使靶細(xì)胞可逆染色的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及使靶細(xì)胞可逆染色的方法。本發(fā)明還涉及分離靶細(xì)胞或由存在至少一個(gè)共同特異性受體分子定義的靶細(xì)胞群的方法。本發(fā)明還提供了可用于實(shí)施本發(fā)明所述方法的試劑盒。
【專利說明】使靶細(xì)胞可逆染色的方法
[0001]相關(guān)專利申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本專利申請(qǐng)要求于2011年7月18日向美國(guó)專利和商標(biāo)局提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng) 61/508，943 的“Method of Reversibly Staining a Target Cell”的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益,該申請(qǐng)以引用的方式全文并入本文。
發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明涉及使靶細(xì)胞可逆染色的方法。本發(fā)明還涉及分離由存在至少一種共同特異性受體分子定義的靶細(xì)胞或靶細(xì)胞群的方法。本發(fā)明還提供了可用于實(shí)施本發(fā)明的方法的試劑盒。
_4] 發(fā)明背景
[0005]細(xì)胞療法對(duì)許多疾病的治療是高效的已經(jīng)得到證明。例如，原發(fā)性免疫缺陷可以通過造血干細(xì)胞移植(HSCT)治愈，某些白血病可以通過異體HSCT和供者淋巴細(xì)胞輸注(DLI)的組合得到完全緩解(Kolb, H.J.等，Donor leukocyte transfusions fortreatment of recurrent chronic myelogenous leukemia in marrow transplantpatients.Blood76 (12)，2462-2465 (1990))。在一些臨床環(huán)境中，病毒特異性T細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移對(duì)重建免疫功能低下患者對(duì)抗由巨細(xì)胞病毒(CMV)造成的威脅生命的并發(fā)癥(Riddell，S.R.等,Restoration of viral immunity in immunodeficient humansby the adoptive transfer of T cell clones.Science257 (5067)，238-241 (1992))或由Epstein-Barr-病毒(EBV)介導(dǎo)的淋巴組織增生性疾病(Rooney，C.M.等，Use of gene-modified virus-specific T lymphocytes to controlEpstein-Barr-virus-related lymphoproliferation.Lancet345(8941), 9-13(1995))非常有效。同樣，無論是源自自身腫`瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞還是培養(yǎng)或體外設(shè)計(jì)的腫瘤抗原定向T細(xì)胞都是對(duì)改進(jìn)療法有前景的候選項(xiàng)。
[0006]無論這些有趣的臨床觀察結(jié)果如何，細(xì)胞療法更廣泛轉(zhuǎn)移到臨床應(yīng)用仍然需要等待。這主要是由于這樣的事實(shí)，用于產(chǎn)生免疫治療的細(xì)胞制備物的多數(shù)程序是非常費(fèi)時(shí)、費(fèi)力并且昂貴的。此外，已知的用于調(diào)節(jié)臨床療效的細(xì)胞群通常需要被富集到很高的純度，因?yàn)椤安恍枰摹奔?xì)胞的污染可能會(huì)介導(dǎo)有害的且有時(shí)危及生命的副作用(如移植物抗宿主病(GvHD)是由異種反應(yīng)性T細(xì)胞在同種異基因干細(xì)胞移植和/或DLI治療中介導(dǎo)的)。已有研究表明，極少量過繼轉(zhuǎn)移T細(xì)胞可以促進(jìn)有益的臨床療效，同樣的規(guī)則也適用于細(xì)胞群介導(dǎo)的負(fù)面影響。因此，提供適用于治療的定義明確的高純度細(xì)胞制備物成為使這些有前景的療法更有效和可預(yù)測(cè)并且降低潛在副作用風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵。
[0007]目前表面標(biāo)記物介導(dǎo)的臨床細(xì)胞純化的方法通常依賴于單一的參數(shù)(如，⑶34，MHC多聚體)。但是，對(duì)于多數(shù)細(xì)胞群一無論直接是源自離體的還是在體外細(xì)胞培養(yǎng)后的一不同表面標(biāo)記物的組合是必須的，以便從其它細(xì)胞中真正將這些細(xì)胞分隔出來。例如，天然存在的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)代表一類有前景的細(xì)胞亞群，其能預(yù)防基于同種異基因HSCT4 的急性 GvHD 或自身免疫疾病的發(fā)展(Riley, J.L.，June, C.H.，&Blazar, B.R.，HumanT regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning.1mmunity30(5)，656-665 (2009)，Randolph, D.A.&Fathman，C.G.，Cd4+Cd25+regulatory T cellsand their therapeutic potential.Annu Rev Med57，381-402 (2006))。
[0008]除了由大量細(xì)胞共有的CD4的表達(dá)，其它的標(biāo)記物如其組成型表達(dá)的高親和性IL-2受體a鏈(⑶25)需要進(jìn)一步減少異質(zhì)性。然而，⑶25也表達(dá)于很大部分的非調(diào)節(jié)性細(xì)胞上，所述細(xì)胞包括最近活化的效應(yīng)細(xì)胞和記憶T細(xì)胞。因此，已建議使用組合的染色模式，如CD4、CD25、CD 127和CD45RA的組合(Miyara，M.等，F(xiàn)unctionaldelineation and differentiation dynamics of human CD4+T cells expressing theFoxP3transcription factor.1mmunity30(6), 899-911 (2009), Hoffmann, P.等，Onlythe CD45RA+subpopulation of CD4+CD25high T cells gives rise to homogeneousregulatory T-cell lines upon in vitro expansion.Bloodl08(13)，4260-4267(2006))來更精確地鑒定此與臨床相關(guān)的T細(xì)胞亞群。
[0009]目前所有可用的基于臨床標(biāo)記物的細(xì)胞分離技術(shù)采用順磁性珠子，所述珠子將標(biāo)記的細(xì)胞群保留在磁場(chǎng)內(nèi)。由此，使用直接標(biāo)記的靶細(xì)胞群的積極富集策略得到最高純度。但是，經(jīng)由幾種不同標(biāo)記物的組合的純化仍然很難達(dá)到，盡管分離具有最高純度的不同細(xì)胞群是必需的。另外，陽性篩選后，標(biāo)記和珠子通常保留在細(xì)胞產(chǎn)物中，潛在地操縱分離的細(xì)胞群或負(fù)面地影響其功能/生活力如通過受體阻滯。特別是在臨床細(xì)胞分選中，保留的細(xì)胞標(biāo)記會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)品在患者中的重大適用性調(diào)節(jié)障礙。為了規(guī)避陽性篩選的問題，許多臨床細(xì)胞處理程序已經(jīng)變?yōu)楹慕咴O(shè)置。不幸的是，靶細(xì)胞的純度往往很低并且耗竭法常需要不同抗體的復(fù)雜混合物， 這就使得其生產(chǎn)和應(yīng)用費(fèi)力且價(jià)格昂貴。
[0010]因此，仍然需要提供一種用于細(xì)胞純化或分離的方法，該方法例如在細(xì)胞分選后允許從純化的細(xì)胞群中釋放且完全除去受體結(jié)合的所有組分和染色劑。
[0011]發(fā)明概沭
[0012]本發(fā)明一方面提供一種使用可檢測(cè)標(biāo)記使靶細(xì)胞可逆染色的方法，所述靶細(xì)胞包含在其表面上的受體分子，所述方法包括:
[0013]使包含所述靶細(xì)胞的細(xì)胞混合物與下述物質(zhì)接觸:
[0014](i)受體結(jié)合試劑，所述受體結(jié)合試劑包含至少一個(gè)(任意)結(jié)合位點(diǎn)B，其中結(jié)合位點(diǎn)B特異性結(jié)合至所述受體分子，其中所述受體結(jié)合試劑經(jīng)由結(jié)合位點(diǎn)B和所述受體分子之間的結(jié)合的解離速率常數(shù)(Ktjff)的值為約0.5 X IO-W1或更大，所述受體結(jié)合試劑進(jìn)一步包含至少一個(gè)結(jié)合配偶體C，其中所述結(jié)合配偶體C能夠(可逆)連接到多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z,
[0015](ii)多聚化試劑，所述多聚化試劑包含用于受體結(jié)合試劑的結(jié)合配偶體C的可逆結(jié)合的至少兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z，其中受體結(jié)合試劑(i)和多聚化試劑(ii)形成結(jié)合至所述靶細(xì)胞的(多個(gè))多價(jià)結(jié)合復(fù)合物，每個(gè)多價(jià)結(jié)合復(fù)合物包含結(jié)合至一個(gè)所述多聚化試劑的至少兩個(gè)所述受體結(jié)合試劑，所述多價(jià)結(jié)合復(fù)合物相對(duì)于所述受體結(jié)合試劑提供增加的親合力；和
[0016](iii)結(jié)合至所述多價(jià)結(jié)合復(fù)合物的所述可檢測(cè)標(biāo)記，
[0017]其中所述靶細(xì)胞通過所述多價(jià)結(jié)合復(fù)合物與所述靶細(xì)胞的結(jié)合染色，并且基于所述受體結(jié)合試劑的所述結(jié)合配偶體C與所述多聚化試劑的所述結(jié)合位點(diǎn)Z之間的結(jié)合的破裂，所述靶細(xì)胞的染色是可逆的。
[0018]本發(fā)明的第二個(gè)方面提供此染色法用于分離由存在(至少一種共同特異性)受體分子定義的靶細(xì)胞群的用途。
[0019]本發(fā)明另一方面提供用于使用可檢測(cè)標(biāo)記使靶細(xì)胞可逆染色(分離)的試劑盒，所述靶細(xì)胞包含在其表面的受體分子。此試劑盒包括:
[0020](i)至少一種受體結(jié)合試劑，所述至少一種受體結(jié)合試劑包含特異性結(jié)合至所述受體分子的(任意)結(jié)合位點(diǎn)B，其中所述受體結(jié)合試劑經(jīng)由結(jié)合位點(diǎn)B和所述受體結(jié)合分子之間的結(jié)合的解離速率常數(shù)(Ktjff)的值為約0.5X IO-W1或更大，并且所述受體結(jié)合試劑進(jìn)一步包含至少一個(gè)結(jié)合配偶體C，其中所述結(jié)合配偶體C能夠被多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z (可逆)結(jié)合，
[0021](ii)至少一種多聚化試劑，所述至少一種多聚化試劑包含用于受體結(jié)合試劑的所述結(jié)合配偶體C的至少兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z，其中結(jié)合配偶體C與所述多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z能夠形成可逆鍵合，
[0022](iii)可檢測(cè)標(biāo)記，所述可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合至或能夠結(jié)合至受體結(jié)合試劑⑴和/或多聚化試劑(ii)。
[0023]本發(fā)明的再一方面提供一種特異性結(jié)合至受體分子的受體結(jié)合試劑在使靶細(xì)胞可逆染色的方法中的用途，所述受體結(jié)合試劑包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)B，其中所述結(jié)合位點(diǎn)B特異性結(jié)合至所述受體分子，其中所述受體結(jié)合試劑經(jīng)由結(jié)合位點(diǎn)B和所述受體分子之間的結(jié)合的解離速率常數(shù)(Ktjff)的值為約0.SXlO-4Sec-1或更大。
[0024]本發(fā)明的又一個(gè)方面提供一種使用可檢測(cè)標(biāo)記使靶細(xì)胞可逆染色的方法，所述靶細(xì)胞包含在其表面的(至少一種)受體分子，所述方法包括:
[0025]使包含所述靶細(xì)胞的細(xì)胞混合物與下述物質(zhì)的接觸:
[0026](i)至少兩種受體結(jié)合試劑，每種受體結(jié)合試劑包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)B，其中每種受體結(jié)合試劑的結(jié)合位點(diǎn)B特異性結(jié)合至所述受體分子，其中每種所述受體結(jié)合試劑經(jīng)由結(jié)合位點(diǎn)B和所述受體分子之間的結(jié)合的解離速率常數(shù)(Ktjff)的值為約0.5X lOAec—1或更大，每種所述受體結(jié)合試劑進(jìn)一步包含至少一個(gè)結(jié)合配偶體C，其中每種受體結(jié)合試劑的結(jié)合配偶體C能夠(可逆)結(jié)合至多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z，
[0027](ii)多聚化試劑，所述多聚化試劑包含用于每種受體結(jié)合試劑的結(jié)合配偶體C的可逆結(jié)合的至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z,
[0028]其中所述至少兩種受體結(jié)合試劑⑴和多聚化試劑(ii)形成結(jié)合至所述靶細(xì)胞的(多個(gè))多價(jià)結(jié)合復(fù)合物，每個(gè)多價(jià)結(jié)合復(fù)合物包含結(jié)合至一個(gè)所述多聚化試劑的每種受體結(jié)合試劑中的至少一個(gè)，所述多價(jià)結(jié)合復(fù)合物相對(duì)于每種所述受體結(jié)合試劑提供增加的親合力；和 [0029](iii)結(jié)合至所述多價(jià)結(jié)合復(fù)合物的所述可檢測(cè)標(biāo)記，
[0030]其中所述靶細(xì)胞通過所述多價(jià)結(jié)合復(fù)合物與所述靶細(xì)胞的結(jié)合染色，并且其中基于每種所述受體結(jié)合試劑的所述結(jié)合配偶體C與所述多聚化試劑的所述結(jié)合位點(diǎn)Z之間的結(jié)合的分裂，所述靶細(xì)胞的染色是可逆的。
[0031]本發(fā)明另一方面提供用于使用可檢測(cè)標(biāo)記使靶細(xì)胞可逆染色(或分離)的試劑盒，所述靶細(xì)胞包含在其表面上的受體分子，所述試劑盒包括:[0032](i)至少兩種受體結(jié)合試劑，所述至少兩種受體結(jié)合試劑包含特異性結(jié)合至所述受體分子的結(jié)合位點(diǎn)B，其中每種所述受體結(jié)合試劑經(jīng)由結(jié)合位點(diǎn)B和所述受體結(jié)合分子之間的結(jié)合的解離速率常數(shù)(Ktjff)的值為約0.5X Kr4sec-1或更大，并且每種所述受體結(jié)合試劑進(jìn)一步包含至少一個(gè)結(jié)合配偶體C，其中每種受體結(jié)合試劑的結(jié)合配偶體C能夠被多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z (可逆)結(jié)合，
[0033](ii)至少一種多聚化試劑，所述至少一種多聚化試劑包含用于每種受體結(jié)合試劑的所述結(jié)合配偶體C的的至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z，其中每種結(jié)合試劑的結(jié)合配偶體C與所述多聚化試劑的所述結(jié)合位點(diǎn)Z能夠形成可逆鍵合，
[0034](iii)可檢測(cè)標(biāo)記，所述可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合至或能夠結(jié)合至受體結(jié)合試劑(i)和/或多聚化試劑(ii)。
[0035]附圖簡(jiǎn)沭
[0036]將非限制性實(shí)施例與附圖結(jié)合考慮并參照發(fā)明詳述將會(huì)更好的理解本發(fā)明，其中:
[0037]圖1示出使用Fab片段作為(至少一個(gè))受體結(jié)合試劑(就Fab片段而言且也通常在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，受體結(jié)合試劑可含有用于受體分子的單個(gè)結(jié)合位點(diǎn))的可逆染色法的原理。圖1a示出Fab片段用作受體結(jié)合試劑的說明性示例，其中鏈霉親和素結(jié)合肽即
為受體結(jié)合試劑的結(jié)合配偶體C。在這一實(shí)施例中，鏈霉親和素結(jié)合肽融合或綴合到Fab片段從而形成受體結(jié)合試劑。在圖1a所示實(shí)例中，多聚化試劑是鏈霉親和素突變蛋白(“5'//邙-Tacthl?” )，其包含用于所述至少一個(gè)結(jié)合配偶體C的至少兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z。在圖1a所不實(shí)例中，多聚化試劑帶有滅光標(biāo)記如操紅蛋白。在圖1b的實(shí)例中，再次一起示出了 Fab片段和綴合到作為標(biāo)記的磁珠上的多聚化試劑。采用鏈霉親和素突變蛋白與Fab片段之間經(jīng)由鏈霉親和素結(jié)合肽的多價(jià)結(jié)合復(fù)合物形成的可逆染色法在本文中也稱作“Fab-多聚體染色”。圖1c示出這種可逆Fab-多聚體染色法的示意圖概況。在這一實(shí)例中，從存在于血液樣品中的細(xì)胞混合物中染色/分離靶細(xì)胞。用于結(jié)合至存在于靶細(xì)胞上的細(xì)胞受體、Ktjff速率為約0.5 X KT4SecT1或更大的Fab片段通過Str印-tag?/5yr<?/?-Tactin?復(fù)合物形成可逆多聚化。靶細(xì)胞被多價(jià)結(jié)合復(fù)合物(通過如圖1c步驟a)中所示使細(xì)胞與多聚化試劑和受體結(jié)合試劑接觸)染色并可選地與缺乏同源性細(xì)胞表面受體分子的其它細(xì)胞分離，例如，利用熒光活化細(xì)胞分選術(shù)(圖1c步驟b)中標(biāo)記為商標(biāo)“FACS?”)。用與
S'mp-tag?.肽競(jìng)爭(zhēng)的&/r/?-Tactin?i配體D-生物素后續(xù)處理分離染色的靶細(xì)胞導(dǎo)致Fab片段從多聚化試劑上移位，由此導(dǎo)致多聚化試劑復(fù)合物)的從靶細(xì)胞中釋放(如圖1c步驟c)所示)。保留的Fab片段，未復(fù)合，由于其高Ktjff速率
將在合理的時(shí)間窗(自發(fā)地)解離，并且可以通過洗滌完全從靶細(xì)胞表面移除(如圖1c步驟d)所示)。洗滌可以在這樣一個(gè)體積下進(jìn)行，所述體積在每個(gè)洗滌步驟期間將Fab片段稀釋至至少等于Fab片段與同源細(xì)胞表面受體分子之間的結(jié)合的親和性解離常數(shù)(Kd)的濃度。圖1d示出與圖1c類似的染色過程，其中多聚化試劑綴合到磁珠上并且其中染色/分離步驟包括經(jīng)由其上結(jié)合染色細(xì)胞的磁柱將染色細(xì)胞從未染色細(xì)胞中分離。
[0038]圖2示出Fab多聚體可逆染色所需的結(jié)合特性。圖2示出用不同抗-⑶4Fab突變體染色的抗-⑶4Fab多聚體的FACS分析，所述不同抗-⑶4Fab突變體對(duì)于Fab片段與作為受體分子的CD4的結(jié)合具有增加的Ktjff-速率(Fab片段的結(jié)合動(dòng)力學(xué)的總結(jié)列于表I)。外周血單核細(xì)胞(PBMC )用融合至兩個(gè)順序排列的5y/rp-tag?,序列(市售商品名為“One-STrEP-tag”;結(jié)合配偶體C)的抗_CD4Fab片段(受體結(jié)合試劑)染色并用藻紅蛋白標(biāo)記的 Strep- Tactin? (Strep-Tactin PE ；IBA GmbH, G6ttingen，德國(guó)；包含用于結(jié)合配偶
體C的至少2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z的多聚化試劑)多聚化，然后在用D-生物素處理之前(第二列)或之后(第三列)進(jìn)行分析。然后在僅用Str印-Tactin PE (未結(jié)合Fab片段)(第四列)移除Fab-單體的洗滌步驟后，檢測(cè)靶細(xì)胞表面上保留的Fab-單體(即用作受體結(jié)合試劑的Fab片段)。在上述細(xì)胞可逆染色后再次進(jìn)行Fab多聚體的染色(第五列)，來控制生物素移除的完成，否則該生物素將會(huì)妨礙如第四列所示的保留Fab-單體僅用Strep-Tactin PE (未結(jié)合Fab片段)的染色，從而導(dǎo)致錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。或者，細(xì)胞用單體Fab片段培養(yǎng)、洗滌并在用Str印-Tactin PE? (第一，即最左邊的列)染色后進(jìn)行分析。示出了活的⑶3+T細(xì)胞。點(diǎn)圖中的數(shù)字表示門內(nèi)細(xì)胞的百分比。
[0039]圖3示出圖2的FACS分析的備選方案，即Fab多聚體染色可逆性的蛋白質(zhì)印跡分析。CD4Fab多聚體利用列于表1并進(jìn)一步如圖2具體說明的不同抗_CD4Fab_突變體和5^-c^-Tactin? PE (IBA GmbH, G6ttingen,德國(guó))生成。PBMC 與不同 CD4Fab 多聚體一起
孵育，且每個(gè)樣品中的一致的細(xì)胞染色用流式細(xì)胞儀檢測(cè)(與淺色直方圖對(duì)比，實(shí)線代表未染色細(xì)胞)。然后，細(xì)胞用D-生物素處理并隨后洗滌。最后，經(jīng)洗滌的細(xì)胞裂解，并用高特異性的抗'抗體(StrepMAB-Classic Horse Radish Peroxidase (HRP)綴合物；
IBA GmbH, Gdttingen，德國(guó))分析溶解(S)和未溶解(I)級(jí)分的保留Fab-單體。為了控制
一致量的不溶細(xì)胞物質(zhì)的應(yīng)用，同時(shí)用來自兔的針對(duì)P -肌動(dòng)蛋白的第一抗體(Santa CruzBiotechnology Inc., Santa Cruz, USA)和綴合到HRP的針對(duì)兔Ig (免疫球蛋白)的第二抗體(Sigma, St.Louis, USA)來檢測(cè)P -肌動(dòng)蛋白。
[0040]發(fā)明詳沭
[0041]本發(fā)明提供一種使在細(xì)胞表面具有受體分子的靶細(xì)胞或靶細(xì)胞群可逆染色的方法。對(duì)照于描述于美國(guó)專利7，776，562或國(guó)際專利申請(qǐng)W002/054065的方法，本發(fā)明是基于這樣的發(fā)現(xiàn)，在該方法中，受體結(jié)合試劑與靶細(xì)胞表面上的受體分子的低親和性結(jié)合并不是可逆性必須的。相反，本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不考慮結(jié)合強(qiáng)度，意味著無論受體結(jié)合試劑和受體分子之間結(jié)合的解離常數(shù)(Kd)是否具有低親和性，例如在Kd為約10_3到10_7M的范圍內(nèi)，或是否具有高親和性，例如在Kd為約10_7到IO-kiM的范圍內(nèi)，靶細(xì)胞都能被可逆染色，只要受體結(jié)合試劑經(jīng)由結(jié)合位點(diǎn)B與受體分子的結(jié)合的解離發(fā)生得足夠快。以Ktjff速率(也稱為受體結(jié)合試劑(經(jīng)由結(jié)合位點(diǎn)B)與受體分子之間的結(jié)合的解離速率常數(shù))表示，Ktjff速率為約0.5X10_4sec_1或更大，約IXKr4SecT1或更大，約SXKr4SecT1或更大，約
`3X KT4SecT1或更大，約4X KT4SecT1或更大，約5X KT4SecT1或更大，約I X KT3SecT1或更大，約 1.5 X KT3SecT1 或更大，約 2 X KT3SecT1 或更大，約 3 X KT3SecT1 或更大，約 4X KT3SecT1 或更大，約SXKr3SecT1或更大，約IXKr2SecT1或更大，或約5X Kr1SecT1或更大。本文關(guān)于Koff速率、km速率或Kd時(shí)所用術(shù)語“約”是指包含±0.1%、±0.2%、±0.3%、±0.4%、±0.5%、±0.7%、±0.9%、土 1.0%、土 1.2%、土 1.4%、土 1.6%、土 1.8%、±2.0%、±2.2%、±2.4%、±2.6%、±2.8%、±3.0%、±3.5%、±4.0.%、±4.5%、±5.0%、±6.0%、±7.0%、±8.0%、±9.0%、± 10.0%、± 15.0% 或 ±20.0% 的誤差容限。
[0042]在本文中，值得注意的是受體結(jié)合試劑L與其受體P (例如細(xì)胞表面受體分子)之間復(fù)合物(C)的形成可以描述為著名的兩狀態(tài)過程
[0043]
【權(quán)利要求】
1.一種使用可檢測(cè)標(biāo)記使靶細(xì)胞可逆染色的方法，所述靶細(xì)胞包含在其表面上的受體分子，所述方法包括: 使包含所述靶細(xì)胞的細(xì)胞混合物與下述接觸: (i)受體結(jié)合試劑，所述受體結(jié)合試劑包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)B,其中所述結(jié)合位點(diǎn)B特異性結(jié)合至所述受體分子，其中所述受體結(jié)合試劑經(jīng)由所述結(jié)合位點(diǎn)B和所述受體分子之間的結(jié)合的解離速率常數(shù)的值為大約0.5X IO-W1或更大，所述受體結(jié)合試劑進(jìn)一步包含至少一個(gè)結(jié)合配偶體C，其中所述結(jié)合配偶體C能夠可逆結(jié)合至多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z ； (ii)多聚化試劑，所述多聚化試劑包含用于所述受體結(jié)合試劑的結(jié)合配偶體C的可逆結(jié)合的至少兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z， 其中所述受體結(jié)合試劑(i)和所述多聚化試劑(ii)形成結(jié)合至所述靶細(xì)胞的多價(jià)結(jié)合復(fù)合物，每個(gè)多價(jià)結(jié)合復(fù)合物包含結(jié)合至到一個(gè)所述多聚化試劑的至少兩個(gè)所述受體結(jié)合試劑，所述多價(jià)結(jié)合復(fù)合物相對(duì)于所述受體結(jié)合試劑提供增加的親合力；和 (iii)所述可檢測(cè)標(biāo)記，所述可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合至或能夠結(jié)合至所述多價(jià)結(jié)合復(fù)合物， 其中所述靶細(xì)胞通過所述多價(jià)結(jié)合復(fù)合物與所述靶細(xì)胞的結(jié)合染色，并且其中經(jīng)所述受體結(jié)合試劑的所述結(jié)合配偶體C與所述多聚化試劑的所述結(jié)合位點(diǎn)Z之間的結(jié)合的破裂，所述靶細(xì)胞的染色是可逆的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合位點(diǎn)Z與所述配偶體C的可逆結(jié)合的解離常數(shù)(Kd)在10_2M到10_13M的范圍內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述受體分子結(jié)合試劑與所述受體分子之間的結(jié)合的解離速率常數(shù)(Iw)的值為約IXKr4SecT1或更大，約2X KT4SecT1或更大，約3X KT4SecT1或更大，約4X KT4SecT1或更大，約5X KT4SecT1或更大，約I X KT3SecT1或更大，約 1.5 X KT3SecT1 或更大，約 2 X KT3SecT1 或更大，約 3 X KT3SecT1 或更大，約 4X KT3SecT1 或更大，約5X10_3sec_1或更大，或約IXKr2SecT1或更大。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述受體結(jié)合試劑與所述受體分子之間的結(jié)合的解離常數(shù)(Kd)在10_2M到KTkiM的范圍內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述受體結(jié)合試劑與所述受體分子之間的結(jié)合的解離常數(shù)(Kd)在下述范圍內(nèi):約10_3M至約KTkiM,或約10_3M至約10_9M，或約10_3M至約I(T8M,或約KT3M至約I(T7M,或約KT7M至約I(T10M,或約KT7M至約1(T9M。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括從存在于所述細(xì)胞混合物中的非靶細(xì)胞分離所述染色的細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括通過破裂所述受體結(jié)合試劑的所述結(jié)合配偶體C與所述多聚化試劑的所述結(jié)合位點(diǎn)Z之間的結(jié)合從所述靶細(xì)胞中移除所述染色。
8.根據(jù)權(quán)利要求6至7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述多聚化試劑的移除導(dǎo)致所述受體結(jié)合試劑從所述染色的細(xì)胞的解離。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于， (a)所述結(jié)合配偶體C包含生物素，所述多聚化試劑包含可逆結(jié)合至生物素的鏈霉親和素類似物或抗生物素蛋白類似物；(b)所述結(jié)合配偶體C包含可逆結(jié)合至鏈霉親和素或抗生物素蛋白的生物素類似物，所述多聚化試劑包含可逆結(jié)合至所述生物素類似物的鏈霉親和素、抗生物素蛋白、鏈霉親和素類似物、或抗生物素蛋白類似物，或 (c)所述結(jié)合配偶體C包含鏈霉親和素或抗生物素蛋白結(jié)合肽，所述多聚化試劑包含可逆結(jié)合至所述鏈霉親和素或抗生物素蛋白結(jié)合肽的鏈霉親和素、抗生物素蛋白、鏈霉親和素類似物、或抗生物素蛋白類似物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合配偶體C包含鏈霉親和素-結(jié)合肽Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys,所述多聚化試劑包含鏈霉親和素類似物Val44-Thr45-Ala46-Arg47 或鏈霉親和素類似物 Ile44-Gly45-Ala46-Arg'
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合配偶體C與所述多聚化試劑的所述結(jié)合位點(diǎn)Z之間的結(jié)合在二價(jià)陽離子存在下進(jìn)行。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合配偶體C包含鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽，所述多聚化試劑包含鈣調(diào)蛋白，或 其特征在于，所述結(jié)合配偶體C包含F(xiàn)LAG肽，所述多聚化試劑包含能結(jié)合所述FLAG肽的抗體，或 其特征在于，所述第一結(jié)合C包含寡聚組氨酸標(biāo)簽，所述多聚化試劑包含結(jié)合所述寡聚組氨酸標(biāo)簽的抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合配偶體C與所述多聚化試劑的所述結(jié)合位點(diǎn)Z之間的結(jié)合通過金屬離子螯合破裂。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述金屬螯合通過添加EDTA或EGTA完成。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述多聚化試劑是鏈霉親和素或抗生物素蛋白或者鏈霉親和素或抗生物素蛋白的任意類似物的低聚物或聚合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述低聚物或聚合物通過多糖交聯(lián)。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合配偶體C包含抗原，所述多聚化試劑包含針對(duì)所述抗原的抗體。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述抗原是表位標(biāo)簽。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述表位標(biāo)簽選自Myc-標(biāo)簽(序列:EQKLISEEDL )、HA-標(biāo)簽(序列:YPYDVPDYA)、VSV-G-標(biāo)簽(序列:YTDIEMNRLGK)、HSV_ 標(biāo)簽(序列:QPELAPEDPED)、V5-標(biāo)簽(序列:GKPIPNPLLGLDST)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述抗原包含蛋白質(zhì)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)選自麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(CBP)或硫氧還蛋白。
22.根據(jù)前述權(quán)利要 求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，特異性結(jié)合至所述受體分子的所述受體結(jié)合試劑選自抗體、二價(jià)抗體片段、單價(jià)抗體片段、具有抗體樣結(jié)合特性的蛋白質(zhì)性結(jié)合分子和MHC分子。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述二價(jià)抗體片段是(Fab)/-片段或二價(jià)單鏈Fv片段。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述單價(jià)抗體片段選自Fab片段、Fv片段和單鏈Fv片段(scFv)。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述具有抗體樣結(jié)合特性的蛋白質(zhì)性結(jié)合分子選自適配體、基于脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族的多肽的突變蛋白、重組蛋白、基于錨蛋白支架的蛋白、基于結(jié)晶支架的蛋白、纖連蛋白、和高親和性多聚體。
26.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述接觸在溫度<15°C下進(jìn)行。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述接觸在溫度<4°C下進(jìn)行。
28.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述靶細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是淋巴細(xì)胞或干細(xì)胞。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述淋巴細(xì)胞是T細(xì)胞、T輔助細(xì)胞、B細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述T細(xì)胞選自CMV-特異性CD8+T淋巴細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、記憶T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
32.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述可檢測(cè)標(biāo)記是熒光染料或磁性標(biāo)記。
33.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，靶細(xì)胞通過一組至少兩種不同受體分子的方式順序染色和分離，其中采用至少兩種不同受體結(jié)合試劑，每種受體結(jié)合試劑包含特異性結(jié)合至所述至少兩種不同受體分子的組中的預(yù)選受體分子的結(jié)合位點(diǎn)B。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，結(jié)合至所述至少兩種不同受體分子的組的第二或任何其它受體分子的受體結(jié)合試劑進(jìn)一步包含能夠被多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z結(jié)合的至少一個(gè)結(jié)合配偶體C。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述受體結(jié)合試劑經(jīng)由所述結(jié)合位點(diǎn)B與所述第二或任何其它受體分子特異性結(jié)合之間的結(jié)合的解離速率常數(shù)(I^ff)的值為約0.5X 10 4sec 1 或更大。
36.根據(jù)權(quán)利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述第二或任何其它受體分子與特異性結(jié)合所述第二或任何其它受體分子的所述受體結(jié)合試劑之間的結(jié)合的解離常數(shù)(Kd)在10_2至KT7M的范圍內(nèi)。
37.根據(jù)權(quán)利要求1至36中任一項(xiàng)所述的方法在由存在至少一種共同特異性受體定義的細(xì)胞群的分離中的用途。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的用途，其特征在于，所述由存在共同特異性受體定義的細(xì)胞群是淋巴細(xì)胞群或干細(xì)胞群。
39.根據(jù)權(quán)利要求3 8所述的用途，其特征在于，所述淋巴細(xì)胞群是抗原特異性T細(xì)胞群、T輔助細(xì)胞群、B細(xì)胞群或自然殺傷細(xì)胞群。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述T細(xì)胞選自CMV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、記憶T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
41.根據(jù)權(quán)利要求38所述的用途，其用于所述淋巴細(xì)胞群或所述干細(xì)胞群的功能狀態(tài)的測(cè)定。
42.根據(jù)權(quán)利要求38所述的用途，其用于淋巴細(xì)胞群的純化以用于體外擴(kuò)增。
43.根據(jù)權(quán)利要求38所述的用途，其用于干細(xì)胞群的純化，所述干細(xì)胞群用于再生治療。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的用途，其特征在于，所述干細(xì)胞群是CD34+特異性群或Nanog+ 群。
45.根據(jù)權(quán)利要求38所述的用途，其特征在于，所述經(jīng)純化的細(xì)胞群為用于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的⑶4+T輔助細(xì)胞。
46.根據(jù)權(quán)利要求38所述的用途，其用于淋巴細(xì)胞群的純化，所述淋巴細(xì)胞群用于過繼轉(zhuǎn)移、癌癥治療、細(xì)菌感染治療、病毒感染治療或免疫療法。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的用途，其特征在于，所述經(jīng)純化的細(xì)胞群是對(duì)相關(guān)抗原特異性的CD8+T細(xì)胞，對(duì)白血病相關(guān)抗原特異性的CD8+T細(xì)胞，對(duì)黑色素瘤相關(guān)抗原特異性的⑶8+T細(xì)胞，對(duì)病毒抗原特異性的CD8+T細(xì)胞。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的用途，其特征在于，所述對(duì)病毒抗原特異性的CD8+T細(xì)胞為巨細(xì)胞病毒(CMV)磷蛋白65-特異性⑶8+T細(xì)胞或EB病毒-EBNA抗原-特異性⑶8+T細(xì)胞。
49.根據(jù)權(quán)利要求46所述的用途，其特征在于，所述經(jīng)純化的細(xì)胞群是用于自身免疫疾病、I型糖尿病、腸炎、過敏治療的Treg細(xì)胞。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的用途，其特征在于，所述自身免疫疾病是移植物抗宿主病(GvHD)或移植物排斥反應(yīng)。
51.根據(jù)權(quán)利要求49或50所述的用途，其特征在于，所述Treg細(xì)胞群是CD4+CD25+.CD45RA+Treg 細(xì)胞。
52.根據(jù)權(quán)利要求46所述的用途，其特征在于，所述經(jīng)純化的細(xì)胞群是CD62L+CD8+特異性中央記憶T細(xì)胞。
53.一種用于使用可檢測(cè)標(biāo)記使靶細(xì)胞可逆染色的試劑盒，所述靶細(xì)胞包含在其表面上的受體分子，所述試劑盒包含: (i)至少一種受體結(jié)合試劑，所述至少一種受體結(jié)合試劑包含特異性結(jié)合至所述受體分子的結(jié)合位點(diǎn)B，其中所述受體結(jié)合試劑經(jīng)由所述結(jié)合位點(diǎn)B和所述受體結(jié)合分子之間的結(jié)合的解離速率常數(shù)的值為約0.5X IO-W1或更大，并且所述受體結(jié)合試劑進(jìn)一步包含至少一個(gè)結(jié)合配偶體C，其中所述結(jié)合配偶體能夠被多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z可逆結(jié)合； (ii)至少一種多聚化試劑，所述至少一種多聚化試劑包含用于所述受體結(jié)合試劑的所述結(jié)合配偶體C的至少兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z，其中所述結(jié)合配偶體C與所述多聚化試劑的所述結(jié)合位點(diǎn)Z能夠形成可逆鍵合； (iii)可檢測(cè)標(biāo)記，所述可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合至或能夠結(jié)合至所述受體結(jié)合試劑(i)和/或所述多聚化試劑(ii)。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的試劑盒，其特征在于，所述結(jié)合配偶體C與所述結(jié)合位點(diǎn)Z之間的結(jié)合的解離常數(shù)(Kd)在10_2至10_13M的范圍內(nèi)。
55.特異性結(jié)合至受體分子的受體結(jié)合試劑在根據(jù)權(quán)利要求1-35中任一項(xiàng)所述的使靶細(xì)胞可逆染色的方法中的用途，所述受體結(jié)合試劑包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)B，其中所述結(jié)合位點(diǎn)B特異性結(jié)合至所述受體分子，其中所述受體結(jié)合試劑經(jīng)由所述結(jié)合位點(diǎn)B與所述受體分子之間的結(jié)合的解離速率常數(shù)(Iw)的值為約0.5X IO-W1或更大。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的用途，其特征在于，所述受體結(jié)合試劑選自抗體、二價(jià)抗體片段、單價(jià)抗體片段、具有抗體樣結(jié)合性質(zhì)的蛋白質(zhì)性結(jié)合分子和MHC分子。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的用途，其特征在于，所述二價(jià)抗體片段是(Fab)/-片段、二價(jià)單鏈Fv片段或雙特異抗體。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述單價(jià)抗體片段選自Fab片段、Fv片段、和單鏈Fv片段(scFv)。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，所述具有抗體樣結(jié)合性質(zhì)的蛋白質(zhì)性結(jié)合分子選自適配體、基于脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族的多肽的突變蛋白、重組蛋白、基于錨蛋白支架的蛋白、基于結(jié)晶支架的蛋白、纖連蛋白、和高親和性多聚體。
60.一種使用可檢測(cè)標(biāo)記使靶細(xì)胞可逆染色的方法，所述靶細(xì)胞包含在其表面上的受體分子，所述方法包括: 使包含所述靶細(xì)胞的細(xì)胞物與下述接觸: (i)至少兩種受體結(jié)合試劑，每種所述受體結(jié)合試劑包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)B，其中每種受體結(jié)合試劑的所述結(jié)合位點(diǎn)B特異性結(jié)合至所述受體分子，其中每種所述受體結(jié)合試劑經(jīng)由所述結(jié)合位點(diǎn)B和所述受體分子之間的結(jié)合的解離速率常數(shù)(I^ff)的值為約0.5 X IO-W1或更大，每種所 述受體結(jié)合試劑進(jìn)一步包含至少一個(gè)結(jié)合配偶體C，其中每種受體結(jié)合試劑的結(jié)合配偶體C能夠可逆結(jié)合至多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z ； (ii)多聚化試劑，所述多聚化試劑包含用于每種所述受體結(jié)合試劑的結(jié)合配偶體C的可逆結(jié)合的至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z, 其中所述至少兩種受體結(jié)合試劑(i)和所述多聚化試劑(ii)形成結(jié)合至所述靶細(xì)胞的多價(jià)結(jié)合復(fù)合物，每個(gè)多價(jià)結(jié)合復(fù)合物包含結(jié)合至一個(gè)所述多聚化試劑的每種受體結(jié)合試劑中的至少一種，所述多價(jià)結(jié)合復(fù)合物相對(duì)于每種所述受體結(jié)合試劑提供增強(qiáng)的親合力；和 (iii)所述可檢測(cè)標(biāo)記，所述可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合至或能夠結(jié)合至所述多價(jià)結(jié)合復(fù)合物， 其中所述靶細(xì)胞通過所述多價(jià)結(jié)合復(fù)合物與所述靶細(xì)胞的結(jié)合染色，并且其中經(jīng)每種所述受體結(jié)合試劑的所述結(jié)合配偶體C與所述多聚化試劑的所述結(jié)合位點(diǎn)Z之間的結(jié)合的破裂，所述靶細(xì)胞的染色是可逆的。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合位點(diǎn)Z與每種受體結(jié)合試劑的所述配偶體C之間的結(jié)合的解離常數(shù)(Kd)在Kr2至IO-3M的范圍內(nèi)。
62.一種用于使用可檢測(cè)標(biāo)記使靶細(xì)胞可逆染色的試劑盒，所述靶細(xì)胞包含在其表面上的受體分子，所述試劑盒包含: (i)至少兩種受體結(jié)合試劑，所述至少兩種受體結(jié)合試劑包含特異性結(jié)合至所述受體分子的結(jié)合位點(diǎn)B，其中每種所述受體結(jié)合試劑經(jīng)由所述結(jié)合位點(diǎn)B和所述受體結(jié)合分子之間的結(jié)合的解離速率常數(shù)的值為約0.5X IO-W1或更大，并且每種所述受體結(jié)合試劑進(jìn)一步包含至少一個(gè)結(jié)合配偶體C，其中每種所述受體結(jié)合試劑的結(jié)合配偶體能夠被多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z結(jié)合， (ii)至少一種多聚化試劑，所述至少一種多聚化試劑包含用于每種所述受體結(jié)合試劑的所述結(jié)合配偶體C的至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z，其中每種結(jié)合試劑的結(jié)合配偶體C與所述多聚化試劑的所述結(jié)合位點(diǎn)Z能夠形成可逆鍵合， (iii)可檢測(cè)標(biāo)記，所述可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合至或能夠結(jié)合至所述受體結(jié)合試劑(i)和/或所述多聚化試劑(ii)。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的試劑盒，其特征在于，所述結(jié)合位點(diǎn)Z與每種受體結(jié)合試劑的所述配偶體C之間的結(jié)合的解`離常數(shù)(Kd)在Kr2至KT3M的范圍內(nèi)。
【文檔編號(hào)】C07K14/36GK103797028SQ201280045377
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2012年7月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月18日
【發(fā)明者】托馬斯·施密特, 克里斯蒂安·施滕貝爾, 迪爾克·H·布施, 洛塔爾·格爾梅羅特 申請(qǐng)人:Iba 股份有限公司