一種無信號肽胞外生產(chǎn)淀粉分支酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種無信號肽胞外生產(chǎn)淀粉分支酶的方法，屬于基因工程和酶工程領域。本發(fā)明將來源于熱葡糖苷酶地芽孢桿菌(Geobacillus thermoglueosidan)的不含自身信號肽序列的淀粉分支酶基因表達于大腸桿菌中，并采用一些培養(yǎng)策略，實現(xiàn)了淀粉分支酶的無信號肽胞外生產(chǎn)。相比于淀粉分支酶的胞內(nèi)生產(chǎn)，產(chǎn)量明顯提高，并簡化了分離純化步驟，重組淀粉分支酶在E.coli中的胞外表達有利于其工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
【專利說明】
一種無信號肽胞外生產(chǎn)淀粉分支酶的方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種無信號肽胞外生產(chǎn)淀粉分支酶的方法，屬于基因工程和酶工程領 域。
【背景技術】
[0002] 淀粉分支酶（1，4-a-glucan branching enzyme;GBE;EC 2·4· 1 · 18)是一種屬于糖 苷水解酶家族13的糖基轉移酶，是合成糖原及支鏈淀粉的關鍵酶。它首先將底物分子上某 一 α_1，4糖苷鍵水解，切下一個直鏈葡聚糖片段，繼而通過轉糖基作用將該片段轉移至余下 底物分子上某一葡萄糖殘基的第6位碳原子上，形成α_1，6糖苷鍵。由于經(jīng)淀粉分支酶改性 的淀粉即高支化淀粉具有特殊理化特性、生理功能及更高的安全性，因此在食品、醫(yī)藥等工 業(yè)中具有廣闊的應用前景。
[0003] 大腸桿菌表達系統(tǒng)與其它表達系統(tǒng)相比，具有較清楚的遺傳性狀、操作簡便、生長 快、表達量大、培養(yǎng)成本低，適于大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)的特點，是現(xiàn)階段最常用的表達系統(tǒng)。目前 已有大量有關重組蛋白在該系統(tǒng)高效表達的研究，但是異源蛋白表達的同時，容易出現(xiàn)被 宿主蛋白酶降解或者形成包涵體、表達效率難以較大程度的提高、活性不夠等問題，而分泌 到細胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中要比定位于細胞質(zhì)有多個優(yōu)點，包括簡化蛋白下游加工、促進蛋白 折疊與穩(wěn)定、提高蛋白可溶性與生物學活性等。微生物來源的淀粉分支酶是胞內(nèi)酶，本身不 含信號肽，因此，目前淀粉分支酶的異源表達主要是在大腸桿菌中的胞內(nèi)表達，鮮有報道淀 粉分支酶融合了分泌信號肽后的胞外表達，更沒有關于無信號肽的淀粉分支酶胞外表達的 報道。
[0004] 異源表達淀粉分支酶突出的問題是，蛋白表達量低、淀粉分支酶酶活低。因此，構 建重組大腸桿菌進行胞外分泌淀粉分支酶，對于滿足淀粉分支酶工業(yè)化成產(chǎn)需求和降低生 產(chǎn)成本有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的第一個技術問題是提供一種產(chǎn)淀粉分支酶的重組大腸桿菌。
[0006] 所述重組大腸桿菌是將淀粉分支酶基因插入去除了 pelB信號肽的質(zhì)粒pET-20b ( + )，將重組質(zhì)粒在大腸桿菌中進行表達得到的重組大腸桿菌。
[0007] 在本發(fā)明的一種實施方式中，編碼所述淀粉分支酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述大腸桿菌是E.coli BL21(DE3)。
[0009] 編碼所述淀粉分支酶的基因來源于Geobacillus thermoglueosidan STB02。
[0010] 本發(fā)明要解決的第二個技術問題是提供一種獲得所述重組大腸桿菌的方法，是將 淀粉分支酶基因插入質(zhì)粒PET-20M + )的T7啟動子序列下游，構建了不含pelB信號肽表達載 體pET-20b( + )/gbe，并將其轉化至宿主E.coli BL21(DE3)中進行表達。
[0011] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法包括以下步驟：
[0012] (1)獲取不含信號肽的序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段，將目的基因連接至 pMD18_T simple vector，獲得質(zhì)粒pMD18_T simple/gbe;
[0013] (2)將質(zhì)粒pMD18-T simple/gbe和pET-20b( + )進行雙酶切，用連接酶連接得到重 組質(zhì)粒 pET_20b( + )/gbe;
[0014] (3)將步驟(2)得到的重組質(zhì)粒轉化到宿主E. coli BL21 (DE3)，即得到重組大腸桿 菌。
[0015] 本發(fā)明還提供一種應用所述重組大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)淀粉分支酶的方法，是將重組大 腸桿菌以TB培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，在30-37 °C、180-200r/min培養(yǎng)，當0D6QQ達到0.5-0.6時， 添加0-0.4mM的IPTG后，在25-37 °C、180-200r/min條件下發(fā)酵產(chǎn)酶。
[0016] 在本發(fā)明的一種實施方式中，以LB培養(yǎng)基活化重組大腸桿菌得到種子液。
[0017]在本發(fā)明的一種實施方式中，將重組大腸桿菌以TB培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，在35-37 °C、180-200r/min培養(yǎng)，當0D6QQ達到0 · 5-0 · 6時，添加0-0 · OlmM的IPTG后，在25-37°C、180-200r/min條件下發(fā)酵產(chǎn)酶。
[0018] 在本發(fā)明的一種實施方式中，將重組大腸桿菌種子液以2%的接種量接種到TB培 養(yǎng)基，在37 °C、200r/min條件下培養(yǎng)，當0D6QQ達到0 · 6時，添加 0 · 0ImM的IPTG，在30 °C、200r/ min條件下發(fā)酵產(chǎn)酶。
[0019] 本發(fā)明的有益效果：
[0020] 本發(fā)明通過構建不含有信號肽的重組大腸桿菌，實現(xiàn)了淀粉分支酶的高效胞外分 泌表達，生產(chǎn)強度顯著提高，例如不需要添加誘導劑，不需要超聲破碎，胞外淀粉分支酶表 達量是胞內(nèi)的1.75倍，胞外酶活可達175U/mL，胞外酶活占總酶活的比例達到74.7%。
【附圖說明】
[0021] 圖1:克隆表達載體構建圖
[0022] 圖2:發(fā)酵培養(yǎng)基對重組淀粉分支酶胞外生產(chǎn)的影響
[0023] 圖3:誘導劑濃度對重組淀粉分支酶胞外生產(chǎn)的影響
[0024] 圖4:誘導溫度對重組淀粉分支酶胞外生產(chǎn)的影響
【具體實施方式】
[0025]實施例1重組大腸桿菌的構建
[0026]熱葡糖苷酶地芽孢桿菌淀粉分支酶基因 （Gene Bank)全長1938bp。按照如圖1所示 的構建方法，首先獲取不含信號肽的序列是SEQ ID NO. 1所示序列的基因片段，將目的基因 連接至pffl)18-T simple vector，獲得質(zhì)粒pMD18_T simple/gbe。將質(zhì)粒pMD18_T simple/ gbe和pET-20b( + )進行雙酶切，用連接酶連接得到重組質(zhì)粒pET-20b( + )/gbe。將重組質(zhì)粒 pET-20b( + )/gbe通過熱激法轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞。轉化液涂布含氨芐青霉素 （100yg/ mL)LB平板，提取質(zhì)粒測序驗證構建的重組質(zhì)粒。測序工作由上海生工完成。
[0027]實施例2重組大腸桿菌搖瓶培養(yǎng)
[0028] 挑取含有重組質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)的單克隆于含100yg/mL氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中，在37°C、200r/min下培養(yǎng)8~12h，以體積比2%的接種量接種到含100yg/mL氨芐 青霉素的TB培養(yǎng)基中，在30°C、200r/min下發(fā)酵48h;將發(fā)酵液于4°C、10000rpm離心15min以 除去菌體，收集上清液。
[0029]實施例3酶活測定分析
[0030] 用0 · 9mL的50mmo 1/L磷酸緩沖液(pH 7 · 5)配制0 · 25 % (w/v)馬鈴薯支鏈淀粉標準 溶液，加入〇. lmL酶液，在50°C下反應15min。反應結束后沸水浴滅酶lOmin，并以10000r/min 離心2min待顯色用。顯色體系為0.3mL反應上清液與5. OmL顯色液(0.05% (w/v)KI，0.005% (w/v)l2，pH 7.5)于7mL離心管中混合，顯色15min后在530nm處測定吸光值。酶活定義：在 530nm處，吸光值每分鐘降低1 %所需的酶量為一個酶活單位。
[0031]實施例4發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇
[0032] 挑取含有重組質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)的單克隆于含100yg/mL氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中，在37°C、200r/min下培養(yǎng)8~12h，以體積比2%的接種量接種到含100yg/mL氨芐 青霉素的4種典型的大腸桿菌培養(yǎng)基SOB、S0C、LB、TB培養(yǎng)基中，開始培養(yǎng)溫度為37 °C、搖床 轉速為200r/min，當菌體濃度培養(yǎng)至0D600至0.6時，加入0.0 lmM的IPTG后迅速轉至在30 °C、 200r/min下繼續(xù)誘導48h，將發(fā)酵液于4°C、lOOOOrpm離心15min以除去菌體，收集上清液測 定淀粉分支酶酶活，結果見圖2。在這些培養(yǎng)基中，TB培養(yǎng)基最有利于重組淀粉分支酶的胞 外生產(chǎn)。E. co 1 i在TB培養(yǎng)基中發(fā)酵48h，胞外酶活達到120. lU/mL，是在LB培養(yǎng)基中的大約15 倍。分析其原因可能是，TB培養(yǎng)基有相對高的pH緩沖能力，有利于菌體的生長和重組酶的穩(wěn) 定;TB培養(yǎng)基中酵母粉含量更高，營養(yǎng)成分更加豐富，適合菌體生長。
[0033] LB 培養(yǎng)基:酵母粉 5g/L，胰蛋白胨 10g/L，NaCl 10g/L，pH7.0
[0034] SOB培養(yǎng)基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨20g/L，NaCl 0.5g/L，KCl 2.5mM，MgCl210mM， ρΗ7·0
[0035] S0C培養(yǎng)基:酵母粉5g/L，胰蛋白胨20g/L，NaCl 0.5g/L，KCl 2.5mM，MgCl210mM，葡 萄糖 20mM，pH7.0
[0036] TB培養(yǎng)基：酵母粉24g/L，胰蛋白胨12g/L，甘油5g/L，KH2P〇4l7mM，K2HP〇472mM， ρΗ7·0
[0037] 實施例5誘導劑濃度對重組淀粉分支酶胞外生產(chǎn)的影響
[0038] 挑取含有重組質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)的單克隆于含100yg/mL氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中，在37°C、200r/min下培養(yǎng)8~12h，以體積比2%的接種量接種到含100yg/mL氨芐 青霉素的TB培養(yǎng)基中，開始培養(yǎng)溫度為37°C、搖床轉速為200r/min，當菌體濃度培養(yǎng)至 0D600至0.6時，加入0-0.4mM的IPTG后迅速轉至在30°C、200r/min下繼續(xù)誘導48h，將發(fā)酵液 于4°C、1 OOOOrpm離心15min以除去菌體，收集上清液測定淀粉分支酶酶活，結果見圖3。較低 的IPTG濃度有利于重組酶的胞外生產(chǎn)，以IPTG濃度為0.0 lmM為最佳，培養(yǎng)基中淀粉分支酶 的酶活達到133.8U/mL。
[0039] 實施例6誘導溫度對重組淀粉分支酶胞外生產(chǎn)的影響
[0040] 挑取含有重組質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)的單克隆于含100yg/mL氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中，在37°C、200r/min下培養(yǎng)8~12h，以體積比2%的接種量接種到含100yg/mL氨芐 青霉素的TB培養(yǎng)基中，開始培養(yǎng)溫度為37°C、搖床轉速為200r/min，當菌體濃度培養(yǎng)至 0D600至0 · 6時，加入0 · 0ImM的IPTG后迅速轉至在25 °C、30 °C、37 °C、200r/min下繼續(xù)誘導74h 取樣測淀粉分支酶酶活，結果見圖4。當誘導溫度為30°C最有利于重組淀粉分支酶的胞外生 產(chǎn)，培養(yǎng)基中淀粉分支酶的酶活達到175U/mL。
[0041]雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1. 一種產(chǎn)淀粉分支酶的重組大腸桿菌，其特征在于，將在核苷酸序列是SEQ ID NO. 1所 示序列的淀粉分支酶基因插入去除了PelB信號肽的質(zhì)粒pET-20b( + )中，將重組質(zhì)粒在宿主 菌E.coli BL21(DE3)中進行表達得到的重組大腸桿菌。2. 編碼權利要求1所述重組大腸桿菌的核苷酸序列。3. 含有權利要求3所述核苷酸序列的載體或細胞。4. 一種獲得權利要求1所述重組大腸桿菌的方法，其特征在于，所述方法具體是:將SEQ ID N0.1所示序列的淀粉分支酶基因插入質(zhì)粒pET-20b( + )的T7啟動子序列下游，構建了不 含PelB信號肽表達載體pET-20b( + )/gbe，并將其轉化至宿主E.coli BL21(DE3)中進行表 達。5. 根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法具體是：（1)獲取不含信號肽的序 列是SEQ ID N0.1所示序列的基因片段，將目的基因連接至pMD18-simple vector，獲得質(zhì) 粒pMD18_T simple/gbe; (2)將質(zhì)粒pMD18_T simple/gbe和pET_20b( + )進行雙酶切，用連接 酶連接得到重組質(zhì)粒pET-20b( + )/gbe;(3)將步驟2得到的重組質(zhì)粒轉化到宿主E.coli BL21(DE3)，即得到重組大腸桿菌。6. 根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，挑取含有重組質(zhì)粒的E.coli BL21 (DE3)的 單克隆于含lOOyg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在37°C、200r/min下培養(yǎng)8~12h，以體積比 2%的接種量接種到含lOOyg/mL氨芐青霉素的TB培養(yǎng)基中，開始培養(yǎng)溫度為37°C、搖床轉速 為200r/min，當菌體濃度培養(yǎng)至0D600至O . 6時，加入O . OImM的IPTG后迅速轉至在30 °C、 200r/min下繼續(xù)誘導48h;將發(fā)酵液于4°C、1000 Orpm離心15min以除去菌體，收集上清液。7. 根據(jù)權利要求1-6任一所述方法得到的淀粉分支酶。8. 權利要求2所述的重組大腸桿菌在淀粉分支酶胞外生產(chǎn)方面的應用。
【文檔編號】C12R1/19GK105950579SQ201610345583
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月23日
【發(fā)明人】李兆豐, 顧正彪, 劉藝婷, 李才明, 程力, 洪雁
【申請人】江南大學