一種d-乙酰氨基葡萄糖脫乙?；傅漠愒幢磉_(dá)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，一種優(yōu)質(zhì)D-乙酰氨基葡萄糖脫乙?；傅漠愒幢磉_(dá)， 酶活性條件優(yōu)化及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 氨基葡萄糖（GlcN)又稱葡萄糖胺、葡糖胺或氨基葡糖，在體內(nèi)具有重要的生理意 義：參與肝腎解毒，發(fā)揮抗炎、護(hù)肝、抗反應(yīng)性、抗低氧的作用，刺激嬰兒腸道中雙歧桿菌的 增生等；在食品，農(nóng)業(yè)領(lǐng)域及化妝品領(lǐng)域中同樣都有不同程度的應(yīng)用。GlcN的用途如此廣 泛，而目前國內(nèi)相關(guān)產(chǎn)品較少。
[0003] 甲殼素（chitin)又叫幾丁質(zhì)，殼多糖廣泛分布于蝦殼，蟹殼，昆蟲等的甲殼中，其 主要組成單位是N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc)，經(jīng)強(qiáng)酸水解可得到氨基葡萄糖。因此，工業(yè) 上通常采用強(qiáng)酸水解的方法生產(chǎn)氨基葡萄糖鹽酸鹽。但是傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝須消耗大量的酸 堿，腐蝕設(shè)備，造成環(huán)境的污染，且產(chǎn)率低，產(chǎn)物不純，新方法條件要求高。這些在某種程度 上限制了氨基葡萄糖及其衍生物的廣泛應(yīng)用。利用基因工程技術(shù)構(gòu)建生產(chǎn)氨基葡萄糖的重 組大腸桿菌，然后通過發(fā)酵法產(chǎn)氨基葡萄糖是近期發(fā)展的另一種方法，目前，發(fā)酵法產(chǎn)氨基 葡萄糖的研究集中在霉菌發(fā)酵與重組大腸桿菌研究上，但是該方法需要投入大量精力和資 金到基因工程菌的研究上，沒有形成規(guī)模化。
[0004] 因此，一種更加溫和，環(huán)境友好，產(chǎn)物純度高生產(chǎn)氨基多糖的方法非常迫切。據(jù)報(bào) 道甲殼素酶可以把甲殼素降解為大量D-乙酰氨基葡萄糖單糖分子，研究證明甲殼素降解 率高達(dá)92. 6 % ;然后利用D-乙酰氨基葡萄糖脫乙?；甘笵-乙酰氨基葡萄糖脫去乙酰基 得到氨基葡萄糖，目前文獻(xiàn)報(bào)道中一些脫乙酰基酶可以作用于GlcNAc，但是這些酶的主要 活性不是針對D-乙酰氨基葡萄糖，或者這些酶的活性或產(chǎn)率不高。我們同樣利用已經(jīng)非常 成熟的基因工程技術(shù)，通過基因搜索，克隆，重組表達(dá)和生化特性研究等獲得產(chǎn)物單一，且 轉(zhuǎn)化率達(dá)到百分之百的D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶。D-乙酰氨基葡萄糖脫乙?；傅?反應(yīng)式如下：
[0005]
[0006] 但是從甲殼素生成D-乙酰氨基葡萄糖，再生成氨基葡萄糖的仍處于研究階段應(yīng) 用，需要進(jìn)一步的實(shí)際試驗(yàn)研究，為實(shí)現(xiàn)該方法的規(guī)?；a(chǎn)，是我們今后要努力的方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種優(yōu)質(zhì)的D-乙酰氨基葡萄糖脫乙?；?，實(shí)現(xiàn) D-乙酰氨基葡萄糖脫乙?；傅漠愒创罅勘磉_(dá)，相比于化學(xué)法生產(chǎn)氨基葡萄糖，酶法生產(chǎn) 將具有極大的工業(yè)化潛力。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種D-乙酰氨基葡萄糖脫乙?；傅木幋a基因。
[0009] 本發(fā)明的又一目的在于提供D-乙酰氨基葡萄糖脫乙?；傅膽?yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0011] -種D-乙酰氨基葡萄糖脫乙?；?，其氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0012] 上述的D-乙酰氨基葡萄糖脫乙?；傅木幋a基因，具有下述核苷酸序列之一：
[0013] (1)序列表中的SEQIDN0. 2的核苷酸序列；
[0014] (2)編碼序列表中SEQIDNO. 1氨基酸序列的多核苷酸。
[0015] 含有上述的D-乙酰氨基葡萄糖脫乙?；妇幋a基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì) 胞系和轉(zhuǎn)基因重組菌。
[0016] 所述的重組表達(dá)載體為將權(quán)利要求2或3所述的D-乙酰氨基葡萄糖脫乙?；?編碼基因插入到大腸桿菌表達(dá)載體中得到的表達(dá)D-乙酰氨基葡萄糖脫乙?；傅闹亟M表 達(dá)載體；所述的大腸桿菌表達(dá)載體優(yōu)選為大腸桿菌質(zhì)粒pET28a(+)。
[0017] 上述的重組表達(dá)載體的制備方法為：采用權(quán)利要求2或3所述D-乙酰氨基葡萄 糖脫乙酰基酶編碼基因的核苷酸序列經(jīng)EcoRI和Xhol雙酶切后與EcoRI和Xhol雙酶切的 pET28a(+)載體連接，得到重組表達(dá)載體pET28a(+)_N_acetylglucosaminedeacetylase。
[0018] 所述的轉(zhuǎn)基因重組菌是將權(quán)利要求5或6所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中， 篩選得到表達(dá)D-乙酰氨基葡萄糖脫乙?；傅霓D(zhuǎn)基因重組菌；所述的大腸桿菌優(yōu)選為大 腸桿菌BL21(DE3)。
[0019] 上述的D-乙酰氨基葡萄糖脫乙?；傅漠愒幢磉_(dá)，所述D-乙酰氨基葡萄糖脫乙 ?；傅暮塑账嵝蛄芯幋a，實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中異源可溶性表達(dá)。
[0020] 上述的D-乙酰氨基葡萄糖脫乙?；傅闹苽浞椒?，培養(yǎng)含有D-乙酰氨基葡萄糖 脫乙?；妇幋a基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或培養(yǎng)包含D-乙酰氨基葡萄糖脫乙?；妇幋a基因 的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因重組菌，誘導(dǎo)其表達(dá)，收獲表達(dá)產(chǎn)物，得到粗酶，通過Ni-NTA 瓊脂糖凝膠親和柱純化得到純酶形式的目的蛋白。
[0021] 上述的D-乙酰氨基葡萄糖脫乙?；冈谒釪-乙酰氨基葡萄糖使其脫乙酰基制 備氨基葡萄糖中的應(yīng)用。
[0022] 上述的D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶在水解β-鍵連接D-乙酰氨基葡萄糖的物 質(zhì)使其脫乙?；玫溅?鍵連接的氨基葡萄糖中的應(yīng)用。
[0023] 所述β-鍵連接D-乙酰氨基葡萄糖的物質(zhì)優(yōu)選為ΡΝΡ-β-GlcNAc和 X-β_GlcNAc〇
[0024] -種制備氨基葡萄糖或β-鍵連接的氨基葡萄糖的方法，是用上述的D-乙酰氨基 葡萄糖脫乙?；杆釪-乙酰氨基葡萄糖或β-鍵連接D-乙酰氨基葡萄糖的物質(zhì)使其脫 乙?；玫桨被咸烟腔颚?鍵連接的氨基葡萄糖。
[0025] 所述D-乙酰氨基葡萄糖脫乙?；杆釪-乙酰氨基葡萄糖或β-鍵連接D-乙酰 氨基葡萄糖的物質(zhì)的反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度為4~60°C，反應(yīng)pH為7. 0~10. 5,反應(yīng)底物 的濃度為20~200mM;優(yōu)選的：反應(yīng)溫度為42°C，反應(yīng)pH為9. 0,反應(yīng)底物濃度為95. 78mM， 此時，反應(yīng)速率達(dá)到最大。
[0026] 本發(fā)明涉及從一種海洋圓桿菌（Cyclobacteriummarinum)中克隆的D-乙酰氨基 葡萄糖脫乙?；富颉Ｋ鼍幋a序列如SEQN0. 2所示。本發(fā)明還涉及包含所述D-乙 酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶編碼序列的重組表達(dá)載體，D-乙酰氨基葡萄糖脫乙?；富?的核苷酸序列經(jīng)EcoRI和Xhol雙酶切后與EcoRI和Xhol雙酶切的pET28a(+)載體連接， 得到大腸重組表達(dá)載體pET28a(+)_N_acetylglucosaminedeacetylase。本發(fā)明還制備 包含本發(fā)明D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶編碼基因的轉(zhuǎn)基因重組菌，將重組好的表達(dá)載 體pET28a(+) -N-acetylglucosaminedeacetylase轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)，構(gòu)成表達(dá) D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶的轉(zhuǎn)基因重組菌。
[0027] 將轉(zhuǎn)基因重組菌通過正常的振蕩培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)目的蛋白，通過 超聲裂解細(xì)胞，收獲表達(dá)產(chǎn)物，表達(dá)產(chǎn)物利用Ni-NTA瓊脂糖凝膠進(jìn)行親和純化。對得到的 純化形式的D-乙酰氨基葡萄糖脫乙?；傅幕钚詶l件進(jìn)行優(yōu)化，酶的活性受如底物特異 性，pH，溫度和金屬離子等的影響。本發(fā)明中也對D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶的活性進(jìn) 行這些方面的優(yōu)化。
[0028] 本發(fā)明還對D-乙酰氨基葡萄糖脫乙?；傅膽?yīng)用進(jìn)行簡單涉及，利用核磁共振 技術(shù)檢測D-乙酰氨基葡萄糖脫乙?；冈跊]有任何反應(yīng)緩沖液和添加物的狀態(tài)下的轉(zhuǎn)化 效率。其轉(zhuǎn)化結(jié)果如圖5所示。
[0029] 本發(fā)明的有益效果：
[0030] 本技術(shù)方案可以通過生物工程技術(shù)得到一種優(yōu)質(zhì)的D-乙酰氨基葡萄糖脫乙?；?酶，實(shí)現(xiàn)D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶的異源大量表達(dá)，底物特異性強(qiáng)，反應(yīng)效率高，相比 于化學(xué)法生產(chǎn)氨基葡萄糖，酶法生產(chǎn)將更具有極大的工業(yè)化潛力。
【附圖說明】
[0031] 圖1為海洋圓桿菌（Cyclobacteriummarinum)來源的D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰 基酶編碼基因在質(zhì)粒pET28a(+)上的結(jié)構(gòu)圖。
[0032] 圖2為大腸桿