由海洋微生物菌株Y112制備α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及海洋微生物領(lǐng)域，特別是涉及一種由海洋微生物菌株Y112制備a-環(huán) 糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)糊精（cyclodextrin，縮寫(xiě)CD)是由a-1，4-糖苷鍵相連而成的，環(huán)狀的，無(wú)還原 端的麥芽低聚糖。環(huán)糊精通常由6、7或8個(gè)葡萄糖殘基組成，分別被稱(chēng)為a-、|3-、或y-環(huán) 糊精。除了這三種常用的環(huán)糊精外，還有S-、e-、G-和n-環(huán)糊精（分別由9~12個(gè)葡 萄糖單元組成）。環(huán)糊精具有能夠?qū)⒍喾N化學(xué)物質(zhì)全部或部分封裝入空腔內(nèi)的能力，從而 改變了這些化合物的物理和化學(xué)性質(zhì)。環(huán)糊精是由環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（CGTase)作用 于淀粉轉(zhuǎn)化而成，主要產(chǎn)物為a-、0-、y-環(huán)糊精。由于環(huán)糊精分離提純工藝非常復(fù)雜， 因此尋找能催化產(chǎn)生特定環(huán)糊精的CGTase的產(chǎn)生菌非常重要。目前，研究報(bào)道主要集中在 0 -CGTase產(chǎn)生菌株上，而有關(guān)a-、y-CGTase產(chǎn)生菌的研究報(bào)道卻很少。幾乎很少有主 要產(chǎn)a-或y-環(huán)糊精的CGTase報(bào)道。枯草芽孢桿菌BacillussubtilisNo. 313、嗜堿 芽抱桿菌Bacillusstrain290-3、芽抱桿菌Bacillussp.AL-6 和短桿菌Brevibacterium sp.No9605是目前已知的產(chǎn)y-CGTase的菌株。
[0003]目前環(huán)糊精的制備主要是采用酶法合成的，化學(xué)合成法并不常用，而酶法制備會(huì) 產(chǎn)生多種環(huán)糊精的混合物，不利于單一環(huán)糊精的分離純化，這極大限制了環(huán)糊精的應(yīng)用。因 此，成為當(dāng)今世界開(kāi)發(fā)尋求一種能夠生產(chǎn)特定單一環(huán)糊精的CGTase的生產(chǎn)菌，降低環(huán)糊精 分離純化成本所關(guān)注的焦點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)酶法產(chǎn)生多種環(huán)糊精的混合物的不足，經(jīng)發(fā)明 人長(zhǎng)期開(kāi)發(fā)研究海洋微生物及其酶產(chǎn)物和生產(chǎn)實(shí)踐，開(kāi)發(fā)提供一種新的由海洋微生物菌 株Yl12制備a-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的方法。
[0005] 本發(fā)明提供一種新的a_環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，包括下列步驟：
[0006] 1、由海洋微生物菌株Yl12制備粗酶液
[0007] 在三角瓶中裝種子培養(yǎng)基液30mL接種海洋微生物菌株Y112后，30°C、200r/min下 活化22h，以4% (V/V)的接種量接種至裝有25mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，27°C、230r/min 培養(yǎng)50h，收集發(fā)酵液在1000 Og的離心力條件下離心15min，上清為粗酶液。
[0008] 所述種子培養(yǎng)基的組成：每升培養(yǎng)基含可溶性淀粉10g，蛋白胨5g，酵母浸粉5g， K2HPO4Ig,MgSO4?7H200?15g，NaCl50g，121。。滅菌 20min〇 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成：每升 培養(yǎng)基含玉米淀粉l〇g，蛋白胨5g，酵母浸粉5g，K2HPO4lg，MgSO4?7H200?15g，NaCl50g， 121°C滅菌 20min。
[0009] 本發(fā)明中酶活的測(cè)定采用甲基橙褪色法。該酶活單位定義為上述條件下生成 Iyga-環(huán)糊精所需的酶量。
[0010] 生物量的測(cè)定：采用比濁法測(cè)定生物量。
[0011] 蛋白含量的測(cè)定；蛋白濃度的測(cè)定采用Bradford法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋 白。
[0012] 2、乙醇分級(jí)沉淀
[0013] 一級(jí)沉淀：向步驟1的粗酶液中徐徐加入無(wú)水乙醇，使乙醇的最終體積分?jǐn)?shù)為 20% - 40%，優(yōu)選為40%，靜置，離心取上清液，上清液的酶比活力最高，純化倍數(shù)為1. 25， 回收率為95. 5%。
[0014] 二級(jí)沉淀：向一級(jí)沉淀得上清液中繼續(xù)加入無(wú)水乙醇，使乙醇的最終體積分?jǐn)?shù)為 40% -55%，優(yōu)選為40% -50%，靜置，離心，待沉淀風(fēng)干后用磷酸緩沖液溶解成溶液，純化 倍數(shù)為3. 42,酶活回收率為90. 1 %。
[0015] 3、凝膠層析
[0016]先用pH7. 2磷酸鈉緩沖液平衡Superdex200分子篩層析柱（如2. 6X60cm)，將步 驟2得到的酶液上樣，然后用相同緩沖液進(jìn)行洗脫，流速為2mL/min，得到若干洗脫峰，其中 只有主峰有活性，對(duì)其進(jìn)行收集濃縮，測(cè)定總酶活力及總蛋白含量。
[0017] 4、DEAE-Sepharose離子交換層析
[0018] 先用pH7. 2磷酸鈉緩沖液平衡DEAE-S印harose離子交換層析柱（如 I. 6XIOcm)，將步驟3得到的酶液上樣，然后用含0~lmol/L的相同緩沖液進(jìn)行線(xiàn)性梯度 洗脫，流速為2mL/min，得到三個(gè)洗脫峰，其中穿透峰較小無(wú)活性，僅第二洗脫峰有活性，對(duì) 其進(jìn)行收集濃縮，測(cè)定總酶活力及總蛋白含量。
[0019] SDS-PAGE電泳
[0020] SDS-PAGE電泳采用10%分離膠和5%濃縮膠，控制恒定電壓160V。對(duì)純化過(guò)程中 的樣品進(jìn)行適當(dāng)濃縮，選用10%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果顯示呈現(xiàn)單一的條帶，說(shuō)明 本發(fā)明由海洋微生物菌株Yl12制備a-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶方法得到的a-環(huán)糊精葡 萄糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)品單一純度高。
[0021] 本發(fā)明由海洋微生物菌株Y112制備a-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)果列于下表
[0022]
[0023] 本發(fā)明提供一種新的由海洋微生物菌株Y112制備a-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的 方法中，由菌株Y112制備a-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶得到的a-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 產(chǎn)品單一純度高，純度提高了 12. 4倍，回收率為57. 5%。
[0024] 本發(fā)明提供一種新的由海洋微生物菌株Y112制備a-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的 方法中，所述產(chǎn)a-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的海洋微生物菌株Y112來(lái)自黃海海域的一株 產(chǎn)a-CGTase的海洋微生物菌株Y112,其16SrDNA序列長(zhǎng)度約1420bp左右。經(jīng)過(guò)16S rDNA序列分析結(jié)合其生理生化特征，該菌株被鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillussp.)。該產(chǎn)a-CGTase的海洋微生物菌株Y112于2015年7月13日保藏于中國(guó)武漢中國(guó)典型培養(yǎng)物保 藏中心（簡(jiǎn)稱(chēng)CCTCC)，保藏號(hào)為CCTCCNO:M2015447。
[0025] 海洋微生物菌株Yl12的形態(tài)和生理生化特征：
[0026] 菌株Yl12的形態(tài)特征：
[0027] 菌株Y112為不規(guī)則短桿狀，革蘭氏陽(yáng)性，菌落在瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)圓形，乳白色， 表面平坦、邊緣不整齊。
[0028] 菌株Yl12生理生化特征：
[0029] 菌株Y112能在pH8. 0-11.0的條件下生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)pH為10 ;生長(zhǎng)的溫度范圍為 10-45°C，最適生長(zhǎng)溫度33°C;最高能耐受16wt%的NaCl，在含有5%WtNaCl條件下生長(zhǎng)量 最高