的細(xì)管或腺泡的導(dǎo)管，它排到小葉內(nèi)導(dǎo)管內(nèi)。
小葉內(nèi)導(dǎo)管—從閏管收集胰汁并排到小葉間導(dǎo)管內(nèi)的導(dǎo)管。
小葉間導(dǎo)管—從小葉內(nèi)導(dǎo)管收集胰汁并排到胰管內(nèi)的導(dǎo)管。
胰管—導(dǎo)管中最大的，包括主胰管、副胰管、背胰管和腹胰管。
干細(xì)胞—未末端分化，能進行復(fù)制以及能分化為一種以上類型分化細(xì)胞的細(xì)胞。
細(xì)胞生長—是細(xì)胞DNA的復(fù)制，接著是可通過BrdU或含氚胸苷摻合或KI67證實的胞質(zhì)分裂。
細(xì)胞擴展—用來定義細(xì)胞的數(shù)目，該細(xì)胞已進行細(xì)胞分裂并增加它們的數(shù)目和總量，而不是通過過度生長簡單地增大。
增殖—新部分或子代的快速和重復(fù)產(chǎn)生(如在通過快速連續(xù)的細(xì)胞分裂的細(xì)胞群中)。
細(xì)胞過度生長—用來定義增加它們細(xì)胞容積的增大細(xì)胞，而不是通過細(xì)胞分裂生長。
細(xì)胞周期—細(xì)胞生長周期。在細(xì)胞周期中的細(xì)胞離開靜止期(G0期)，復(fù)制它們的內(nèi)容物并分裂成兩個。
分化—用來表明，細(xì)胞從先祖水平或更基礎(chǔ)或一般化功能至更特異功能。
轉(zhuǎn)分化—用來表明，細(xì)胞從確定功能水平轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N水平。
去分化—用來表明，細(xì)胞從確定功能水平至較不確定功能水平或基礎(chǔ)細(xì)胞。
全能的—能夠發(fā)育為完全生物或分化為任何它的細(xì)胞或組織。
多能的—1發(fā)育潛能不固定具有發(fā)育可塑性例如多能細(xì)胞或多能胚胎組織。2能夠影響一種以上的器官或組織。
生長因子(GF)—包括可誘導(dǎo)細(xì)胞復(fù)制的許多化合物。有一般的生長因子例如表皮生長因子(EGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。還有它們的作用更特異的生長因子。(例如胰島素樣生長因子1(IGF1)對胰島的作用，或促紅細(xì)胞素對紅血細(xì)胞祖細(xì)胞的作用)。
分化因子(DF)—包括可誘導(dǎo)細(xì)胞型特異分化的許多化合物。用于胰島細(xì)胞、腺泡細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞的特異分化因子。用于腺泡細(xì)胞的例子是地塞米松。
去分化因子(DDF)—包括用于胰島細(xì)胞、腺泡細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞的許多因子，它們允許細(xì)胞失去分化的功能和轉(zhuǎn)變?yōu)樽V系中更低的功能水平。
基質(zhì)—用來定義水凝膠或可聚合物質(zhì)，它們使細(xì)胞保持在適當(dāng)?shù)奈恢?，用于在不同條件下的培養(yǎng)。這些包括MATRIGEL、膠原、藻酸鹽和其他。
組織培養(yǎng)瓶、皿或平板基層—用來定義特定類型的塑料或玻璃表面，該表面成形為用于生長細(xì)胞的組織培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板。制備這些表面以便它們促進或阻礙貼壁或非貼壁細(xì)胞生長。
包被的培養(yǎng)瓶、皿或平板表面—被化合物薄層包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿。
懸浮培養(yǎng)—在不存在任何來自化合物薄層或任何基質(zhì)的支持下，將細(xì)胞懸浮在組織培養(yǎng)基中。
α-生育酚—幾種脂溶性維生素的任何一種，這些脂溶性維生素化學(xué)上是生育酚類，在各種脊椎動物的營養(yǎng)中是必需的，脊椎動物中它們的缺乏與不生育、肌肉中退化性改變或血管異常有關(guān)，特別存在于小麥胚芽、植物油、卵黃和綠葉蔬菜中或合成制造，以及主要在動物飼料中和作為抗氧化劑被使用。
脫鐵運鐵蛋白—由少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，它對細(xì)胞存活來說是必需的并且參與細(xì)胞分化。
心房肽—一種強排鈉利尿和血管舒張肽或衍生自共同前體并由心房分泌的不同大小低分子量肽的混合物。所有這些肽共同具有一段大約20個氨基酸的序列。
生物素—尤其存在于酵母、肝臟和卵黃中的維生素B復(fù)合體的無色晶體生長維生素C10H16N2O3S。
BSA—(牛)血清白蛋白，是一種占大約一半血清蛋白質(zhì)的單體蛋白質(zhì)。在體內(nèi)，它在穩(wěn)定細(xì)胞外液容積中起作用和起類固醇、脂肪酸和一些激素載體的作用。
C鈉尿肽(CNP)—一種22個氨基酸的肽，為排鈉利尿肽家族中的一員。它來自內(nèi)皮和腎細(xì)胞源，具有選擇性心血管作用。
CAII-II型碳酸酐酶，被導(dǎo)管細(xì)胞用來產(chǎn)生碳酸氫鹽的酶，其被分泌到胰管中以中和由胃產(chǎn)生的十二指腸中的酸。
泛酸鈣—白色粉末狀鹽C18H32CaN2O10，合成制造并用作泛酸的來源。
肉堿—季銨化合物C7H15NO3，特別存在于脊椎動物肌肉中并參與脂肪酸跨線粒體膜的轉(zhuǎn)移。
過氧化氫酶—由具有高鐵血紅素基團的蛋白質(zhì)復(fù)合物組成并催化過氧化氫分解成水和氧的酶。
CCK—縮膽囊素，是一種腦和腸肽。在腸中，它誘導(dǎo)胰酶釋放和膽囊收縮。它具有刺激胰島素分泌的能力。CCK肽以多種分子形式(例如，硫酸化CCK8、未硫酸化CCK8和CCK4)存在，各自由CCK基因產(chǎn)物的不同轉(zhuǎn)錄后加工產(chǎn)生。
CFTR—囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)，起氯離子通道的作用。已發(fā)現(xiàn)CFTR基因中的突變引起囊性纖維化。CFTR中的突變影響胰、腸腺、膽汁樹、支氣管腺和汗腺中的外分泌功能。
CGRPα，(降鈣素基因相關(guān)肽)—測定血液中激素降鈣素的量的試劑。
霍亂毒素B亞單位—霍亂毒素的無毒性亞單位B對蛋白質(zhì)復(fù)合物是重要的，因為它允許蛋白質(zhì)通過神經(jīng)節(jié)苷脂GM1的五糖鏈與細(xì)胞表面結(jié)合。
CK19—細(xì)胞角蛋白19，是已知最小(40-kD)的酸性角蛋白，水不溶性中間絲家族中的一員。不同的細(xì)胞角蛋白可被用作鑒別某些類型上皮和上皮腫瘤的標(biāo)記。CK19角蛋白存在于許多類型上皮細(xì)胞中，包括許多導(dǎo)管上皮和腺上皮。在胰中，它存在于導(dǎo)管上皮中，在內(nèi)分泌和外分泌細(xì)胞中不存在。
CK19+細(xì)胞—在培養(yǎng)中的上皮細(xì)胞中，特別是，在來自胰組織的“中間的”或轉(zhuǎn)分化細(xì)胞中表達細(xì)胞角蛋白19。
皮質(zhì)類固醇—各種腎皮質(zhì)甾類(例如皮質(zhì)酮、可的松和醛固酮)中的任何一種，基于它們主要生物活性，將它們分為糖皮質(zhì)類固醇和鹽皮質(zhì)類固醇。
皮質(zhì)酮—腎皮質(zhì)的無色晶體皮質(zhì)類固醇C21H30O4，它在蛋白質(zhì)和碳水化合物代謝中是重要的。
皮質(zhì)酮(Reichstein’s物質(zhì)H)—腎皮質(zhì)的無色晶體皮質(zhì)類固醇C21H30O4，它在蛋白質(zhì)和碳水化合物代謝中是重要的。
C-肽—c-肽(“連接”肽)是一種在胰島素原轉(zhuǎn)化為成熟胰島素后釋放的短多肽。它的分子量是3,582Da。
Cyclodextran—2-羥基丙基-β-環(huán)糊精。一種促進疏水性物質(zhì)溶解的組織培養(yǎng)基添加劑。
DIF-1/Differanisole A—分化-誘導(dǎo)因子-1(DIF-1)是分離自盤基網(wǎng)柄菌屬(Dictyostelium)的氯化己芬酮(hexaphenone)。DIF-1在多種類型哺乳動物腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出抗腫瘤活性，盡管潛在的機制還不知道。Dictyostelium discoideum的形態(tài)發(fā)生素，DIF-1的結(jié)構(gòu)與Differanisole A的結(jié)構(gòu)密切相似，已從簡單真核生物，Chaetomium的代謝物中分離了Differanisole A，作為鼠和人未分化腫瘤細(xì)胞的分化誘導(dǎo)劑。
DL-α-生育酚乙酸酯—具有高維生素E效能的生育酚C29H50O2。
DMF(n-n-二甲基甲酰胺)—影響細(xì)胞分化。酸化速率的抑制可能是由于減少的代謝性酸產(chǎn)生。H+產(chǎn)生和轉(zhuǎn)運的改變促成它對細(xì)胞分化的作用。
DMSO—二甲基亞砜(CH3)2SO—它是一種已知誘導(dǎo)細(xì)胞分化的試劑，也是一種溶劑，還是一種用于冷凍活細(xì)胞的冷凍保護劑，還是一種用于治療間隙膀胱炎的抗炎劑。
DMSO(二甲基亞砜)—一種用于治療間隙膀胱炎的抗炎劑(CH3)2SO。
EGF—表皮生長因子，是一種用于許多外胚層和中胚層起源的培養(yǎng)細(xì)胞的強促有絲分裂因子，體內(nèi)對特異細(xì)胞的分化具有顯著作用，成熟EGF是一種由53個氨基酸組成和分子量為約6,000的單鏈多肽。
內(nèi)皮縮血管肽1—由21個氨基酸殘基組成的多種多肽中的任何一種，在不同細(xì)胞和組織中產(chǎn)生這些多肽，它們在調(diào)節(jié)血管舒縮活性、細(xì)胞增殖和激素產(chǎn)生中起作用，以及與血管疾病的發(fā)展有關(guān)聯(lián)。
乙醇胺—無色液體氨基醇C2H7NO，特別用作脂肪和油的溶劑，—也稱為單乙醇胺。
Exendin 4—GLP-1的長效類似物FACS—熒光激活的細(xì)胞分選術(shù)
FCS—胎牛血清。從未出生的?；厥盏难濉?br> FGF—FGF超家族由23個已知成員組成，他們?nèi)亢幸粋€保守的120個氨基酸的區(qū)域。最初認(rèn)為FGFs具有增殖活性；現(xiàn)在認(rèn)為它們在發(fā)育、血管發(fā)生、血細(xì)胞形成和腫瘤發(fā)生中起作用。幾乎所有的FGFs同種型都具有激活其它同種型的受體的能力。這解釋了由不同F(xiàn)GF亞型產(chǎn)生的類似效果。
FGF2—成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF-堿性的)是一種廣譜促有絲分裂、血管發(fā)生和神經(jīng)營養(yǎng)因子，它在許多組織和細(xì)胞型中被低水平表達?，F(xiàn)認(rèn)為FGF2與許多生理和病理過程，包括肢發(fā)育、血管發(fā)生、創(chuàng)傷愈合和腫瘤生長有關(guān)聯(lián)。
半乳糖—一種光學(xué)活性糖C6H12O6，比葡萄糖溶解性更差和甜度更小，已知呈右旋、左旋和外消旋形式。
GLP-1—胰高血糖素樣肽1是一種衍生自前胰高血糖素原分子的30個氨基酸的肽。GLP-1增強葡萄糖分泌和合成。它使胰β細(xì)胞“有葡萄糖活性”并可適用于非胰島素依賴性糖尿病的治療。
GLP-2—GLP-2是一種33個氨基酸的胰高血糖素原衍生的肽。GLP-2通過對胃游動性與養(yǎng)分吸收、隱窩細(xì)胞增殖和凋亡和腸通透性的作用維持腸粘膜上皮細(xì)胞的完整性。
葡萄糖—一種光學(xué)活性糖C6H12O6，它具有醛式羰基。對所有植物和動物細(xì)胞而言，碳水化合物，特別是葡萄糖的斷裂是能量的主要來源。在糖尿病中，將葡萄糖轉(zhuǎn)運到身體細(xì)胞中的能力減小。血糖水平異常地高(高血糖)。升高的血糖可導(dǎo)致酮酸中毒，導(dǎo)致昏迷和死亡。較輕微的高血糖引起侵害眼、腎、神經(jīng)和血管的長期并發(fā)癥。
谷胱甘肽—含有谷氨酸、半胱氨酸、和甘氨酸各一個氨基酸殘基的肽C10H17N3O6S，它廣泛存在于植物和動物組織中，并在生物氧化-還原過程中和作為輔酶起非常重要的作用。
生長激素—生長激素(GH)由腺垂體腺合成。人生長激素的分子量為22,005并含有191個氨基酸殘基，具有2個二硫鍵。生長激素的主要生物作用是出生后的生長控制。它的影響主要由胰島素樣生長因子介導(dǎo)。
GRP(胃泌素釋放肽)—胃泌素釋放肽受體(GRP-R)能引起許多，但不是所有能表達該受體的細(xì)胞的增殖。
Hb9—同源異型框9是以序列特異方式結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)家族中的一員，這些蛋白質(zhì)與發(fā)育和成體組織中基因表達的控制有關(guān)聯(lián)。
HGF—肝細(xì)胞生長因子(也稱為分散因子或hepatopoietin A)具有一系列靶，除上皮細(xì)胞例如肝細(xì)胞以外還包括內(nèi)皮細(xì)胞和黑色素細(xì)胞。它影響多樣組織、介導(dǎo)胚胎中決定肝臟和肌肉發(fā)育的胎盤生長發(fā)育以及B-細(xì)胞增殖和生長。
HNF3α—肝細(xì)胞核因子3，α。叉頭類轉(zhuǎn)錄因子中的一員。HNF 3A和HNF3B二者都在內(nèi)胚層起源的組織，即胃、腸、肝臟和肺中被表達。HNF3家族的所有成員以及HNF4G和HNF6在胰β細(xì)胞中被表達。
HNF6—在小鼠發(fā)育過程中，Hnf6在作為外分泌和內(nèi)分泌胰細(xì)胞的前體的上皮細(xì)胞中被表達。在hnf6缺乏的胚胎中，外分泌胰好像正常但內(nèi)分泌細(xì)胞分化受損。Neurogenin-3，一種測定內(nèi)分泌細(xì)胞前體必需的轉(zhuǎn)錄因子的表達幾乎被廢除。在生命中的后期，內(nèi)分泌細(xì)胞的數(shù)目增加但胰島的結(jié)構(gòu)被干擾，以及β細(xì)胞缺乏葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-2表達。成年hnf6缺乏小鼠為糖尿病鼠。這提示，hnf6控制前體階段胚胎胰內(nèi)分泌分化并正向調(diào)節(jié)內(nèi)分泌原基因ngn3。
HuSA—人血清白蛋白—參見BSA(牛血清白蛋白)。
IBMX—3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，抑制環(huán)AMP磷酸二酯酶的化合物，它引起β細(xì)胞釋放胰島素。
IGF1—胰島素樣生長因子-1。IGF1和IGF2二者都具有與胰島素原的顯著結(jié)構(gòu)同源。
IGF2—胰島素樣生長因子-2。IGF1和IGF2二者都具有與胰島素原的顯著結(jié)構(gòu)同源。
Johe’s N2—為支持多潛能CNS干細(xì)胞而配制的無血清培養(yǎng)基，補充有各種生長和分化因子。
KGF—角質(zhì)細(xì)胞生長因子或FGF-7一種28kDa，單鏈分泌型糖蛋白，它具有限制于上皮細(xì)胞的靶特異性。已知表達FGF-7的成體細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、T細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和卵巢膜細(xì)胞。在胚胎中，在整個間充質(zhì)的許多發(fā)育階段發(fā)現(xiàn)了KGF。
Ki67—一種細(xì)胞增殖標(biāo)記。這種未知功能的蛋白質(zhì)在細(xì)胞周期間的G1期被表達；它具有60-90分鐘的半衰期。
催乳激素—刺激乳汁產(chǎn)生的任何激素(例如催乳素)。
層粘連蛋白—一種糖蛋白，它是結(jié)締組織基底膜的組分并促進細(xì)胞粘著。
亮氨酸-腦啡肽—一種天然肽神經(jīng)遞質(zhì)。最初從豬腦中分離的天然鴉片五肽。亮氨酸-腦啡肽(YGGFL)和甲硫氨酸-腦啡肽(YGGFM)特別強地與d型鴉片受體結(jié)合。
亞油酸(Linoleic acid)—一種液體未飽和脂肪酸C18H32O2，它特別以半干油(如花生油)的形式存在并且對一些動物的營養(yǎng)是必需的—也被稱為亞油酸(linolic acid)。
亞麻酸—一種液體未飽和脂肪酸C18H30O2，它特別以干油(如亞麻子油)的形式存在并且對一些動物的營養(yǎng)是必需的。
甲硫氨酸-腦啡肽—一種天然肽神經(jīng)遞質(zhì)。最初從豬腦中分離的天然鴉片五肽。亮氨酸-腦啡肽(YGGFL)和甲硫氨酸-腦啡肽(YGGFM)特別強地與d型鴉片受體結(jié)合。
Muc-1-1型粘蛋白，通常由特殊胰管細(xì)胞分泌的粘蛋白的主要類型。
肌醇—一種生物活性肌醇，它不是光學(xué)活性的，是維生素B復(fù)合體的組分和親脂劑，它廣泛存在于植物、微生物和包括人的高等動物中—也被稱為肌醇(mesoinositol)。
N2—Johe’s N2培養(yǎng)基。
Neuro—神經(jīng)基質(zhì)培養(yǎng)基，一種中性細(xì)胞培養(yǎng)基。
NGF—神經(jīng)生長因子，是一種12.5kDa，120個氨基酸殘基長的非糖基化多肽。它作為前肽原被合成；它被加工過的形式是120個氨基酸的片段。NGF的典型形式是25kDa，無二硫鍵連接的同型二聚體。已知神經(jīng)生長因子調(diào)節(jié)交感神經(jīng)元和某些感覺神經(jīng)元的生長和分化。
煙酰胺—煙酰胺(煙酸酰胺)，一種苦味晶體堿性酰胺C6H6N2O，它是維生素B復(fù)合體的成員，由煙酸形成并在活生物中被轉(zhuǎn)化成煙酸，通常作為輔酶的組分天然存在，以及與煙酸類似地被應(yīng)用。
PCNA+細(xì)胞—用抗增殖細(xì)胞核抗原標(biāo)記的細(xì)胞。增殖細(xì)胞核抗原最初與細(xì)胞的增殖態(tài)相關(guān)。更近來的證據(jù)表明，PCNA可能還與DNA修復(fù)相關(guān)。
PDGF—血小板衍生生長因子。一種在凝血時由血小板釋放的因子，被顯示能促進各種類型細(xì)胞的生長。后來從血小板純化了這種因子并命名為血小板衍生生長因子(PDGF)?，F(xiàn)已知PDGF由除血小板以外的許多細(xì)胞型產(chǎn)生并且發(fā)現(xiàn)它是幾乎所有間充質(zhì)衍生細(xì)胞，即血液、肌肉、骨/軟骨，和結(jié)締組織細(xì)胞的促分裂原。
pdx-1—胰十二指腸同源框因子-1，PDX-1，是胰發(fā)育、胰島細(xì)胞分化和β細(xì)胞功能的維持所需要的。也被稱為胰島素促進因子-1(IPF1)或IDX1或促生長素抑制素轉(zhuǎn)錄因子-1(STF1)。PDX-1似乎是起外分泌和內(nèi)分泌胰發(fā)育程序表達的主控開關(guān)的作用，如通過基因破壞研究揭示的，在該研究中所述基因的靶向缺失導(dǎo)致無胰表型。最初在外分泌和內(nèi)分泌細(xì)胞中都表達PXDX-1；隨著胰形態(tài)發(fā)生繼續(xù)，它限制于一些導(dǎo)管細(xì)胞和胰島的β和δ細(xì)胞。PDX-1還在成體細(xì)胞中起作用，調(diào)節(jié)胰島素和促生長素抑制素基因。PDX1基因中的突變能引起胰發(fā)育不全，年輕人的成熟發(fā)作糖尿病和可能引起II型糖尿病。
胎盤催乳素—這種肽激素在結(jié)構(gòu)上、免疫學(xué)上和功能上與垂體生長激素類似。它由胎盤合胞滋養(yǎng)層合成。
孕酮—雌甾類性激素C21H30O2，它由黃體分泌以形成植入的子宮內(nèi)膜，以后在懷孕期間由胎盤分泌以防止發(fā)育性胚胎或胎兒的排斥，它以合成形式作為出生控制丸被用于治療月經(jīng)紊亂和減輕一些不育癥的情況。
胰島素原—胰島素的前體。胰島素衍生自折疊、由兩個二硫鍵連接的單鏈前體。通過酶切除連接A鏈的氨基端與B鏈的羧基端的部分使胰島素原轉(zhuǎn)化成胰島素。
促乳素—一種與生長激素結(jié)構(gòu)非常相似的生長因子。
PTF1—參見PDX-1。
PTHRP—甲狀旁腺相關(guān)蛋白。
腐胺—微毒的晶體尸堿C4H12N2，它是通過鳥氨酸的去羧基化而形成的，廣泛但小量存在于活物中，特別存在于腐敗的肉中。
Reg1—再生胰島衍生蛋白Laos，也被稱為胰石蛋白。
視黃酸(維生素A)—細(xì)胞分化的局部調(diào)節(jié)劑。它在發(fā)育肢中具有許多功能，在低等脊椎動物中調(diào)節(jié)肢再生中的關(guān)鍵事件。
乙酸視黃酯—維生素A的衍生物。
硒(亞硒酸)—一種化學(xué)上類似硫和碲的非金屬元素，當(dāng)通過吃一些生長在土壤中的植物而被消化時，在許多動物中引起中毒，它在土壤中大量存在并且以同素異形形式存在，其中灰色穩(wěn)定形式的導(dǎo)電性隨其照明的強度變化而變化，因而被用于電子裝置中。
Sonic Hedgehog(小鼠，重組的)—在包括腦、骨、皮膚、生殖腺和肺的許多細(xì)胞型的發(fā)育中起非常重要的作用。
大豆胰蛋白酶抑制劑(I-S型)—一種含有198個氨基酸殘基的高分子量蛋白質(zhì)(大約22,500)。大豆胰蛋白酶抑制劑抑制蛋白水解活性但不抑制彈性水解(elastolytic)活性。
P物質(zhì)—P物質(zhì)是受傷害感受傳入的高強度刺激時在初級傳入-二級神經(jīng)元突觸釋放的優(yōu)勢神經(jīng)肽。通過NK1受體的激活(參見傷害感受部分中的表)，P物質(zhì)產(chǎn)生二級神經(jīng)元緩慢、持續(xù)時間長的去極化。這導(dǎo)致對傷害感受器刺激的突觸后反應(yīng)的增強，由此起傷害感受傳遞的強度編碼機制的作用。
超氧化物歧化酶(SOD)—一種含金屬的抗氧化酶，它潛在地減少在正常代謝細(xì)胞對氧和過氧化氫加工過程中形成的有害氧自由基。
TGFα和β—轉(zhuǎn)化生長因子(TGFs)是生物活性多肽，它們可逆地在培養(yǎng)細(xì)胞上賦予轉(zhuǎn)化表型。α-TGF表現(xiàn)出與表皮生長因子大約40％序列同源性。TGFβ是一種多功能肽，它在許多細(xì)胞型中控制增殖、分化和其它功能。TGFB與TGFA在誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化中協(xié)同作用。它還起負(fù)自分泌生長因子的作用。TGFB激活和信號傳導(dǎo)的失調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。許多細(xì)胞合成TGFB以及幾乎它們?nèi)烤哂羞@種肽的特異受體。TGFB1、TGFB2和TGFB3全部通過相同受體信號系統(tǒng)發(fā)揮作用。
TGFβsRII(2型可溶解受體)—TGFβ調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和增殖，阻止許多細(xì)胞型的生長。TGF-β受體包括1型和2型亞單位，這兩種亞單位是絲氨酸-蘇氨酸激酶并且通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑的SMAD家族進行信號傳導(dǎo)。TGF-β信號傳導(dǎo)中的缺陷，包括SMADs中的突變，與人類中的癌有關(guān)。
轉(zhuǎn)錄因子(TF)—轉(zhuǎn)錄因子與DNA中的特異調(diào)節(jié)序列結(jié)合并調(diào)控RNA聚合酶的活性。這是調(diào)節(jié)DNA中編碼的基因被復(fù)制或轉(zhuǎn)錄為信息RNA過程的關(guān)鍵步驟。正常情況下，許多不同轉(zhuǎn)錄因子的相互作用決定不同細(xì)胞型的特異表型。轉(zhuǎn)錄因子可以為基因表達的正或負(fù)調(diào)節(jié)劑。PDX1、neurogenin 3(ngn3)、Pax4、Pax6和其它是那些參與胰發(fā)育和分化的轉(zhuǎn)錄因子的實例。
運鐵蛋白—在體內(nèi)能夠與鐵離子結(jié)合并轉(zhuǎn)運鐵的血漿中的β球蛋白。
三碘甲腺原氨酸—一種晶體含碘激素C15H12I3NO4，它是一種由甲狀腺素衍生的氨基酸并呈其可溶鈉鹽形式尤其被用于治療甲狀腺功能減退和代謝機能不全—也被稱為碘塞羅寧(liothyronine)，T3。
三碘甲腺原氨酸(T3)—一種晶體含碘激素C15H12I3NO4，它是一種由甲狀腺素衍生的氨基酸并呈其可溶鈉鹽形式尤其被用于治療甲狀腺功能減退和代謝機能不全。
Trolox(可溶性維生素E)—維生素E的細(xì)胞可透性、水可溶性衍生物，具有強抗氧化性質(zhì)。防止大鼠胸腺細(xì)胞中的過硝酸鹽介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。
血管活性腸肽(VIP)—一種測定血清中VIP量的試劑。
VEGF—血管內(nèi)皮生長因子—VEGF是一種肝素結(jié)合糖蛋白，它以45kDa的同型二聚體被分泌。是內(nèi)皮細(xì)胞最重要的生長和存活因子之一。它在結(jié)構(gòu)上與血小板衍生生長因子有關(guān)。VEGF誘導(dǎo)血管發(fā)生和內(nèi)皮細(xì)胞增殖并且它在調(diào)節(jié)血管發(fā)生中起重要作用。許多類型細(xì)胞，但通常不是內(nèi)皮細(xì)胞它們本身，分泌VEGF。
硫酸鋅—鋅是一種重要的痕量礦物質(zhì)并且為細(xì)胞分裂、細(xì)胞生長和創(chuàng)傷愈合必需酶的活性所需。鋅還參與碳水化合物的代謝。胰β細(xì)胞具有高鋅含量。
發(fā)明概述在一種實施方案中，本發(fā)明涉及一種使分化的非激素產(chǎn)生胰細(xì)胞轉(zhuǎn)化為分化的激素產(chǎn)生細(xì)胞的方法，該方法包括步驟a)在一定條件下在第一細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中用第一細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)分化的非激素產(chǎn)生胰細(xì)胞，所述第一細(xì)胞培養(yǎng)基包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基、有或無血清，以及有或無生長因子，在該條件下分化的非激素產(chǎn)生胰細(xì)胞轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞；和b)在一定條件下在第二細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中用第二細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)所述干細(xì)胞，所述第二細(xì)胞培養(yǎng)基包含選自A組的至少一種化合物和選自B組的至少一種化合物，其中A組包括下列化合物β動物纖維素(Betacellulin)、活化素A、BMP-2、TGF-β SRII、DMSO、SonicHedgehog、層粘連蛋白、甲硫氨酸-腦啡肽、DMF和霍亂毒素A；以及其中B組包括下列化合物活化素A、心房肽、β動物纖維素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-4)、C鈉尿肽(CNP)、雨蛙肽(caerulein)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP-α)、縮膽囊素(CCK8-酰胺)、縮膽囊素八肽(硫酸化CCK8)、霍亂毒素B亞單位、皮質(zhì)酮(Reichstein’s物質(zhì)H)、地塞米松、DIF-1、Differanisole A、二甲亞砜(DMSO)、EGF、內(nèi)皮縮血管肽1、Exendin 4、FGF酸式、FGF2、FGF7、FGFb、胃泌素I、胃泌素釋放肽(GRP)、胰高血糖素樣肽1(GLP-1)、葡萄糖、生長激素、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、IGF-1、IGF-2、胰島素、KGF、催乳激素、層粘連蛋白、亮氨酸-腦啡肽、白血病抑制因子(LIF)、甲硫氨酸-腦啡肽、正丁酸、神經(jīng)生長因子(β-NGF)、煙酰胺、n-n-二甲基甲酰胺(DMF)、甲狀旁腺素釋放肽(Pth II RP)、PDGF AA+PDGFBB混合物、PIGF(胎盤GF)、孕酮、促乳素、腐胺二氫氯化物γ照射的細(xì)胞培養(yǎng)物、REG1、視黃酸、硒、亞硒酸、Sonic Hedgehog、大豆胰蛋白酶抑制劑、P物質(zhì)、超氧化物歧化酶(SOD)、TGF-α、TGF-βsRII、TGF-β1、運鐵蛋白、三碘甲腺原氨酸(T3)、Trolox、血管活性腸肽(VIP)、VEGF、維生素A和維生素E，在此條件下，所述干細(xì)胞分化為激素產(chǎn)生細(xì)胞。
在一種優(yōu)選的實施方案中，所述第二細(xì)胞培養(yǎng)基包括選自A組的至少兩種化合物和選自B組的至少兩種化合物。
在一種更優(yōu)選的實施方案中，所述第二細(xì)胞培養(yǎng)基包括選自A組的至少三種化合物和選自B組的至少三種化合物。
在還一種更優(yōu)選的實施方案中，所述第二細(xì)胞培養(yǎng)基包括選自A組的至少四種化合物和選自B組的至少四種化合物。
在還一種更優(yōu)選的實施方案中，所述第二細(xì)胞培養(yǎng)基包括選自A組的至少五種化合物和選自B組的至少五種化合物。
在還一種更優(yōu)選的實施方案中，所述第二細(xì)胞培養(yǎng)基包括選自A組的至少六種化合物和選自B組的至少六種化合物。
在一種實施方案中，本發(fā)明涉及一種將干細(xì)胞培養(yǎng)為分化的激素產(chǎn)生細(xì)胞的方法，該方法包括在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中用細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)所述干細(xì)胞，其中所述干細(xì)胞被分化為激素產(chǎn)生性細(xì)胞以及其中所述培養(yǎng)基包括無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基并且還包括選自A組的至少一種化合物和選自B組的至少一種化合物，其中A組包括下列化合物β動物纖維素、活化素A、BMP-2、TGF-βSRII、DMSO、Sonic Hedgehog、層粘連蛋白、甲硫氨酸-腦啡肽、DMF和霍亂毒素A；以及其中組B包括下列化合物活化素A、心房肽、β動物纖維素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-4)、C鈉尿肽(CNP)、雨蛙肽、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP-α)、縮膽囊素(CCK8-酰胺)、縮膽囊素八肽(硫酸化CCK8)、霍亂毒素B亞單位、皮質(zhì)酮(Reichstein’s物質(zhì)H)、地塞米松、DIF-1、Differanisole A、二甲亞砜(DMSO)、EGF、內(nèi)皮縮血管肽1、Exendin 4、FGF酸式、FGF2、FGF7、FGFb、胃泌素I、胃泌素釋放肽(GRP)、胰高血糖素樣肽1(GLP-1)、葡萄糖、生長激素、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、IGF-1、IGF-2、胰島素、KGF、催乳激素、層粘連蛋白、亮氨酸-腦啡肽、白血病抑制因子(LIF)、甲硫氨酸-腦啡肽、正丁酸、神經(jīng)生長因子(β-NGF)、煙酰胺、n-n-二甲基甲酰胺(DMF)、甲狀旁腺素釋放肽(Pth II RP)、PDGF AA+PDGF BB混合物、PIGF(胎盤GF)、孕酮、促乳素、腐胺二氫氯化物γ照射的細(xì)胞培養(yǎng)物、REG1、視黃酸、硒、亞硒酸、Sonic Hedgehog、大豆胰蛋白酶抑制劑、P物質(zhì)、超氧化物歧化酶(SOD)、TGF-α、TGF-βsRII、TGF-β1、運鐵蛋白、三碘甲腺原氨酸(T3)、Trolox、血管活性腸肽(VIP)、VEGF、維生素A和維生素E。
在一種優(yōu)選的實施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基包括選自A組的至少兩種化合物和選自B組的至少兩種化合物。
在還一種優(yōu)選的實施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基包括選自A組的至少三種化合物和選自B組的至少三種化合物。
在還一種優(yōu)選的實施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基包括選自A組的至少四種化合物和選自B組的至少四種化合物。
在還一種優(yōu)選的實施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基包括選自A組的至少五種化合物和選自B組的至少五種化合物。
在還一種優(yōu)選的實施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基包括選自A組的至少六種化合物和選自B組的至少六種化合物。
附圖簡要說明

圖1.從在組合陣列的生長和分化因子的存在下，在藻酸鹽中培養(yǎng)的細(xì)胞中的胰島素釋放。供體#2212、#2278和#3023。
圖2.從在組合陣列的生長和分化因子的存在下，在藻酸鹽中培養(yǎng)的細(xì)胞中的胰島素釋放的刺激指數(shù)。供體#2212、#2278和#3023。
圖3.從在前八種生長和分化因子組合(A-H)的存在下，在藻酸鹽中培養(yǎng)的細(xì)胞中的胰島素釋放。供體#2212圖4.從在前八種生長和分化因子組合(A-H)的存在下，在藻酸鹽中培養(yǎng)的細(xì)胞中的胰島素釋放的刺激指數(shù)。供體#2212圖5.從在前八種生長和分化因子組合(A-H)的存在下，在藻酸鹽中培養(yǎng)的細(xì)胞中的胰島素釋放。供體#2278圖6.從在前八種生長和分化因子組合(A-H)的存在下，在藻酸鹽中培養(yǎng)的細(xì)胞中的胰島素釋放的刺激指數(shù)。供體#2278圖7.從在前八種生長和分化因子組合(A-H)的存在下，在藻酸鹽中培養(yǎng)的細(xì)胞中的胰島素釋放。供體#3023圖8.從在前八種生長和分化因子組合(A-H)的存在下，在藻酸鹽中培養(yǎng)的細(xì)胞中的胰島素釋放的刺激指數(shù)。供體#3023圖9.從在前八種生長和分化因子組合(A-H)的存在下，在藻酸鹽中培養(yǎng)的細(xì)胞中的胰島素釋放。供體#3036圖10.從在前八種生長和分化因子組合(A-H)的存在下，在藻酸鹽中培養(yǎng)的細(xì)胞中的胰島素釋放的刺激指數(shù)。供體#3036圖11.從在前八種生長和分化因子組合(A-H)的存在下，在藻酸鹽中培養(yǎng)的細(xì)胞中的C-肽釋放的刺激指數(shù)。供體#3036圖12.從在前四種生長和分化因子組合(I-L)的存在下，在貼壁培養(yǎng)物中培養(yǎng)的細(xì)胞中的C-肽釋放。
圖13.在第二層30因子篩選中測定的，在前六種生長和分化因子組合的存在下，在貼壁培養(yǎng)物中培養(yǎng)的細(xì)胞的每孔胰島素原陽性細(xì)胞數(shù)。
本發(fā)明和優(yōu)選實施方案詳述在一種實施方案中，本發(fā)明涉及一種由不產(chǎn)生激素的分化細(xì)胞型生產(chǎn)激素產(chǎn)生細(xì)胞的方法。優(yōu)選地，所述分化細(xì)胞型是胰細(xì)胞。優(yōu)選地，所述細(xì)胞是胰島缺失的胰細(xì)胞。更優(yōu)選地，所述分化細(xì)胞型是非激素產(chǎn)生胰細(xì)胞。
在本發(fā)明一方面中產(chǎn)生的激素產(chǎn)生細(xì)胞優(yōu)選產(chǎn)生由胰島細(xì)胞產(chǎn)生的激素的一種或多種。更優(yōu)選地，所述激素產(chǎn)生細(xì)胞產(chǎn)生胰島素。
因此，本發(fā)明的優(yōu)選方面是用于非激素產(chǎn)生胰細(xì)胞大規(guī)模擴展和非激素產(chǎn)生胰細(xì)胞大規(guī)模轉(zhuǎn)化成激素產(chǎn)生細(xì)胞的方法和組合物。優(yōu)選地，所產(chǎn)生的激素是胰島素，但其它激素也被包含在本發(fā)明內(nèi)，特別是來自胰島細(xì)胞的激素。
在另一種優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供適用于使胰非激素產(chǎn)生胰細(xì)胞轉(zhuǎn)化為激素產(chǎn)生細(xì)胞的方法的組合物。
表5和6列出了可被添加到培養(yǎng)基中的因子，它包括潛在的生長因子和潛在的分化因子。為本公開目的，可相互交換使用術(shù)語“因子”、“組分”和“補充物”。
這些組分、因子和補充物包括但不限于活化素A、心房肽、β動物纖維素(Betacellulin)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-4)、C鈉尿肽(CNP)、雨蛙肽、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP-α)、縮膽囊素(CCK8-酰胺)、縮膽囊素八肽(硫酸化CCK8)、霍亂毒素B亞單位、皮質(zhì)酮(Reichstein’s物質(zhì)H)、地塞米松、DIF-1、Differanisole A、二甲亞砜(DMSO)、EGF、內(nèi)皮縮血管肽1、Exendin4、FGF酸式、FGF2、FGF7、FGFb、胃泌素I、胃泌素釋放肽(GRP)、胰高血糖素樣肽1(GLP-1)、葡萄糖、生長激素、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、IGF-1、IGF-2、胰島素、KGF、催乳激素、層粘連蛋白、亮氨酸-腦啡肽、白血病抑制因子(LIF)、甲硫氨酸-腦啡肽、正丁酸、神經(jīng)生長因子(β-NGF)、煙酰胺、n-n-二甲基甲酰胺(DMF)、甲狀旁腺素釋放肽(Pth II RP)、PDGF AA+PDGF BB混合物、PIGF(胎盤GF)、孕酮、促乳素、腐胺二氫氯化物γ照射的細(xì)胞培養(yǎng)物、REG1、視黃酸、硒、亞硒酸、Sonic Hedgehog、大豆胰蛋白酶抑制劑、P物質(zhì)、超氧化物歧化酶(SOD)、TGF-α、TGF-βsRII、TGF-β1、運鐵蛋白、三碘甲腺原氨酸(T3)、Trolox、血管活性腸肽(VIP)、VEGF、維生素A和維生素E。
關(guān)于活化素A，優(yōu)選的濃度是0.125-1.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是0.25-1ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是0.375-0.75ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是0.45-0.6ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是0.5ng/ml。
關(guān)于心房肽，優(yōu)選的濃度是38.25-459ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是76.5-306ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是114.75-229.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是137.7-183.6ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是153ng/ml。
關(guān)于β動物纖維素，優(yōu)選的濃度是1.25-15ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2.5-10ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是3.75-7.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是4.5-6ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是5ng/ml。
關(guān)于骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)，優(yōu)選的濃度是1.25-15ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2.5-10ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是3.75-7.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是4.5-6ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是5ng/ml。
關(guān)于骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-4)，優(yōu)選的濃度是0.125-1.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是0.25-1ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是0.375-0.75ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是0.45-0.6ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是0.5ng/ml。
關(guān)于C鈉尿肽(CNP)，優(yōu)選的濃度是27.4625-329.55ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是54.925-219.7ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是82.3875-164.775ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是98.865-131.82ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是109.85ng/ml。
關(guān)于雨蛙肽，優(yōu)選的濃度是7.5-90ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是15-60ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是22.5-45ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是27-36ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是30ng/ml。
關(guān)于降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP-α)，優(yōu)選的濃度是47.625-571.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是95.25-381ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是142.875-285.75ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是171.45-228.6ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是190.5ng/ml。
關(guān)于縮膽囊素(CCK8-酰胺)，優(yōu)選的濃度是6.25-75ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是12.5-50ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是18.75-37.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是22.5-30ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是25ng/ml。
關(guān)于縮膽囊素八肽(硫酸化CCK8)，優(yōu)選的濃度是1.425-17.1ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2.85-11.4ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是4.275-8.55ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是5.13-6.84ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是5.7ng/ml。
關(guān)于縮膽囊素八肽(硫酸化CCK8)，優(yōu)選的濃度是3.125-37.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是6.25-25ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是9.375-18.75ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是11.25-15ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是12.5ng/ml。
關(guān)于皮質(zhì)酮(Reichstein’s物質(zhì)H)，優(yōu)選的濃度是0.5-6ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1-4ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.5-3ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.8-2.4ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是2ng/ml。
關(guān)于地塞米松，優(yōu)選的濃度是0.5-6ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1-4ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.5-3ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.8-2.4ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是2ng/ml。
關(guān)于DIF-1，優(yōu)選的濃度是75-900ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是150-600ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是225-450ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是270-360ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是300ng/ml。
關(guān)于Differanisole A，優(yōu)選的濃度是75-900ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是150-600ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是225-450ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是270-360ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是300ng/ml。
關(guān)于二甲亞砜(DMSO)，優(yōu)選的濃度是0.25-3ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是0.5-2ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是0.75-1.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是0.9-1.2ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是1ng/ml。
關(guān)于EGF，優(yōu)選的濃度是1.25-15ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2.5-10ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是3.75-7.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是4.5-6ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是5ng/ml。
關(guān)于內(nèi)皮縮血管肽1，優(yōu)選的濃度是125-1500ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是250-1000ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是375-750ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是450-600ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是500ng/ml。
關(guān)于Exendin 4，優(yōu)選的濃度是5.25-63ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是10.5-42ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是15.75-31.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是18.9-25.2ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是21ng/ml。
關(guān)于FGF酸式，優(yōu)選的濃度是0.625-7.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.25-5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.875-3.75ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2.25-3ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是2.5ng/ml。
關(guān)于FGF2，優(yōu)選的濃度是0.625-7.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.25-5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.875-3.75ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2.25-3ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是2.5ng/ml。
關(guān)于FGF7，優(yōu)選的濃度是0.625-7.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.25-5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.875-3.75ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2.25-3ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是2.5ng/ml。
關(guān)于FGFb，優(yōu)選的濃度是0.625-7.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.25-5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.875-3.75ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2.25-3ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是2.5ng/ml。
關(guān)于胃泌素I，優(yōu)選的濃度是0.008038-0.09645ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是0.016075-0.0643ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是0.024113-0.048225ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是0.028935-0.03858ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是0.03215ng/ml。
關(guān)于胃泌素釋放肽(GRP)，優(yōu)選的濃度是35.75-429ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是71.5-286ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是107.25-214.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是128.7-171.6ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是143ng/ml。
關(guān)于胰高血糖素樣肽1(GLP-1)，優(yōu)選的濃度是8.25-99ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是16.5-66ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是24.75-49.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是29.7-39.6ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是33ng/ml。
關(guān)于葡萄糖，優(yōu)選的濃度是270-3240ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是540-2160ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是810-1620ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是972-1296ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是1080ng/ml。
關(guān)于生長激素，優(yōu)選的濃度是6.25-75ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是12.5-50ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是18.75-37.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是22.5-30ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是25ng/ml。
關(guān)于肝細(xì)胞生長因子(HGF)，優(yōu)選的濃度是0.625-7.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.25-5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.875-3.75ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2.25-3ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是2.5ng/ml。
關(guān)于IGF-1，優(yōu)選的濃度是0.625-7.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.25-5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.875-3.75ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2.25-3ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是2.5ng/ml。
關(guān)于IGF-2，優(yōu)選的濃度是0.625-7.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.25-5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.875-3.75ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2.25-3ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是2.5ng/ml。
關(guān)于胰島素，優(yōu)選的濃度是2375-28500ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是4750-19000ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是7125-14250ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是8550-11400ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是9500ng/ml。
關(guān)于KGF，優(yōu)選的濃度是0.625-7.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.25-5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.875-3.75ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2.25-3ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是2.5ng/ml。
關(guān)于催乳激素，優(yōu)選的濃度是12.5-150ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是25-100ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是37.5-75ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是45-60ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是50ng/ml。
關(guān)于層粘連蛋白，優(yōu)選的濃度是562.5-6750ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1125-4500ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1687.5-3375ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2025-2700ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是2250ng/ml。
關(guān)于亮氨酸-腦啡肽，優(yōu)選的濃度是0.75-9ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.5-6ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2.25-4.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2.7-3.6ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是3ng/ml。
關(guān)于白血病抑制因子(LIF)，優(yōu)選的濃度是0.625-7.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.25-5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.875-3.75ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2.25-3ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是2.5ng/ml。
關(guān)于甲硫氨酸-腦啡肽，優(yōu)選的濃度是0.75-9ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.5-6ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2.25-4.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2.7-3.6ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是3ng/ml。
關(guān)于正丁酸，優(yōu)選的濃度是1135-13620ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2270-9080ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是3405-6810ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是4086-5448ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是4540ng/ml。
關(guān)于神經(jīng)生長因子(β-NGF)，優(yōu)選的濃度是0.625-7.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.25-5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.875-3.75ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2.25-3ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是2.5ng/ml。
關(guān)于煙酰胺，優(yōu)選的濃度是152500-1830000ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是305000-1220000ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是457500-915000ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是549000-732000ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是610000ng/ml。
關(guān)于n-n-二甲基甲酰胺(DMF)，優(yōu)選的濃度是0.25-3×10-6％；還更優(yōu)選的濃度是0.5-2×10-6％；還更優(yōu)選的濃度是0.75-1.5×10-6％；還更優(yōu)選的濃度是0.9-1.2×10-6％；和最優(yōu)選的濃度是1×10-6％。
關(guān)于甲狀旁腺素釋放肽(Pth II RP)，優(yōu)選的濃度是51.5-618ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是103-412ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是154.5-309ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是185.4-247.2ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是206ng/ml。
關(guān)于PDGF AA+PDGF BB混合物，優(yōu)選的濃度是1.25-15ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2.5-10ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是3.75-7.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是4.5-6ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是5ng/ml。
關(guān)于PIGF(胎盤GF)，優(yōu)選的濃度是0.625-7.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.25-5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.875-3.75ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2.25-3ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是2.5ng/ml。
關(guān)于孕酮，優(yōu)選的濃度是0.75-9ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.5-6ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2.25-4.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2.7-3.6ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是3ng/ml。
關(guān)于促乳素，優(yōu)選的濃度是0.3-3.6ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是0.6-2.4ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是0.9-1.8ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.08-1.44ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是1.2ng/ml。
關(guān)于腐胺二氫氯化物γ照射的細(xì)胞培養(yǎng)物，優(yōu)選的濃度是0.025-0.3ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是0.05-0.2ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是0.075-0.15ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是0.09-0.12ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是0.1ng/ml。
關(guān)于REG1，優(yōu)選的濃度是8.1375-97.65ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是16.275-65.1ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是24.4125-48.825ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是29.295-39.06ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是32.55ng/ml。
關(guān)于視黃酸，優(yōu)選的濃度是6.25-75ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是12.5-50ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是18.75-37.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是22.5-30ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是25ng/ml。
關(guān)于硒(亞硒酸)，優(yōu)選的濃度是6.25-75ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是12.5-50ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是18.75-37.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是22.5-30ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是25ng/ml。
關(guān)于Sonic Hedgehog，優(yōu)選的濃度是6.25-75ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是12.5-50ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是18.75-37.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是22.5-30ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是25ng/ml。
關(guān)于大豆胰蛋白酶抑制劑，優(yōu)選的濃度是250-3000ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是500-2000ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是750-1500ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是900-1200ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是1000ng/ml。
關(guān)于P物質(zhì)，優(yōu)選的濃度是1250-15000ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2500-10000ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是3750-7500ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是4500-6000ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是5000ng/ml。
關(guān)于超氧化物歧化酶(SOD)，優(yōu)選的濃度是2.5-30IU/ml；還更優(yōu)選的濃度是5-20IU/ml；還更優(yōu)選的濃度是7.5-15IU/ml；還更優(yōu)選的濃度是9-12IU/ml；和最優(yōu)選的濃度是10IU/ml。
關(guān)于TGF-α，優(yōu)選的濃度是0.25-3ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是0.5-2ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是0.75-1.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是0.9-1.2ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是1ng/ml。
關(guān)于TGF-βsRII，優(yōu)選的濃度是1.25-15ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2.5-10ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是3.75-7.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是4.5-6ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是5ng/ml。
關(guān)于TGF-β1，優(yōu)選的濃度是0.125-1.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是0.25-1ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是0.375-0.75ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是0.45-0.6ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是0.5ng/ml。
關(guān)于運鐵蛋白，優(yōu)選的濃度是687.5-8250ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1375-5500ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2062.5-4125ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2475-3300ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是2750ng/ml。
關(guān)于三碘甲腺原氨酸(T3)，優(yōu)選的濃度是8.375-100.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是16.75-67ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是25.125-50.25ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是30.15-40.2ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是33.5ng/ml。
關(guān)于Trolox，優(yōu)選的濃度是156.25-1875ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是312.5-1250ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是468.75-937.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是562.5-750ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是625ng/ml。
關(guān)于血管活性腸肽(VIP)，優(yōu)選的濃度是16.625-199.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是33.25-133ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是49.875-99.75ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是59.85-79.8ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是66.5ng/ml。
關(guān)于VEGF，優(yōu)選的濃度是0.625-7.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.25-5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是1.875-3.75ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是2.25-3ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是2.5ng/ml。
關(guān)于維生素A，優(yōu)選的濃度是6.25-75ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是12.5-50ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是18.75-37.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是22.5-30ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是25ng/ml。
關(guān)于可溶性維生素E，優(yōu)選的濃度是156.25-1875ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是312.5-1250ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是468.75-937.5ng/ml；還更優(yōu)選的濃度是562.5-750ng/ml；和最優(yōu)選的濃度是625ng/ml。
在一種實施方案中，在細(xì)胞培養(yǎng)基中用懸浮、貼壁或基質(zhì)的模式培養(yǎng)干細(xì)胞，所述培養(yǎng)基含有或不含血清，含有表1任一欄中所列的化合物。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)模式是MATRIGEL，膠原、水凝膠或其它可交聯(lián)凝膠基質(zhì)。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)模式是水凝膠基質(zhì)。最優(yōu)選地，所述培養(yǎng)模式是藻酸鹽基質(zhì)。
在一種實施方案中，在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞，所述培養(yǎng)基含有或不含血清，含有表1，A欄中所列出的化合物。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少一種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少兩種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少三種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少四種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少五種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少六種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少七種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少八種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少九種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少十種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少11種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少12種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少13種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少14種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少15種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少16種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少17種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少18種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少19種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少20種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少21種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少22種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少23種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少24種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少25種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少26種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少27種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列因子和補充物的至少28種。最優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，A欄中所列出的全部因子和補充物。
在一種實施方案中，在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞，所述培養(yǎng)基含有或不含血清，含有表1，B欄中所列出的化合物。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少一種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少兩種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少三種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少四種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少五種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少六種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少七種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少八種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少九種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少十種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少11種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少12種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少13種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少14種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少15種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少16種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少17種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少18種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少19種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少20種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少21種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少22種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少23種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少24種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少25種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少26種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少27種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少28種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少29種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少30種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列因子和補充物的至少31種。最優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，B欄中所列出的全部因子和補充物。
在一種實施方案中，在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞，所述培養(yǎng)基含有或不含血清，含有表1，C欄中所列出的化合物。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少一種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少兩種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少三種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少四種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少五種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少六種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少七種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少八種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少九種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少十種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少11種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少12種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少13種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少14種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少15種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少16種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少17種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少18種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少19種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少20種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少21種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少22種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少23種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少24種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少25種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少26種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列因子和補充物的至少27種。最優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，C欄中所列出的全部因子和補充物。
在一種實施方案中，在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞，所述培養(yǎng)基含有或不含血清，含有表1，D欄中所列出的化合物。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少一種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少兩種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少三種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少四種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少五種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少六種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少七種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少八種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少九種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少十種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少11種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少12種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少13種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少14種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少15種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少16種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少17種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少18種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少19種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少20種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少21種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少22種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，D欄中所列因子和補充物的至少23種。最優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，D欄中所列出的全部因子和補充物。
在一種實施方案中，在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞，所述培養(yǎng)基含有或不含血清，含有表1，E欄中所列出的化合物。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少一種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少兩種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少三種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少四種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少五種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少六種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少七種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少八種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少九種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少十種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少11種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少12種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少13種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少14種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少15種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少16種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少17種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少18種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少19種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少20種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少21種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少22種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少23種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少24種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少25種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少26種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少27種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少28種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少29種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少30種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少31種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列因子和補充物的至少32種。最優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，E欄中所列出的全部因子和補充物。
在一種實施方案中，在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞，所述培養(yǎng)基含有或不含血清，含有表1，F(xiàn)欄中所列出的化合物。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少一種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少兩種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少三種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少四種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少五種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少六種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少七種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少八種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少九種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少十種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少11種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少12種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少13種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少14種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少15種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少16種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少17種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少18種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少19種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少20種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少21種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少22種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少23種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少24種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少25種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少26種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少27種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少28種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少29種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少30種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少31種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列因子和補充物的至少32種。最優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，F(xiàn)欄中所列出的全部因子和補充物。
在一種實施方案中，在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞，所述培養(yǎng)基含有或不含血清，含有表1，G欄中所列出的化合物。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少一種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少兩種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少三種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少四種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少五種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少六種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少七種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少八種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少九種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少十種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少11種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少12種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少13種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少14種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少15種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少16種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少17種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少18種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少19種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少20種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少21種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少22種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少23種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少24種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少25種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少26種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少27種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少28種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列因子和補充物的至少29種。最優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，G欄中所列出的全部因子和補充物。
在一種實施方案中，在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞，所述培養(yǎng)基含有或不含血清，含有表1，H欄中所列出的化合物。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少一種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少兩種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少三種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少四種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少五種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少六種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少七種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少八種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少九種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少十種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少11種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少12種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少13種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少14種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少15種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少16種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少17種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少18種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少19種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少20種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少21種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少22種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少23種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少24種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少25種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少26種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少27種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少28種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少29種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少30種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少31種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少32種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列因子和補充物的至少33種。最優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表1，H欄中所列出的全部因子和補充物。
在一種實施方案中，在細(xì)胞培養(yǎng)基中用懸浮、貼壁或基質(zhì)的模式培養(yǎng)干細(xì)胞，所述培養(yǎng)基含有或不含血清，含有表2任一欄中所列的化合物。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)模式是貼壁。最優(yōu)選地，所述培養(yǎng)模式是藻酸鹽貼壁。
在一種實施方案中，在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞，所述培養(yǎng)基含有或不含血清，含有表2，I欄中所列出的化合物。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少一種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少兩種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少三種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少四種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少五種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少六種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少七種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少八種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少九種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少十種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少11種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少12種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少13種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少14種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少15種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少16種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少17種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少18種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少19種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少20種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少21種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少22種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少23種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少24種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少25種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少26種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少27種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少28種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少29種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少30種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少31種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列因子和補充物的至少32種。最優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，I欄中所列出的全部因子和補充物。
在一種實施方案中，在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞，所述培養(yǎng)基含有或不含血清，含有表2，J欄中所列出的化合物。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少一種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少兩種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少三種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少四種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少五種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少六種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少七種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少八種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少九種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少十種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少11種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少12種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少13種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少14種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少15種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少16種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少17種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少18種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少19種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少20種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少21種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少22種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少23種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少24種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少25種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少26種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少27種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少28種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少29種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少30種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列因子和補充物的至少31種。最優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，J欄中所列出的全部因子和補充物。
在一種實施方案中，在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞，所述培養(yǎng)基含有或不含血清，含有表2，K欄中所列出的化合物。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少一種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少兩種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少三種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少四種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少五種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少六種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少七種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少八種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少九種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少十種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少11種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少12種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少13種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少14種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少15種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少16種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少17種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少18種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少19種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少20種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少21種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少22種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少23種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少24種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少25種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少26種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少27種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少28種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少29種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列因子和補充物的至少30種。最優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，K欄中所列出的全部因子和補充物。
在一種實施方案中，在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞，所述培養(yǎng)基含有或不含血清，含有表2，L欄中所列出的化合物。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少一種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少兩種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少三種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少四種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少五種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少六種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少七種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少八種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少九種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少十種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少11種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少12種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少13種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少14種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少15種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少16種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少17種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少18種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少19種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少20種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少21種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少22種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少23種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少24種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少25種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少26種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少27種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少28種。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列因子和補充物的至少29種。最優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基含有表2，L欄中所列出的全部因子和補充物。
實施例實施例1胰細(xì)胞的順序培養(yǎng)先在藻酸鹽中，然后懸浮培養(yǎng)在含有1.6％藻酸鹽，補充有導(dǎo)致干細(xì)胞產(chǎn)生的10％FBS、胰島素、運鐵蛋白、硒和EGF的由DMEM混合物和Ham’s F12營養(yǎng)混合物組成的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)胰細(xì)胞6-12天。通過解聚作用從藻酸鹽珠中收獲干細(xì)胞，然后在補充有120種組合排列中的60種生長和分化因子的組合的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在超低貼壁板(Costar)中懸浮培養(yǎng)11天。在培養(yǎng)期結(jié)束時，細(xì)胞進行24小時基礎(chǔ)葡萄糖培養(yǎng)基(5mM葡萄糖)、20mM葡萄糖或20mM葡萄糖+IBMX的攻擊。收獲上清液并用ELISA進行胰島素含量分析。洗滌并溶解細(xì)胞然后用picogreen試驗測定每孔的DNA含量。通過從在單獨用葡萄糖或葡萄糖與IBMX組合刺激后的孔中上清液中的胰島素含量中減去用基礎(chǔ)培養(yǎng)基刺激的孔中的胰島素含量，計算“胰島素差”。單獨用葡萄糖刺激后產(chǎn)生的上清液的胰島素差為0.007-0.9908ng/孔，而用葡萄糖和IBMX刺激后的為0.0098-1.1523ng/孔。如通過所述胰島素差計算的，許多孔產(chǎn)生低水平的胰島素。與在添加組合排列中的因子以前測定的對照孔和在沒有另外的生長和分化因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的對照孔相比，少數(shù)孔產(chǎn)生顯著量的胰島素。
這些數(shù)據(jù)表明，為了促進胰干細(xì)胞向胰島素產(chǎn)生細(xì)胞的分化，選擇特定的生長和分化因子可與不同的培養(yǎng)模式結(jié)合使用。
實施例2干細(xì)胞的順序培養(yǎng)先在藻酸鹽中，然后貼壁培養(yǎng)在含有1.6％藻酸鹽，補充有導(dǎo)致干細(xì)胞產(chǎn)生的10％FBS、胰島素、運鐵蛋白、硒和EGF的由DMEM混合物和Ham’s F12養(yǎng)分混合物組成的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)胰細(xì)胞6-12天。通過解聚作用從藻酸鹽珠中收獲干細(xì)胞，然后在補充有120種組合排列中的60種生長因子的組合的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在貼壁培養(yǎng)物中，在膠原包被板上培養(yǎng)8天。在培養(yǎng)期結(jié)束時，細(xì)胞進行24小時基礎(chǔ)葡萄糖培養(yǎng)基(5mM葡萄糖)、20mM葡萄糖或20mM葡萄糖+1mM IBMX的攻擊。收獲上清液并用ELISA進行胰島素含量分析。洗滌并溶解細(xì)胞然后用picogreen試驗測定每孔的DNA含量。通過從在單獨用葡萄糖或葡萄糖與IBMX組合刺激后的孔中上清液中的胰島素含量中減去用基礎(chǔ)培養(yǎng)基刺激的孔中的胰島素含量，計算“胰島素差”。單獨用葡萄糖刺激后產(chǎn)生的上清液的胰島素差為0.0019-0.9714ng/孔，而用葡萄糖和IBMX刺激后的為0.0052-0.9524ng/孔。如通過所述胰島素差計算的，許多孔產(chǎn)生低水平的胰島素。與在添加組合排列中的因子以前測定的對照孔和在沒有另外的生長和分化因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的對照孔相比，少數(shù)孔產(chǎn)生顯著量的胰島素。
這些數(shù)據(jù)表明，為了促進胰干細(xì)胞向胰島素產(chǎn)生細(xì)胞的分化，選擇特定的生長和分化因子可與不同的培養(yǎng)模式結(jié)合使用。
實施例3干細(xì)胞在藻酸鹽培養(yǎng)物中的培養(yǎng)在含有1.6％藻酸鹽的由補充有導(dǎo)致干細(xì)胞產(chǎn)生的10％FBS、胰島素、運鐵蛋白、硒和EGF的DMEM混合物和Ham’s F12養(yǎng)分混合物組成的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)胰細(xì)胞6-12天。通過解聚作用從藻酸鹽珠中收獲干細(xì)胞，然后將其重新投入1.2％藻酸鹽珠并在補充有120種組合排列中的60種生長因子組合的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)另外7-11天。在培養(yǎng)期結(jié)束時，使細(xì)胞進行基礎(chǔ)葡萄糖培養(yǎng)基(5mM葡萄糖)、20mM葡萄糖或20mM葡萄糖+1mM IBMX的24小時攻擊。收獲上清液并用ELISA進行胰島素和C-肽含量分析。將藻酸鹽珠解聚，洗滌并溶解細(xì)胞，然后用picogreen試驗測定每孔的DNA含量。
用由雙份孔檢查的結(jié)果，檢查了來自4個利用來自4個不同人供體材料的重復(fù)實驗的胰島素和C-肽數(shù)據(jù)。通過將由在葡萄糖或葡萄糖和IBMX存在下孵育誘導(dǎo)的胰島素或C-肽水平與由在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中孵育的孔產(chǎn)生的胰島素或C-肽水平進行比較，鑒別了表現(xiàn)出胰島素釋放一致刺激的孔。對所有孔進行胰島素測試以測定哪個孔的生長和分化因子的組合產(chǎn)生顯著刺激的胰島素釋放圖1中描繪了這些測試的結(jié)果。這些點圖顯示了組合排列中每孔在基礎(chǔ)葡萄糖、高葡萄糖或高葡萄糖加IBMX刺激后的胰島素含量。這些中的許多顯示了具有非常少胰島素的孔，一些孔表現(xiàn)出高胰島素基礎(chǔ)水平以及高刺激和其它孔具有顯著刺激釋放。為有助于挑選最好的孔組合，以基礎(chǔ)除高葡萄糖或以基礎(chǔ)除IBMX計算刺激指數(shù)。這些結(jié)果顯示在圖2中。利用這些結(jié)果，這些清楚地表明了最好孔的多種侯選孔。為測定哪些是所選八種最好的孔，進行了幾種另外的分析。
檢查四個利用來自四個不同供體的細(xì)胞的不同實驗表明，在這些實驗中，存在供體與供體之間的變異。通過來自所有供體的分析測定了八種最好的孔。接著對這些個體供體的每一個進行了比較。圖3中顯示了供體#2212中來自基礎(chǔ)與從IBMX刺激的胰島素釋放。與第0天相比，除孔A、D和E以外，每個最好的孔都具有刺激胰島素的顯著增加。來自這個供體的所有孔在一定程度上具有高基礎(chǔ)胰島素。將結(jié)果用刺激指數(shù)表示(圖4)表明，最好的孔B、C、F、G和H具有最高應(yīng)答。檢查供體#2278的結(jié)果，在第0、7和14天，來自基礎(chǔ)、高葡萄糖或IBMX的胰島素釋放顯示了與對照孔的顯著差別(圖5)。因為導(dǎo)致所有最好孔低刺激指數(shù)的不清楚的原因，這種供體最好的孔都具有非常高的基礎(chǔ)胰島素(圖6)。檢查供體#3023的結(jié)果，在第0、7和14天，將來自最好孔的從基礎(chǔ)、高葡萄糖或高葡萄糖與IBMX的胰島素釋放與對照進行了比較(圖7)。這個供體具有較低的基礎(chǔ)胰島素釋放，基本上所有最好的孔具有顯著刺激的胰島素釋放。計算刺激指數(shù)(圖8)，這些還表明了從最好孔的顯著釋放。但是，各自具有不同因子組合的最好孔在胰島素釋放方面有區(qū)別。一些表明IBMX釋放高于葡萄糖(所期望的)，而其它的表明葡萄糖高于葡萄糖加IBMX。這提示，這些孔中的不同組合導(dǎo)致胰島素產(chǎn)生細(xì)胞具有不同的能力。檢查第四個供體(#3036)的結(jié)果，基礎(chǔ)胰島素水平低，在葡萄糖或葡萄糖加IBMX攻擊后，具有顯著刺激的胰島素釋放(圖9)?；仡^看圖2中的孔，這些最好的孔明顯好于大多數(shù)的響應(yīng)，來自其它供體的也是這種情況。刺激指數(shù)的檢查(圖10)表明，與單獨葡萄糖相比，同葡萄糖加IBMX產(chǎn)生自這個供體的胰島素產(chǎn)生細(xì)胞給出更高的響應(yīng)。如圖11中所示，以C-肽的刺激指數(shù)對這些上清液進行了C-肽含量分析。
總之，這些結(jié)果證實了含有不同生長和分化因子組合的孔之間的顯著差別以及供體與供體之間的變異。所選擇的最好孔不是最終答案，為了定義最佳組合需要另外的研究。
表1顯示了這些最好的幾個生長因子組合。
表1導(dǎo)致最好胰島素產(chǎn)生的培養(yǎng)基組成
實施例4在藻酸鹽中培養(yǎng)的細(xì)胞的培養(yǎng)基分析對在實施例3中由組合排列生產(chǎn)的由3個供體產(chǎn)生的上清液的胰島素含量的統(tǒng)計分析，導(dǎo)致影響胰島素產(chǎn)生和細(xì)胞生長的正和負(fù)效應(yīng)物的清單，以及一致地好組合。
如通過這種組合系統(tǒng)所鑒別的，對干細(xì)胞向胰島素產(chǎn)生細(xì)胞的轉(zhuǎn)化具有潛在正作用的生長和分化因子，是β動物纖維素、BMP-2、雨蛙肽、硫酸化CCK8、霍亂毒素B亞單位、CNP、皮質(zhì)酮、DMF、DMSO、EGF、Exendin 4、FGF-1、葡萄糖、GRP、IGF-1、IGF-2、胰島素、KGF、層粘連蛋白、亮氨酸-腦啡肽、甲硫氨酸-腦啡肽、NGFβ、煙酰胺、PDGF AA.BB、pTHRP、硒、SHH、P物質(zhì)、TGFβsRII、運鐵蛋白、vEGF、VIP。
如通過這種組合系統(tǒng)所鑒別的，對干細(xì)胞向胰島素產(chǎn)生細(xì)胞的轉(zhuǎn)化具有潛在負(fù)作用的生長和分化因子，是活化素A、ANP、BMP-4、CCK8酰胺、CGRPα、地塞米松、DIF-1、內(nèi)皮縮血管肽1、FGF-2、胃泌素I、GH、GLP-1、HGF、催乳激素、LIF、正丁酸、PIGF、孕酮、促乳素、腐胺、REG-1、視黃酸、SOD、大豆胰蛋白酶抑制劑、T3、TGFα、TGFβ、Trolox。
實施例5干細(xì)胞的順序培養(yǎng)先貼壁，然后貼壁培養(yǎng)在補充有120種組合排列的60種生長因子組合的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在膠原包被板上培養(yǎng)干細(xì)胞另外8天，所述干細(xì)胞由在PCM中的膠原包被板上貼壁培養(yǎng)6-12天產(chǎn)生?；蛘咴诘谝慌囵B(yǎng)期后從膠原包被板取出細(xì)胞并將其在新鮮培養(yǎng)板上重新鋪板，然后在補充有120種組合排列的60種生長因子組合的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)另外8天。在培養(yǎng)期結(jié)束時，使細(xì)胞進行基礎(chǔ)培養(yǎng)基或20mM葡萄糖的24小時攻擊。收獲上清并用ELISA進行胰島素或C-肽含量分析。洗滌并溶解細(xì)胞然后用picogreen試驗測定每孔的DNA含量。
對來自3個獨立制備物，組成型產(chǎn)生胰島素或誘導(dǎo)產(chǎn)生胰島素葡萄糖刺激的孔的數(shù)據(jù)進行了統(tǒng)計分析并鑒別了“最好的孔”。表2中顯示了前四個“最好的孔”中生長因子的組成。
表2導(dǎo)致最好胰島素產(chǎn)生的培養(yǎng)基的組成
圖12表示由這種實驗產(chǎn)生的C-肽結(jié)果，表現(xiàn)出從顯示正響應(yīng)的基礎(chǔ)、葡萄糖和葡萄糖加IBMX刺激的釋放。檢測收獲自個體孔樣品中的胰島素和DNA濃度的范圍，表明這是一種用于篩選生長和分化因子組合在胰細(xì)胞衍生的干細(xì)胞生長和分化中的作用的可行方法。
實施例6120種組合排列的進一步優(yōu)化根據(jù)被誘導(dǎo)的胰島素產(chǎn)生或總胰島素產(chǎn)生，前面實施例中的數(shù)據(jù)鑒別了“最好的孔”。然后存在于“最好的培養(yǎng)基”中的成分可經(jīng)歷第二層篩選以簡化和更好地定義誘導(dǎo)從干細(xì)胞產(chǎn)生的胰島素產(chǎn)生細(xì)胞最小數(shù)目的因子?；蛘撸?yīng)物(實施例4)可經(jīng)歷第二層篩選以獲得相同的結(jié)果。
在該實施例中，將培養(yǎng)基“L”的30種組分排列到60中因子排列中。將由在膠原上貼壁培養(yǎng)7天產(chǎn)生的干細(xì)胞置于篩選狀態(tài)中另外3、5或10天。在每個時間點，固定細(xì)胞并利用胰島素原特異抗體進行免疫組織化學(xué)處理。利用自動顯像分析，記數(shù)胰島素原陽性細(xì)胞的數(shù)目。圖13中顯示了第3、5和7天利用培養(yǎng)基M、N、O、P和Q的胰島素原陽性細(xì)胞的數(shù)目。這些培養(yǎng)基是第二層篩選中最有前途的。在所述圖中，將它們于與來自60種因子排列的最有前途培養(yǎng)基“L”進行比較。結(jié)論是，該實施例表明，可改善和改進上述60種因子組合排列。
實施例7基因芯片研究(DNA寡微陣列)基因芯片(BD Atlas陣列)的應(yīng)用允許我們測量8,000個基因的相對表達水平(mRNA水平)?？衫迷摲椒ā爸讣y分析”或鑒別細(xì)胞型。分化胰細(xì)胞中mRNA表達的分析可能鑒別參與轉(zhuǎn)分化過程的基因。這種類型的比較將允許我們將起始胰細(xì)胞與中間干細(xì)胞，中間干細(xì)胞與激素產(chǎn)生細(xì)胞，以及這種最終產(chǎn)物與正常人胰島進行比較。
產(chǎn)生存在于人胰中不同細(xì)胞型的基因表達型的“指紋”的這類技術(shù)的利用將起兩個關(guān)鍵作用。也許這種分析最重要的作用將是清楚地定義在轉(zhuǎn)分化過程中產(chǎn)生的細(xì)胞的基因表達特征，從而在分子水平上定義這些細(xì)胞的獨有特征。這種分析的第二種作用將是提供改進我們研究方法的工具。所述分析將使我們了解胰島素產(chǎn)生表型如何被調(diào)節(jié)的機制。細(xì)胞表面標(biāo)記的知識將有助于快速細(xì)胞鑒別以及提供從“不想要的”細(xì)胞中挑選出想要的細(xì)胞的手段。存在于這些細(xì)胞上的細(xì)胞信號分子和轉(zhuǎn)錄因子的信息將有助于生長因子的鑒別，其為要更有效地完成起始物質(zhì)向能夠以與天然存在的β細(xì)胞相似的方式產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和擴展所需要的生長因子。雖然在公開可得的文獻和報道中可獲得一些關(guān)于胰細(xì)胞基因表達和表型的信息，但它們多數(shù)與非人類動物模型或胚胎發(fā)育有關(guān)。這些基因芯片研究對我們的申請和發(fā)現(xiàn)來說是特異的。
表3和4顯示了在PCM貼壁培養(yǎng)物中培養(yǎng)7天后比較的兩種胰島缺失、人胰細(xì)胞制備物的結(jié)果。借助標(biāo)準(zhǔn)方法分離RNA然后在比較微陣列中篩選。雖然在相同條件下培養(yǎng)上述兩種制備物，但判斷一種制備物是“優(yōu)異的”，而判斷另一種是“好的”(以其后來產(chǎn)生C-肽的能力為標(biāo)準(zhǔn))。在這些培養(yǎng)物中表達的大多數(shù)基因?qū)⑹窍嗤?，但將有一些被差異表達的基因。一些差異將是供體特異性的(例如MHC標(biāo)記的差別)，而其它的可使我們了解決定“優(yōu)異”與“好”結(jié)果的基因。
由各不同制備物表達的8,000個基因的檢查產(chǎn)生了一個大清單，它太長以至于不能包括。表3總結(jié)了那些我們認(rèn)為可特別適用于我們的研究和獲得新胰島素產(chǎn)生細(xì)胞的目的基因。這些基因中的一些對分化過程是重要的，而其它是相關(guān)的并可能是成功干細(xì)胞形成的先兆。表4是大約90種“強表達”信息(信號強度為最大值的10-100％)的匯編。所述“強表達”信息特別適用于鑒別可被用于鑒別和分類不同細(xì)胞群體(腺泡與胰島或分化成功的與分化差的)的表面標(biāo)記。另外，“強表達”基因的完全清單是很大的，因此只呈現(xiàn)了縮寫版本。
表3在“優(yōu)異”制備物(2071)與“好”制備物(2078)中以比較不同水平表達的重要/有用基因一覽表。
表4培養(yǎng)7天后兩種細(xì)胞制備物中以高水平表達的潛在重要和/或有用基因一覽表。
權(quán)利要求
1.一種使分化的非激素產(chǎn)生胰細(xì)胞轉(zhuǎn)化為分化的激素產(chǎn)生細(xì)胞的方法，該方法包括a)在一定條件下，在第一細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中用第一細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)所述分化的非激素產(chǎn)生胰細(xì)胞，所述第一細(xì)胞培養(yǎng)基包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有或無血清，以及有或無生長因子，在該條件下所述分化的非激素產(chǎn)生胰細(xì)胞轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞；和b)在一定條件下，在第二細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中用第二細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)所述干細(xì)胞，在該條件下所述干細(xì)胞分化為激素產(chǎn)生細(xì)胞，所述第二細(xì)胞培養(yǎng)基包含選自A組的至少一種化合物和選自B組的至少一種化合物，其中A組的化合物選自β動物纖維素、活化素A、BMP-2、TGF-βSRII、DMSO、Sonic Hedgehog、層粘連蛋白、甲硫氨酸-腦啡肽、DMF和霍亂毒素A；其中B組的化合物選自活化素A、心房肽、β動物纖維素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-4)、C鈉尿肽(CNP)、雨蛙肽、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP-α)、縮膽囊素(CCK8-酰胺)、縮膽囊素八肽(硫酸化CCK8)、霍亂毒素B亞單位、皮質(zhì)酮(Reichstein’s物質(zhì)H)、地塞米松、DIF-1、Differanisole A、二甲亞砜(DMSO)、EGF、內(nèi)皮縮血管肽1、Exendin 4、酸式FGF、FGF2、FGF7、FGFb、胃泌素I、胃泌素釋放肽(GRP)、胰高血糖素樣肽1(GLP-1)、葡萄糖、生長激素、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、IGF-1、IGF-2、胰島素、KGF、催乳激素、層粘連蛋白、亮氨酸-腦啡肽、白血病抑制因子(LIF)、甲硫氨酸-腦啡肽、正丁酸、神經(jīng)生長因子(β-NGF)、煙酰胺、n-n-二甲基甲酰胺(DMF)、甲狀旁腺素釋放肽(Pth II RP)、PDGF AA+PDGF BB混合物、PIGF(胎盤GF)、孕酮、促乳素、腐胺二氫氯化物γ照射的細(xì)胞培養(yǎng)物、REG1、視黃酸、硒、亞硒酸、Sonic Hedgehog、大豆胰蛋白酶抑制劑、P物質(zhì)、超氧化物歧化酶(SOD)、TGF-α、TGF-βsRII、TGF-β1、運鐵蛋白、三碘甲腺原氨酸(T3)、Trolox、血管活性腸肽(VIP)、VEGF、維生素A和維生素E。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二細(xì)胞培養(yǎng)基包含選自A組的至少兩種化合物和選自B組的至少兩種化合物。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二細(xì)胞培養(yǎng)基包含選自A組的至少三種化合物和選自B組的至少三種化合物。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二細(xì)胞培養(yǎng)基包含選自A組的至少四種化合物和選自B組的至少四種化合物。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二細(xì)胞培養(yǎng)基包含選自A組的至少五種化合物和選自B組的至少五種化合物。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二細(xì)胞培養(yǎng)基包含選自A組的至少六種化合物和選自B組的至少六種化合物。
7.一種將干細(xì)胞培養(yǎng)為分化的激素產(chǎn)生細(xì)胞的方法，該方法包括在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中用細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)所述干細(xì)胞，由此所述干細(xì)胞被分化為激素產(chǎn)生細(xì)胞，其中所述培養(yǎng)基包含無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和選自A組的至少一種化合物和選自B組的至少一種化合物，其中A組的化合物選自β動物纖維素、活化素A、BMP-2、TGF-βSRII、DMSO、Sonic Hedgehog、層粘連蛋白、甲硫氨酸-腦啡肽、DMF和霍亂毒素A；其中B組的化合物選自活化素A、心房肽、β動物纖維素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-4)、C鈉尿肽(CNP)、雨蛙肽、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP-α)、縮膽囊素(CCK8-酰胺)、縮膽囊素八肽(硫酸化CCK8)、霍亂毒素B亞單位、皮質(zhì)酮(Reichstein’s物質(zhì)H)、地塞米松、DIF-1、Differanisole A、二甲亞砜(DMSO)、EGF、內(nèi)皮縮血管肽1、Exendin 4、FGF酸式、FGF2、FGF7、FGFb、胃泌素I、胃泌素釋放肽(GRP)、胰高血糖素樣肽1(GLP-1)、葡萄糖、生長激素、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、IGF-1、IGF-2、胰島素、KGF、催乳激素、層粘連蛋白、亮氨酸-腦啡肽、白血病抑制因子(LIF)、甲硫氨酸-腦啡肽、正丁酸、神經(jīng)生長因子(β-NGF)、煙酰胺、n-n-二甲基甲酰胺(DMF)、甲狀旁腺素釋放肽(Pth II RP)、PDGF AA+PDGF BB混合物、PIGF(胎盤GF)、孕酮、促乳素、腐胺二氫氯化物γ照射的細(xì)胞培養(yǎng)物、REG1、視黃酸、硒、亞硒酸、Sonic Hedgehog、大豆胰蛋白酶抑制劑、P物質(zhì)、超氧化物歧化酶(SOD)、TGF-α、TGF-βsRII、TGF-β1、運鐵蛋白、三碘甲腺原氨酸(T3)、Trolox、血管活性腸肽(VIP)、VEGF、維生素A和維生素E。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含選自A組的至少兩種化合物和選自B組的至少兩種化合物。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含選自A組的至少三種化合物和選自B組的至少三種化合物。
10.權(quán)利要求7的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含選自A組的至少四種化合物和選自B組的至少四種化合物。
11.權(quán)利要求7的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含選自A組的至少五種化合物和選自B組的至少五種化合物。
12.權(quán)利要求7的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含選自A組的至少六種化合物和選自B組的至少六種化合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種使分化的非激素產(chǎn)生胰細(xì)胞轉(zhuǎn)化為分化的激素產(chǎn)生細(xì)胞的方法。該方法包括兩個步驟第一，在使所述分化的非激素產(chǎn)生細(xì)胞轉(zhuǎn)化干細(xì)胞的條件下培養(yǎng)細(xì)胞；和第二，在為使干細(xì)胞分化為激素產(chǎn)生細(xì)胞而提供的條件下培養(yǎng)干細(xì)胞。本發(fā)明表明了呈現(xiàn)給所述干細(xì)胞以導(dǎo)致它們分化為激素產(chǎn)生細(xì)胞，特別是胰島素產(chǎn)生細(xì)胞的生長和分化因子。本發(fā)明提供了一種大量激素產(chǎn)生細(xì)胞例如胰島素產(chǎn)生細(xì)胞的新來源，這些細(xì)胞目前在治療性應(yīng)用例如糖尿病的治療中不能得到。
文檔編號A61K35/12GK1668324SQ03817331
公開日2005年9月14日 申請日期2003年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月28日
發(fā)明者D·夏普, S·C·普里斯內(nèi)爾, M·A·赫達蘭, P·D·哈蘭德, P·普里斯雷, M·克茨, C·麥克因特爾 申請人:諾沃塞爾公司, 貝克頓·迪金森公司