專利名稱：4－半乳糖基－木糖在評(píng)估人體內(nèi)腸乳糖酶缺乏的非侵入性診斷試驗(yàn)中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥學(xué)領(lǐng)域，可應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，其作為一種檢測人體內(nèi)腸乳糖酶缺乏的非侵入性診斷試驗(yàn)，應(yīng)用于評(píng)估該酶的活性，另外也應(yīng)用于其它任何需要評(píng)估體內(nèi)酶水平的正?；虿±頎顟B(tài)。
現(xiàn)有技術(shù)首先在小腸的粘膜內(nèi)發(fā)現(xiàn)了腸乳糖酶，該酶的活性中心暴露于腸的內(nèi)腔，其為一種負(fù)責(zé)水解牛奶中的乳糖的酶。乳糖在腸中不能被直接吸收，因此需要先將其水解為半乳糖和葡萄糖，最終半乳糖和葡萄糖被吸收。腸乳糖酶缺乏將導(dǎo)致乳糖吸收不良和乳糖不耐受。如果缺乏該酶，則乳糖在小腸中不能被水解，這將延遲胃排空速度，延長腸通過時(shí)間，增大滲透壓，延長流體在腸內(nèi)腔的滯留時(shí)間，由此引起細(xì)菌在結(jié)腸中發(fā)酵，產(chǎn)生氣體，如氫氣、甲烷和二氧化碳，并生成短鏈脂肪酸。上述情況將造成消化作用減慢，并減少單糖的吸收。這將導(dǎo)致疼痛、胃痙攣、腹脹、聽得見的腸鳴和腹瀉。對(duì)于成年人上述臨床表征被稱作低乳糖酶癥或乳糖不耐受，這是一種最常見的遺傳疾病，幾乎影響人類的大約一半的人口。對(duì)于新生兒，酶的先天性缺乏將抑制乳糖的正常利用，減少了能量供應(yīng)，以及造成未水解二糖在腸道中的累積，這將引起嚴(yán)重的疾病，如強(qiáng)烈腹瀉和脫水，這樣的新生兒需要早期診斷，改變食物結(jié)構(gòu)，服用不含乳糖的牛奶。此外，乳糖缺乏還對(duì)多數(shù)腸道疾病具有繼發(fā)性影響，其中腸道疾病涉及到腸道粘膜不同程度的損壞，如乳糜瀉、慢性腸道感染(Crohn’s疾病和潰瘍性結(jié)腸炎)、痙攣性結(jié)腸綜合癥、腸切除、囊性纖維化、早產(chǎn)新生兒、化療的實(shí)施、或者在某些老年人中作為附加疾病的上述疾病。因此，在胃腸病學(xué)和兒科學(xué)、病理學(xué)方法中非常關(guān)注乳糖酶活性的評(píng)估，其中在病理學(xué)方法中通常需要評(píng)估腸道粘膜的功能完整性或需要作是否缺乏該酶的區(qū)分性診斷。迄今為止，診斷腸道乳糖酶是否缺乏的方法基于如下方面-通過內(nèi)窺檢查術(shù)活檢獲取患者小腸內(nèi)膜樣品，對(duì)上述樣品的乳糖酶直接進(jìn)行評(píng)估(1)。
-口服過量的乳糖(1-2g/公斤體重)，評(píng)估由于乳糖酶缺乏所造成的代謝后果，如個(gè)體所表現(xiàn)出的乳糖酶缺乏癥狀(腹痛、腹脹、腹瀉等)，并評(píng)估血漿中葡萄糖的量(2)、血漿(2)和尿(3)中半乳糖的量、和糞便(4)中碳水化合物的量。對(duì)服用過量乳糖后所呼出的氣體進(jìn)行評(píng)估，氣體是在服用過量乳糖后結(jié)腸中未代謝乳糖進(jìn)行發(fā)酵所產(chǎn)生的，如評(píng)估所呼出的氣體中的氫氣(5)、14CO2(6)、或13CO2(7)，或另外再評(píng)估13CO2/H2(8)的比例，其中所服用的乳糖分別含有14-C-乳糖或13C-乳糖。在服用過量包含13C-乳糖和2H-葡萄糖的乳糖后，評(píng)估血清中13C/2H-葡萄糖(9)的比例。
評(píng)估腸道乳糖酶的其它方法是應(yīng)用某些特定的二糖，該二糖在結(jié)構(gòu)上與乳糖類似，因而具有作為乳糖酶底物的功能。因此在服用后，其被腸道乳糖酶轉(zhuǎn)化為特定的單糖，然后單糖被腸道內(nèi)膜吸收，在個(gè)體的尿排泄物中可以檢測到某個(gè)或某些單糖。因此，西班牙專利ES-P-478590和ES-P-482073記載了下述體內(nèi)評(píng)估方法口服施用3-O-甲基乳糖，評(píng)估尿中的3-O-甲基-D葡萄糖。
另一方面，西班牙專利ES-P-9001680記載了二糖4-O-β-吡喃半乳糖基-D-木糖的制備方法，該二糖的分子式為 其被用于體內(nèi)評(píng)估腸道乳糖酶的活性。上述二糖是口服施用，作為腸道乳糖酶的底物，其在腸道中水解為木糖和半乳糖，然后被吸收，其中木糖在尿中排泄，因此可以使用簡單的比色法直接對(duì)其進(jìn)行滴定。排泄的木糖的量與腸道乳糖酶的水平相關(guān)。
西班牙專利ES-P-9001680也記載了制備4-O-β-吡喃半乳糖基-D-木糖的方法，其包含從苯甲基β-b-吡喃木糖苷進(jìn)行合成的過程，其中包含選擇性保護(hù)反應(yīng)、糖基化反應(yīng)和去保護(hù)反應(yīng)。
西班牙專利ES-P-9502185記載了制備二糖吡喃半乳糖基-木糖混合物的酶促反應(yīng)方法，該混合物包含4-O-β-吡喃半乳糖基-D-木糖及其異構(gòu)體2-O-β-吡喃半乳糖基-D-木糖和3-O-β-吡喃半乳糖基-D-木糖。西班牙專利ES-P-9502185也記載了上述三種異構(gòu)體的混合物在評(píng)估未斷奶老鼠體內(nèi)腸道乳糖酶活性方面的用途，研究結(jié)果表明，在動(dòng)物生長期間，口服施用了上述混合物的動(dòng)物，其尿中木糖的排泄量與其尸檢腸道粘膜后所得到的腸道乳糖酶活性成比例關(guān)系。
西班牙專利ES-P-20010419記載了一鐘制備4-O-β-吡喃半乳糖基-D-木糖的酶促反應(yīng)方法，該方法包含D-木糖和β-D-吡喃木糖苷底物之間的酶促反應(yīng)，和后續(xù)的分離、純化4-O-β-吡喃半乳糖基-D-木糖的步驟。
本發(fā)明的一個(gè)方面是公開根據(jù)西班牙專利ES-P-20010419記載的方法制備的4-O-β-吡喃半乳糖基-D-木糖在評(píng)估人體內(nèi)腸道乳糖酶活性是否缺乏的一種非侵入性診斷試驗(yàn)中的用途。同時(shí)本發(fā)明使用了一種不同于上述專利所記載的替代方法，即評(píng)估血液中木糖的含量，該方法對(duì)于診斷試驗(yàn)的實(shí)施具有實(shí)質(zhì)性的優(yōu)點(diǎn)。
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發(fā)明描述在前面所描述的當(dāng)前用于診斷腸道乳糖酶是否缺乏的方法存在一些缺點(diǎn)，也就是可靠性不足并且使患者感到非常不舒服，除此之外還需要下文中所述的專門的儀器。通過內(nèi)窺檢查術(shù)利用活檢方法對(duì)患者小腸粘膜樣品進(jìn)行乳糖酶直接評(píng)估的方法，除了是一種血腥的和侵入性的方法外，還需要X-射線控制器，但其結(jié)果僅表明腸道特定部位或區(qū)域的酶的活性。此外，因?yàn)閮?nèi)窺鏡在進(jìn)入時(shí)具有局限性，因此該方法通常不能獲取酶最大量存在區(qū)域(中間空腸)的檢測結(jié)果，并且該方法所獲得的結(jié)果在不同樣品間不具備可比性。因此，該方法不能提供個(gè)體酶總活性的信息。除此之外的其它方法均是非侵入性試驗(yàn)，包含口服過量乳糖(從25到50g)，隨后評(píng)估乳糖酶缺乏對(duì)代謝所造成的影響，如檢測所呼出的氣體，其中該氣體是大腸中的細(xì)菌對(duì)未水解乳糖進(jìn)行代謝的結(jié)果。這些試驗(yàn)是非直接的，不能實(shí)現(xiàn)酶活性的體內(nèi)直接測定，并且這些試驗(yàn)受到個(gè)體內(nèi)源性氣體產(chǎn)生能力的影響，如H2或CO2。此外，該產(chǎn)生能力對(duì)于不同的個(gè)體是有差別的，其受到不同因素的影響，如吸煙的習(xí)慣、飲食習(xí)慣、輕瀉藥物或口服抗生藥物的使用，因此產(chǎn)生很大比例的假陽性結(jié)果和假陰性結(jié)果，因此說上述方法不十分可靠。另一方面，在服用過量乳糖的試驗(yàn)中需要攝入比生理平衡膳食高的多的糖，對(duì)于乳糖酶缺乏的個(gè)體，這會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的胃腸問題，如腹痛、腹脹和腹瀉。對(duì)于懷疑乳糖酶缺乏的未斷奶的嬰兒，服用過量的乳糖有可能是非常危險(xiǎn)的，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的腹瀉，并具有潛在脫水的危險(xiǎn)，所以很明顯對(duì)于未斷奶的嬰兒需要使用其它類型的試驗(yàn)。服用過量乳糖的試驗(yàn)和其不同類型的試驗(yàn)，在實(shí)施時(shí)需要專門的儀器，如氣相色譜或電化學(xué)檢測儀，以測定所呼出的氣體，這些儀器盡管在醫(yī)院中很常見，但是在健康中心則一般不常見到。另外在服用過量1-14C-葡萄糖或13C-乳糖/2H-葡萄糖的情況下，還需要使用閃爍計(jì)數(shù)器或更加專門更加專業(yè)的儀器，如氣相色譜或質(zhì)譜，來檢測14CO2、13CO2、13C/2H-葡萄糖的含量?？诜┯?-O-甲基乳糖，隨后評(píng)估尿中3-O-甲基-D-葡萄糖的方法，迄今為止在臨床實(shí)踐中還未見應(yīng)用，一方面該方法使血液吸收了非生理性的化合物，如3-O-甲基-D-葡萄糖，而且還需要?dú)庀嗌V或高效液相色譜來測定其含量。
發(fā)明目的本發(fā)明提供了一種體內(nèi)評(píng)估腸道乳糖酶活性的技術(shù)，該技術(shù)是對(duì)該酶的一種非侵入性診斷試驗(yàn)，其將個(gè)體作為一個(gè)整體直接評(píng)估酶的總活性，從而克服了上述現(xiàn)有診斷試驗(yàn)所存在的不足。該技術(shù)不需要評(píng)估乳糖酶缺乏所產(chǎn)生的后果。不需要專門的儀器，并且對(duì)乳糖酶缺乏的患者不會(huì)造成明顯不舒服的感覺，此外該技術(shù)除具有上述優(yōu)點(diǎn)外，還具備可靠性高的優(yōu)點(diǎn)，該優(yōu)點(diǎn)將在下面加以描述。
在該方法中，對(duì)人體使用了4-半乳糖基-木糖，并結(jié)合使用了一種評(píng)估尿中木糖的替代技術(shù)，該方法包括向患者施用4-半乳糖基-木糖，之后評(píng)估血液中木糖的濃度。對(duì)于每位患者，僅需要抽取極少量的血液樣品(2-3滴)，所以該方法尤其適用于兒童和新生兒，因?yàn)樵摲椒▽?duì)上述個(gè)體僅產(chǎn)生很少的不適感，并且該方法更加可靠。
發(fā)明簡述本發(fā)明的目的是基于4-半乳糖基-木糖(4-O-β-吡喃半乳糖苷-D-木糖)。該化合物是乳糖的結(jié)構(gòu)類似物，是乳糖酶的生理性底物，這樣口服施用上述化合物后，該化合物即被腸道粘膜的酶水解。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)入血液，其中之一即木糖出現(xiàn)在尿中，可以通過一種簡單的比色方法對(duì)其進(jìn)行滴定?？蛇x擇的，本發(fā)明公開了評(píng)估血液中木糖的方法，該方法僅需要幾滴血液樣品，并能夠給出高靈敏度的木糖測定結(jié)果。該替代方法具有實(shí)質(zhì)性的優(yōu)點(diǎn)，特別是對(duì)于未斷奶的嬰兒和兒童，該方法不需要幾小時(shí)的取尿時(shí)間，僅產(chǎn)生很小的不適感，并且可靠性更高。本發(fā)明顯示，乳糖耐受的人體在攝入4-半乳糖基-木糖后，在其尿和血液中檢測到木糖的存在，這是上述個(gè)體腸道乳糖酶活性表達(dá)的結(jié)果。同時(shí)本發(fā)明還顯示，給患有腸道乳糖酶缺陷癥(乳糖不耐受)的人體施用4-半乳糖基-木糖后，木糖在尿中的排泄以及木糖在血液中的濃度均有所減少。此外，本發(fā)明第一次證明使用4-半乳糖基-木糖并評(píng)估尿中木糖的含量能夠可靠且簡單地區(qū)分乳糖酶缺乏的個(gè)體和僅是對(duì)牛奶中的某些成分敏感的個(gè)體。與現(xiàn)有的診斷腸道乳糖酶是否缺乏的方法相比，本發(fā)明所公開的方法具有如下的優(yōu)點(diǎn)高度可靠性，本發(fā)明方法是一種直接評(píng)估酶活性的方法，其僅評(píng)估尿或血漿中木糖的含量，而不需要評(píng)估乳糖酶缺乏對(duì)代謝造成的影響，如未水解的二糖在結(jié)腸中發(fā)酵而生成的H2或CO2。因此，在本部分第一段所描述的那些因素不會(huì)對(duì)由本發(fā)明方法所獲得的結(jié)果帶來任何影響，其中上述因素影響了內(nèi)源性氣體產(chǎn)生、并由此顯著降低了服用過量乳糖后所呼出氣體的檢測結(jié)果可靠性，并經(jīng)常產(chǎn)生假陽性和假陰性結(jié)果。
所提供的信息直接代表著個(gè)體體內(nèi)總?cè)樘敲富钚浴?br> 高度靈敏度使用基于fluoroglucinol反應(yīng)的比色分析方法對(duì)木糖進(jìn)行滴定時(shí)，其檢測下限是從0.1到0.05μg。
所需要的儀器很簡單，在任何健康中心，即使是最小型的臨床生化實(shí)驗(yàn)室，也是常見的，因?yàn)樯鲜雒阁w內(nèi)評(píng)估方法僅需要木糖滴定，其可以通過簡單的比色試驗(yàn)來完成。
在實(shí)施該試驗(yàn)時(shí)，不會(huì)給乳糖酶缺乏患者帶來任何胃腸不適，這是因?yàn)榭诜┯玫?-半乳糖基-木糖的劑量非常小，對(duì)于成年人，劑量為0.25g時(shí)就能在尿中檢測到一定量的木糖，劑量為3.0g時(shí)就能在血液中檢測到一定量的木糖。因此可以預(yù)見對(duì)于兒童，需要施用的劑量會(huì)更低。降低二糖劑量的原因是本發(fā)明木糖評(píng)估所具有的高度靈敏度。還應(yīng)該值得注意的是，腸道乳糖酶水解4-半乳糖基-木糖產(chǎn)生了兩種生理性產(chǎn)物，半乳糖和木糖，這兩種糖最終會(huì)被腸道粘膜吸收。
實(shí)施本發(fā)明方法不需要個(gè)體的積極配合，因此該方法對(duì)于未斷奶的嬰兒尤其適合。
本發(fā)明方法不需要給個(gè)體施用帶有同位素標(biāo)記的化合物。


附圖1以發(fā)育期間未斷奶大鼠為試驗(yàn)材料，口服施用4mg 4-半乳糖基-木糖后，木糖在尿中的排泄情況(黑色圓圈)和腸道乳糖酶活性(白色圓圈)。
附圖2以發(fā)育期間未斷奶大鼠為試驗(yàn)材料，口服施用8mg 4-半乳糖基-木糖后，其血漿中的木糖水平(黑色圓圈)和腸道乳糖酶活性(白色圓圈)。
附圖3以對(duì)牛奶攝入耐受的成年人志愿者為試驗(yàn)者(個(gè)體1，男性)，口服施用1g 4-半乳糖基-木糖后，木糖在尿中的排泄情況。
附圖4以兩個(gè)對(duì)牛奶攝入耐受的成年人志愿者為受試者(個(gè)體1，男性；個(gè)體2，女性)，分別施用不同劑量的4-半乳糖基-木糖后，隨著時(shí)間的推移，木糖在尿中的排泄情況。
附圖5以人志愿者為受試者，將250mg的4-半乳糖基-木糖分別口服施用給三個(gè)男性牛奶耐受者(個(gè)體1(黑色圓圈，白色圓圈)、個(gè)體7(黑色三角，白色三角)和個(gè)體11(黑色方框，白色方框))和5個(gè)女性牛奶耐受者(個(gè)體2(黑色圓圈，白色圓圈)、個(gè)體3(黑色方框，白色方框)、個(gè)體6(黑色菱形，白色菱形)、個(gè)體8(黑色反三角，白色反三角)和個(gè)體9(黑色三角，白色三角))，隨著時(shí)間的推移，木糖在尿中的排泄情況。
附圖6將0.25g 4-半乳糖基-木糖口服施用給三位對(duì)牛奶不耐受的志愿者(個(gè)體12(男性)、個(gè)體5(女性)和個(gè)體10(女性))，隨著時(shí)間的推移，木糖在尿中的排泄情況。
附圖7在攝入0.28g的4-半乳糖基-木糖后，利用氣相色譜分別對(duì)牛奶攝入耐受的個(gè)體1和牛奶不耐受的個(gè)體12進(jìn)行分析，結(jié)果顯示了木糖在尿中的排泄情況。
附圖8以成年人志愿者為受試者，將3g 4-半乳糖基-木糖分別口服施用給對(duì)牛奶攝入具備正常耐受的個(gè)體1(白色圓圈)和個(gè)體2(黑色圓圈)，以及施用給低乳糖酶癥的個(gè)體12(黑色方框)，結(jié)果顯示了木糖在血漿中的水平。
發(fā)明詳述本發(fā)明方法由在禁食至少8個(gè)小時(shí)后，給人體口服施用4-半乳糖基-木糖的水溶液。然后在特定的時(shí)間間隔后，評(píng)估排泄在尿中的木糖的量。該方法還可以通過評(píng)估血液中存在于血漿或血清中的木糖的量來實(shí)施，其中血液樣品是在攝入二糖一段時(shí)間后抽取的?？梢酝ㄟ^比色分析方法來滴定木糖，該分析方法是基于與fluoroglucinol的反應(yīng)，并根據(jù)所使用的方案，選擇基礎(chǔ)尿液、基礎(chǔ)血漿、或者基礎(chǔ)血清作為對(duì)照。一旦攝入4-半乳糖基-木糖，其即被腸道乳糖酶水解，生成酶促反應(yīng)產(chǎn)物，半乳糖和木糖，然后上述兩種糖通過腸道粘膜吸收到血液中。之后，木糖排泄到尿中，因此在攝入二糖后，血液中和尿中木糖的量直接反應(yīng)了體內(nèi)乳糖酶的活性。
用于實(shí)施本發(fā)明的4-半乳糖基-木糖可以根據(jù)西班牙專利ES-P-20010419所記載的方法進(jìn)行制備。
在口服施用4-半乳糖基-木糖后，木糖在尿中的排泄量，以及在血液中的含量與腸道乳糖酶活性非常相關(guān)，對(duì)于未斷奶大鼠的檢測結(jié)果顯示在附圖1和2中，并在實(shí)施例1和2中加以了描述。
具備乳糖正常消化能力或乳糖耐受的成年人志愿者，也就是說那些具備正常水平的腸道乳糖酶活性，在攝入牛奶或任何其它奶產(chǎn)品后沒有任何類型的胃腸不適或胃腸疾病的人，這些人在攝入4-半乳糖基-木糖8小時(shí)后，在其尿中檢測到木糖的持續(xù)排泄，這是二糖被腸道乳糖酶水解的結(jié)果。上述結(jié)果表明4-半乳糖基-木糖是人腸道乳糖酶的一種體內(nèi)底物，上述結(jié)果顯示在附圖3、4和5中，并在實(shí)施例3到11中加以了描述。
乳糖耐受的成年人志愿者，施用4-半乳糖基-木糖的量分別為0.25g、0.5g、1g和3g時(shí)，發(fā)現(xiàn)木糖在尿中的排泄量隨著攝入量的增加而增加。在對(duì)個(gè)體的研究中，發(fā)現(xiàn)攝入4-半乳糖基-木糖不會(huì)造成任何胃腸不適或胃腸疾病。這表明個(gè)體對(duì)木糖的排泄量與所施用的4-半乳糖基-木糖的劑量是相關(guān)的。當(dāng)個(gè)體攝入4-半乳糖基-木糖的劑量為0.25g時(shí)，在其尿中就能檢測到可靠的木糖含量結(jié)果，上述結(jié)果顯示在附圖4中，并在實(shí)施例4和5中加以了描述。
當(dāng)給同一性別乳糖耐受的成年人志愿者施用相同劑量的4-半乳糖基-木糖時(shí)，不同個(gè)體排泄在尿中的木糖的含量均在同一范圍內(nèi)。這表明使用該方法所得到的結(jié)果是可靠的，在不同正常個(gè)體之間具備再現(xiàn)性，上述結(jié)果顯示在附圖5中，并在實(shí)施例4到11中加以了描述。
給乳糖不耐受的成年人志愿者，即腸道乳糖酶缺乏攜帶者，施用0.25g的半乳糖基-木糖，發(fā)現(xiàn)其尿中木糖的排泄量顯著低于乳糖耐受志愿者的平均值，降低的程度代表著乳糖酶缺乏的程度。這是從兩個(gè)乳糖酶不耐受的個(gè)體觀察到的結(jié)果，其中之一在以前已被診斷為患有嚴(yán)重的低乳糖酶癥，另一個(gè)個(gè)體自稱從出生即對(duì)乳糖不耐受，上述結(jié)果分別顯示在附圖6A和6B中，并在實(shí)施例12和13中分別加以了描述。這兩個(gè)乳糖不耐受的個(gè)體在攝入4-半乳糖基-木糖后，沒有產(chǎn)生任何類型的胃腸不適或胃腸疾病。這表明，本發(fā)明方法適用于體內(nèi)評(píng)估腸道乳糖酶活性，并且是一種有效的對(duì)人體乳糖酶是否缺乏進(jìn)行非侵入性診斷的試驗(yàn)方法。該方法不會(huì)給乳糖酶缺乏的個(gè)體造成明顯的不適感，而且僅需要施用0.25g劑量的4-半乳糖基-木糖，就能獲得是否極度缺乏該酶的可靠的檢測結(jié)果。
口服施用4-半乳糖基-木糖，隨后評(píng)估尿中木糖的含量，上述過程能夠?qū)⑷樘遣荒褪艿幕颊?，即腸道乳糖酶缺乏攜帶者，與對(duì)牛奶的攝入不耐受的患者區(qū)分開來，其中后者之所以對(duì)牛奶不耐受是因?yàn)樗麄儗?duì)牛奶中的一些成分過敏，他們不是真正的乳糖酶缺乏攜帶者，其尿中木糖的排泄量在正常的范圍內(nèi)。上述結(jié)果顯示在附圖6C中，并在實(shí)施例14中加以了描述。附圖6C顯示了自稱乳糖不耐受的成年志愿者在攝入0.25g的4-半乳糖基-木糖后，尿中木糖的排泄情況，該志愿者自稱從小以來他攝入牛奶或奶產(chǎn)品后就發(fā)生過敏性皮膚反應(yīng)，他的木糖排泄情況與乳糖耐受的女性志愿者的平均值沒有顯著的差別。該過敏性乳糖不耐受的成年女性志愿者在攝入4-半乳糖基-木糖后，沒有產(chǎn)生任何過敏反應(yīng)或任何類型的胃腸疾病。
給乳糖耐受的個(gè)體施用0.25g的4-半乳糖基-木糖后，木糖在尿中的排泄情況，和對(duì)低乳糖酶癥個(gè)體施用上述二糖后，木糖在尿中排泄降低的情況，顯示在附圖7中，并在實(shí)施例15中加以了描述，其中所使用的木糖評(píng)估技術(shù)不同于上述與fluoroglucinol的比色反應(yīng)，這樣的技術(shù)如氣相色譜。另外上述附圖7還顯示出乳糖不耐受的低乳糖酶癥個(gè)體在施用4-半乳糖基-木糖后，其尿中木糖的排泄量顯著低于乳糖耐受的個(gè)體。
給乳糖耐受的成年人志愿者口服施用3g的4-半乳糖基-木糖后，使用fluoroglucinol的比色滴定法滴定血漿中的木糖，發(fā)現(xiàn)木糖含量在攝入二糖2小時(shí)后達(dá)到最大值。給被診斷為低乳糖酶癥的乳糖不耐受成年人志愿者口服施用相同劑量的4-半乳糖基-木糖，其在攝入二糖2小時(shí)后所檢測到的血漿中木糖的含量顯著低于上述乳糖耐受的志愿者。上述試驗(yàn)對(duì)乳糖不耐受的上述個(gè)體沒有造成任何胃腸不適或胃腸疾病。上述結(jié)果顯示在附圖8中，并在實(shí)施例16中加以了描述，并且該結(jié)果表明口服施用4-半乳糖基-木糖，之后評(píng)估血液中的木糖的含量，這樣就能夠?qū)δc道乳糖酶活性進(jìn)行體內(nèi)評(píng)估，并且這是一種有效的對(duì)人體乳糖酶是否缺乏進(jìn)行非侵入性診斷的試驗(yàn)方法。
為了考察乳糖耐受或乳糖不耐受的人志愿者口服施用4-半乳糖基-木糖后，其血液和尿中木糖含量隨時(shí)間的推移而變化的情況，使用木糖fluoroglucinol比色滴定法，使用了成年個(gè)體的如下體液樣品在攝入4-半乳糖基-木糖前的基礎(chǔ)尿液，攝入上述化合物后3小時(shí)或4小時(shí)的總尿液，或其它樣品，包括攝入4-半乳糖基-木糖前的基礎(chǔ)血液樣品，和另外一個(gè)施用上述化合物后2小時(shí)時(shí)所抽取的血液樣品。對(duì)于上述血液樣品，只需要0.2ml(2-3滴)就足夠了。
另外，該試驗(yàn)方法非常適用于兒童和未斷奶的嬰兒，用于評(píng)估尿中以及血液中的木糖的含量?？诜┯玫?-半乳糖基-木糖的劑量可以降低一半，使用0.2ml(2-3滴)或接近該值的血液樣品就足夠了。
評(píng)估血液中木糖的含量具有實(shí)質(zhì)上的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)閷?shí)施該方法只需要50μl的血清或血漿，因此對(duì)于每個(gè)血液樣品只要2-3滴就足夠了。一般來說，這尤其適用于未斷奶的嬰兒和兒童，對(duì)于他們來說，連續(xù)收集幾個(gè)小時(shí)的總尿液是很困難的，不能確保收集到的尿液的量，而且還有可能在會(huì)陰部位造成皮膚反應(yīng)。本發(fā)明評(píng)估方法具有更小的不適感，而且結(jié)果更加可靠。
發(fā)明實(shí)施例實(shí)施例1口服施用4-半乳糖基-木糖后，木糖在尿中的排泄量和木糖在血液中的含量與腸道乳糖酶活性的相關(guān)性。該實(shí)施例對(duì)未斷奶大鼠進(jìn)行了比較研究，在動(dòng)物生長期間，給它們口服施用4-半乳糖基-木糖，之后對(duì)其尿中木糖的排泄量與其尸檢腸道粘膜后所得到的腸道乳糖酶的活性進(jìn)行了比較，其中已知酶活性在生長期間具有生理性降低的特性。為了實(shí)施該試驗(yàn)，將兩窩出生12天共20只的未斷奶大鼠與各自的母鼠分離，禁食6小時(shí)。之后，通過腹部向膀胱施加壓力收集每只大鼠的基礎(chǔ)尿液，之后使用食管內(nèi)探棒立即給每只大鼠施用4mg稀釋在0.3ml蒸餾水中的4-半乳糖基-木糖。從此時(shí)開始，收集隨后6小時(shí)內(nèi)的尿液，并通過基于與fluoroglucinol反應(yīng)的比色分析方法對(duì)排泄到尿液中的木糖進(jìn)行滴定，并以基礎(chǔ)尿液作為對(duì)照。收集完尿液后，立即將其中4只動(dòng)物殺死，對(duì)其腸道粘膜的乳糖酶活性直接進(jìn)行評(píng)估。切割動(dòng)物的一段小腸，洗滌，用玻璃將粘膜刮下，并將收集到的粘膜勻漿。用分光光度計(jì)測定勻漿產(chǎn)物的乳糖酶活性。剩余的動(dòng)物放回母鼠處，然后在15、18、21、26和35天時(shí)在類似條件下重復(fù)上述試驗(yàn)，到最后該組所有的動(dòng)物均被殺死了。上述試驗(yàn)的結(jié)果顯示在附圖1中。從該圖可以看到1)由于腸道乳糖酶的作用，所施用的4-半乳糖基-木糖被水解，在尿中檢測到了木糖的存在；2)在動(dòng)物生長期間，口服施用4-半乳糖基-木糖后，木糖在尿中的排泄速度與已知的腸道乳糖酶活性在生長期間的生理性降低相一致。木糖在尿中的排泄量與腸道乳糖酶的活性極其相關(guān)，兩組參數(shù)之間的線性相關(guān)系數(shù)(r)為0.96，如附圖1插圖所示。以前的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)無論動(dòng)物的年齡是多大，當(dāng)所施用的4-半乳糖基-木糖的劑量從2到32mg時(shí)，木糖在尿中的排泄量總隨著口服施用4-半乳糖基-木糖的量的增加而增加，其中二糖均稀釋在0.3ml的水中。上述試驗(yàn)表明本發(fā)明方法能夠用于評(píng)估體內(nèi)腸道乳糖酶的活性。該方法可以用于診斷目的的酶活性的非侵入性評(píng)估，而且不出血。
實(shí)施例2口服施用4-半乳糖基-木糖后，木糖在尿中的排泄量和木糖在血液中的含量與腸道乳糖酶活性的相關(guān)性。該實(shí)施例對(duì)未斷奶大鼠進(jìn)行了比較研究，在動(dòng)物生長期間，給它們口服施用4-半乳糖基-木糖，之后分析了其血清中木糖的含量，并與其尸檢腸道粘膜后所得到的腸道乳糖酶的活性進(jìn)行了比較。為了實(shí)施該試驗(yàn)，將兩窩出生12天共60只的未斷奶大鼠從各自的母鼠處拿開，禁食6小時(shí)。之后，通過心臟穿刺的方法抽取每只大鼠的基礎(chǔ)血液，之后使用食管探棒立即給每只大鼠施用8mg稀釋在0.3ml蒸餾水中的4-半乳糖基-木糖。施用二糖3小時(shí)后，抽取另外一組血液樣品。通過樣品離心獲得血漿或上清液部分，將基礎(chǔ)血液的血漿作為對(duì)照，通過與fluoroglucinol反應(yīng)的比色分析方法滴定其中的木糖。抽取血液后立即將其中4只動(dòng)物殺死，并按照實(shí)施例1中所描述的方法對(duì)動(dòng)物腸道粘膜的乳糖酶活性直接進(jìn)行評(píng)估。剩余的動(dòng)物放回母鼠處，然后在15、18、21、26和35天時(shí)在類似條件下重復(fù)上述試驗(yàn)，到最后該組所有的動(dòng)物均被殺死了。上述試驗(yàn)的結(jié)果顯示在附圖2中。從該圖可以看到1)由于腸道乳糖酶的作用，所施用的4-半乳糖基-木糖被水解，在血漿中檢測到了木糖的存在；2)在動(dòng)物生長期間，口服施用4-半乳糖基-木糖后，木糖在血漿中出現(xiàn)速度與腸道乳糖酶活性在生長期間的生理性降低相一致，木糖在血漿中的出現(xiàn)與腸道乳糖酶的活性極其相關(guān)，兩組參數(shù)之間的線性相關(guān)系數(shù)(r)為0.98，如附圖2插圖所示。在前的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，木糖在血漿中的含量大約在口服施用4-半乳糖基-木糖后3小時(shí)達(dá)到最高水平，當(dāng)二糖的劑量是在4和16mg之間時(shí)，木糖在血漿中的含量隨著口服施用4-半乳糖基-木糖的量的增加而增加，而與動(dòng)物的年齡無關(guān)，上述二糖均稀釋在0.3ml的水中，此外，血清中木糖的含量與血漿的評(píng)估結(jié)果類似，其中血清是將血液樣品室溫下沉淀20分鐘并隨后進(jìn)行離心而得到的。該試驗(yàn)表明，口服施用4-半乳糖基-木糖，并隨后評(píng)估木糖在血漿或血清中的含量，同樣能夠用于評(píng)估體內(nèi)腸道乳糖酶的活性。該方法可以用于診斷目的的酶活性的非侵入性評(píng)估。
下面描述一系列的本發(fā)明實(shí)施方式，這些實(shí)施方式是對(duì)不同的成年人志愿者實(shí)施的，這些志愿者均被書面告知了所要進(jìn)行的研究，并得到了他們志愿參加該項(xiàng)試驗(yàn)的書面同意。
實(shí)施例34-半乳糖基-木糖是人腸道乳糖酶的一種體內(nèi)底物。將1g 4-半乳糖基-木糖溶解在50ml的水中，口服施用給一位禁食8小時(shí)的成年男性志愿者(個(gè)體1)，其中該志愿者對(duì)牛奶和牛奶產(chǎn)品具有正常的耐受性，也就是具有乳糖耐受性。在攝入4-半乳糖基-木糖前收集該個(gè)體的基礎(chǔ)尿液樣品，并在攝入二糖后的8小時(shí)內(nèi)，每小時(shí)收集一次尿液樣品，每一樣品均是每一時(shí)間間隔內(nèi)排泄的總尿液。通過基于與fluoroglucinol反應(yīng)的比色分析方法對(duì)所有的樣品進(jìn)行木糖滴定，并以基礎(chǔ)尿液作為對(duì)照。該個(gè)體攝入4-半乳糖基-木糖后沒有產(chǎn)生任何的胃腸不適或胃腸疾病。該試驗(yàn)的結(jié)果顯示在附圖3中，該圖顯示了每一樣品的木糖含量(白色圓圈)，和隨著時(shí)間的推移，木糖在尿液中累積達(dá)到的量(黑色圓圈)，累積量通過將每一樣品的木糖含量與之前所有樣品的木糖含量相加獲得。從附圖1可以看出1)在個(gè)體口服施用4-半乳糖基-木糖后，木糖被排泄到了尿中2)木糖在尿中的排泄量在施用該化合物2小時(shí)后達(dá)到最大值，并在尿中逐漸累積。該試驗(yàn)表明4-半乳糖基-木糖是人腸道乳糖酶的一種體內(nèi)底物，并且表明，口服施用4-半乳糖基-木糖并隨后評(píng)估木糖在尿液中的排泄量能夠用于人腸道乳糖酶活性的體內(nèi)評(píng)估，該方法能夠用于診斷目的的非侵入性酶活性的評(píng)估。
實(shí)施例4和5乳糖耐受的成年人志愿者，木糖在尿液中的排泄量隨攝入4-半乳糖基-木糖的量而變化。在與實(shí)施例1描述的相同的條件下，將0.25g、0.5g和3g的4-半乳糖基-木糖分別施用給一位乳糖耐受的成年男性志愿者(個(gè)體1，實(shí)施例4)和一位乳糖耐受的成年女性志愿者(個(gè)體2，實(shí)施例5)，并使用與fluoroglucinol反應(yīng)的比色方法滴定兩位志愿者在攝入二糖后、不同的時(shí)間內(nèi)排泄到尿液中的木糖的量。對(duì)于同一志愿者，兩次攝入4-半乳糖基-木糖之間的時(shí)間間隔是大約1周。在所使用的劑量下，4-半乳糖基-木糖的攝入沒有給上述兩位個(gè)體帶來任何胃腸不適或胃腸疾病。該試驗(yàn)的結(jié)果顯示在附圖4A(個(gè)體1，實(shí)施例4)和附圖4B(個(gè)體2，實(shí)施例5)中，其中顯示了在每一施用劑量下，在攝入4-半乳糖基-木糖后，木糖在尿液中累積的量。附圖4A包括了來自附圖3的同一個(gè)體在攝入1g二糖后所獲得的數(shù)據(jù)，這樣可以與其它的施用劑量相比較。從附圖4A和4B可以看出1)個(gè)體1(附圖4A)以及個(gè)體2(附圖4B)在攝入4-半乳糖基-木糖后，在不同的時(shí)間內(nèi)木糖在尿液中的排泄量隨著施用量的增加而增加；當(dāng)4-半乳糖基-木糖的劑量為0.25g時(shí)，在上述兩個(gè)個(gè)體的尿液中就能很容易地檢測到木糖的存在。這些試驗(yàn)表明1)當(dāng)口服施用二糖的劑量為0.25g、0.5g、1g和3g時(shí)，乳糖耐受的成年人志愿者，其尿液中木糖的排泄量隨著攝入二糖劑量的增加而增加，上述所使用的劑量在實(shí)施該試驗(yàn)的過程中，均沒有導(dǎo)致任何胃腸不適或胃腸疾??；和2)當(dāng)4-半乳糖基-木糖的劑量為0.25g時(shí)，就足以在攝入二糖后從尿液中得到非?？煽康哪咎菣z測結(jié)果。
實(shí)施例6到11當(dāng)給相同性別、乳糖耐受的不同成年人志愿者施用相同劑量的4-半乳糖基-木糖時(shí)，不同個(gè)體排泄到尿液中木糖的比例均在相同的范圍內(nèi)。實(shí)施過程如下在與實(shí)施例1描述的相同條件下，將0.25g的4-半乳糖基-木糖施用給8位乳糖耐受的成年志愿者，其中3位男性(個(gè)體1，實(shí)施例4；個(gè)體7，實(shí)施例6；個(gè)體11，實(shí)施例7)和5位女性(個(gè)體2，實(shí)施例5；個(gè)體3，實(shí)施例8；個(gè)體6，實(shí)施例9；個(gè)體8，實(shí)施例10；個(gè)體9，實(shí)施例11)，同樣使用與fluoroglucinol反應(yīng)的比色方法滴定個(gè)體在攝入二糖后、不同時(shí)間內(nèi)排泄到尿液中的木糖的量。在所使用的劑量下，4-半乳糖基-木糖的攝入沒有給這些個(gè)體帶來任何胃腸不適或胃腸疾病。這些試驗(yàn)的結(jié)果顯示在附圖5A、5B、5C、和5D中，該圖顯示了每一樣品的木糖含量(白色符號(hào))，和隨著時(shí)間的推移，木糖在尿液中累積達(dá)到的量(黑色符號(hào))，累積量通過將每一樣品的木糖含量與之前所有樣品的木糖含量相加獲得。5A顯示了每位男性個(gè)體的數(shù)據(jù)(個(gè)體1、3和6)。5B顯示了每位女性個(gè)體的數(shù)據(jù)(個(gè)體2、3、6、8和9)。5C和5D分別顯示了男性個(gè)體和女性個(gè)體的平均值±相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。附圖5A包括了個(gè)體1在攝入0.25g的4-半乳糖基-木糖后所得出的數(shù)據(jù)(附圖4A)；附圖5B包括了個(gè)體2在攝入0.25g的4-半乳糖基-木糖后所得出的數(shù)據(jù)(附圖4B)，這樣可以將他們與相同條件下試驗(yàn)的其余個(gè)體相比較。從附圖5可以看出1)不同的個(gè)體尿液中木糖的累積量在相同的范圍內(nèi)，男性的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過37％，女性的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過8％；和2)在攝入二糖后2小時(shí)和3小時(shí)之間，木糖的排泄量達(dá)到最大值。這些試驗(yàn)表明該方法所得出的結(jié)果對(duì)于兩組個(gè)體具有可靠的再現(xiàn)性。
實(shí)施例12和13給乳糖不耐受的人志愿者施用4-半乳糖基-木糖，隨后評(píng)估尿液中的木糖排泄量，從而檢測出腸道乳糖酶是否缺乏。實(shí)施過程如下將0.25g的4-半乳糖基-木糖施用給兩位帶有乳糖不耐受癥狀的志愿者，然后使用與fluoroglucinol反應(yīng)的比色方法滴定兩位個(gè)體在攝入二糖后、不同時(shí)間內(nèi)排泄到尿液中的木糖的量。其中一位(個(gè)體12，實(shí)施例12)是一位64歲的老年男性患者，自從8歲以來，對(duì)牛奶攝入表現(xiàn)出嚴(yán)重的不耐受癥狀，在以前曾經(jīng)通過腸道活檢以及乳糖過量測試被診斷為低乳糖酶癥。因此，他具有嚴(yán)重的腸道乳糖酶缺乏癥。另外一個(gè)個(gè)體(個(gè)體5，實(shí)施例13)是一位30歲的女性，自稱從出生就有乳糖不耐受癥狀。在那時(shí)有必要對(duì)她停止母乳喂養(yǎng)，給她食用不含乳糖的牛奶。假定她具有遺傳性腸道乳糖酶缺乏癥。在所使用的劑量下，4-半乳糖基-木糖的攝入沒有給這兩位個(gè)體帶來任何胃腸不適或胃腸疾病。這些試驗(yàn)結(jié)果顯示在附圖6A(個(gè)體12，實(shí)施例12)和6B(個(gè)體5，實(shí)施例13)中，該圖顯示了兩個(gè)個(gè)體在不同時(shí)間內(nèi)尿液中累積的木糖的量(黑色符號(hào))，對(duì)于每一個(gè)體，圖中還包括了曲線部分，該曲線來自附圖5C和5D，表示了與他/她性別相對(duì)應(yīng)的乳糖耐受志愿者的平均值，其目的是為了便于比較。從附圖6可以看出1)12號(hào)個(gè)體尿液中木糖的排泄量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于乳糖耐受志愿者的木糖排泄量平均值，該個(gè)體在攝入二糖后8小時(shí)內(nèi)排泄到尿液中木糖的總量為1.33mg，而乳糖耐受的男性志愿者在相同的時(shí)間內(nèi)，木糖排泄量的平均值為35.7±2.0mg，通過比較表明木糖排泄量降低了96％，該結(jié)果與先前診斷為嚴(yán)重腸道乳糖酶缺乏癥的診斷結(jié)果相一致；2)5號(hào)個(gè)體尿液中木糖的排泄量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于乳糖耐受志愿者的木糖排泄量平均值。該個(gè)體在攝入二糖后8小時(shí)內(nèi)排泄到尿液中木糖的總量為4.08mg，而乳糖耐受的女性志愿者在相同的時(shí)間內(nèi)，木糖排泄量的平均值為23.5±2.0mg，通過比較表明木糖排泄量降低了83％，這表明該個(gè)體也具有遺傳性重度腸道乳糖酶缺乏癥，因?yàn)樵搨€(gè)體從出生就表現(xiàn)出乳糖不耐受。上述試驗(yàn)表明本發(fā)明方法能夠用于體內(nèi)評(píng)估腸道乳糖酶活性，和用于非侵入性診斷人體是否缺乏該酶。該方法沒有對(duì)乳糖酶缺乏的個(gè)體造成明顯的不適感，4-半乳糖基-木糖的劑量為0.25g時(shí)，就能很可靠地檢測出成年個(gè)體是否嚴(yán)重缺乏該酶。
實(shí)施例14給乳糖不耐受的人志愿者施用4-半乳糖基-木糖，隨后評(píng)估尿液中木糖的排泄量，該方法能夠?qū)⒛c道乳糖酶缺乏的乳糖不耐受患者和僅對(duì)牛奶攝入不耐受的患者區(qū)分開來，后者之所以對(duì)牛奶不耐受，是因?yàn)樗麄儗?duì)牛奶中的某些成分過敏，并不是因?yàn)槿狈λ鋈樘敲?。?shí)施過程如下給一位25歲的女性志愿者(個(gè)體13)施用0.25g的4-半乳糖基-木糖，隨后使用與fluoroglucinol反應(yīng)的比色方法滴定其在不同時(shí)間內(nèi)排泄到尿液中的木糖的量，其中該個(gè)體從12歲起就表現(xiàn)出乳糖不耐受的癥狀，并且她自稱攝入牛奶后就會(huì)發(fā)生急性皮膚過敏。使用上述劑量的4-半乳糖基-木糖沒有給該個(gè)體造成任何胃腸不適或胃腸疾病。上述試驗(yàn)結(jié)果顯示在附圖6C中，該圖顯示了該受試者在不同時(shí)間內(nèi)尿液中累積的木糖的量(黑色符號(hào))。該圖還包括了曲線部分，該曲線來自附圖5D，表示了與他/她性別相對(duì)應(yīng)的乳糖耐受志愿者的平均值，其目的是為了便于比較。從附圖6C可以看出實(shí)際上該個(gè)體對(duì)木糖的排泄很正常，攝入二糖8小時(shí)內(nèi)所排泄的木糖的總量與乳糖耐受的女性平均值相同。因此，考慮到該患者的臨床自述，得出該個(gè)體不是缺乏該酶的問題，而是對(duì)牛奶中的某些成分過敏。該試驗(yàn)表明本發(fā)明方法能夠?qū)⒛c道乳糖酶缺乏的乳糖不耐受患者和僅對(duì)牛奶攝入不耐受的患者區(qū)分開來，后者之所以對(duì)牛奶不耐受，是因?yàn)樗麄儗?duì)牛奶中的某些成分過敏，并不是真正缺乏所述乳糖酶。
實(shí)施例15和16使用不同于與fluoroglucinol比色反應(yīng)的木糖評(píng)估方法，觀察乳糖耐受的受試者在施用0.25g的4-半乳糖基-木糖后，其尿液中木糖的排泄情況，以及乳糖不耐受的低乳糖酶癥個(gè)體在施用上述二糖后，其尿液中木糖排泄量降低的情況。實(shí)施過程如下將0.25g的4-半乳糖基-木糖施用給一位乳糖耐受的志愿者[個(gè)體1(在實(shí)施例3中曾做過研究對(duì)象)，實(shí)施例15]，和一位患有嚴(yán)重腸道乳糖酶缺乏的乳糖不耐受志愿者[個(gè)體12(在實(shí)施例12中曾做過研究對(duì)象)，實(shí)施例16]，然后使用氣相色譜儀評(píng)估攝入二糖3小時(shí)內(nèi)收集到的總尿液中的木糖的量，其中所使用的色譜儀有一個(gè)火焰電離檢測器和一個(gè)12米長的玻璃螺旋柱，柱的內(nèi)徑是0.2mm，厚度是0.3μm。使用氣相色譜檢測尿液中的木糖需要將木糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿谆坠柰榛苌锏男问?。因此首先將尿液樣品凍干，然后溶解?0μl含吡啶的1mM芐基-β-D-吡喃木糖苷溶液中，其中的芐基-β-D-吡喃木糖苷是內(nèi)參照物。然后另外加入20μl的N-三甲基甲硅烷基咪唑，其作為一種sililating試劑。用超聲波將上述混合物處理一分鐘，然后在60℃加熱30分鐘。然后將1-2μl的樣品注入氣相色譜儀。噴射器和檢測器的溫度是250℃，柱子的溫度梯度如下180℃，2分鐘，然后每分鐘升高5℃，直至達(dá)到250℃。在該溫度下保持15分鐘。計(jì)算相應(yīng)色譜圖的峰面積，從而得出每個(gè)樣品的木糖濃度。上述試驗(yàn)的結(jié)果顯示在附圖7中，其分別顯示了乳糖耐受個(gè)體和乳糖不耐受個(gè)體的基礎(chǔ)尿液樣品的色譜結(jié)果和在攝入二糖3小時(shí)內(nèi)收集到的尿液樣品的色譜結(jié)果。木糖和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物的峰滯留時(shí)間均以分鐘表示。附圖7表明低乳糖酶癥的個(gè)體12在攝入4-半乳糖基-木糖后，在3小時(shí)內(nèi)排泄到尿液中的木糖的量同樣遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于乳糖耐受的個(gè)體1所排泄的量，這可以從色譜圖中木糖所對(duì)應(yīng)的峰面積看出。對(duì)于乳糖不耐受的低乳糖酶癥個(gè)體12，使用該方法所檢測到的結(jié)果是，在3小時(shí)內(nèi)排泄到尿液中木糖的總量是2.1mg，而對(duì)于乳糖耐受的個(gè)體1，所檢測到的結(jié)果是，在3小時(shí)內(nèi)排泄到尿液中木糖的總量是25.2mg，相比之下總量降低了92％，這與該低乳糖酶癥個(gè)體嚴(yán)重缺乏腸道乳糖酶相一致，而且所降低的水平與附圖6A所示的同一個(gè)體在相同時(shí)間內(nèi)使用比色滴定方法所檢測到的降低結(jié)果類似。該試驗(yàn)表明本發(fā)明方法能夠?qū)θ梭w進(jìn)行腸道乳糖酶缺乏的非侵入性診斷，與用于評(píng)估木糖排泄量的方法無關(guān)。
實(shí)施例17-19口服施用4-半乳糖基-木糖，然后評(píng)估血液中木糖的含量，同樣能夠非侵入性診斷腸道乳糖酶是否缺乏。實(shí)施過程如下將3g 4-半乳糖基-木糖施用給兩位乳糖耐受的志愿者[個(gè)體1，實(shí)施例17，個(gè)體2，實(shí)施例18(這兩位在實(shí)施例3到6中曾做過研究對(duì)象)]，和一位乳糖不耐受的低乳糖酶癥個(gè)體12[實(shí)施例19(該個(gè)體在實(shí)施例12和15中曾作為研究對(duì)象)]。使用fluoroglucinol比色滴定方法，分別對(duì)攝入二糖前的個(gè)體血液樣品和攝入二糖后6小時(shí)內(nèi)每間隔大約1小時(shí)時(shí)的血液樣品進(jìn)行滴定，檢測上述血液樣品血漿中的木糖的量，對(duì)于低乳糖酶癥個(gè)體所檢測的樣品是基礎(chǔ)血液樣品，和攝入二糖4-半乳糖基-木糖后2小時(shí)的血液樣品。3g 4-半乳糖基-木糖的攝入量沒有給乳糖不耐受的個(gè)體12或乳糖耐受的兩位個(gè)體造成任何胃腸不適或胃腸疾病。上述試驗(yàn)結(jié)果顯示在附圖8中，從該圖可以看出1)乳糖耐受的個(gè)體1和2在口服施用4-半乳糖基-木糖后，在其血漿中檢測到了木糖，這是該二糖被腸道乳糖酶水解的結(jié)果；2)上述兩位個(gè)體，其血漿中木糖的含量在攝入4-半乳糖基-木糖大約2小時(shí)后達(dá)到最大值，然后逐漸降低，直至在6小時(shí)后檢測不到，這是因?yàn)槟咎沁M(jìn)入了尿液中；3)對(duì)于乳糖不耐受的個(gè)體12，檢測其攝入4-半乳糖基-木糖后2小時(shí)的血液樣品血漿部分的木糖含量，檢測結(jié)果為0.48μg/100μl血漿，而個(gè)體1在相似時(shí)間內(nèi)檢測到的木糖含量是1.72μg/100ml血漿，個(gè)體2檢測到的結(jié)果是1.95μg/100ml血漿，通過比較發(fā)現(xiàn)乳糖不耐受的低乳糖酶癥個(gè)體，其血漿中木糖的含量分別降低了72％和75％。綜合考慮乳糖不耐受個(gè)體在攝入4-半乳糖基-木糖后2小時(shí)檢測到的木糖的量為0.48μg/100μl血漿，以及滴定的靈敏度(木糖與fluoroglucinol反應(yīng)的檢測下限從0.1到0.05μ)，所以血清或血漿的體積為最小50μl時(shí)，就能獲得可靠的檢測結(jié)果，這只相當(dāng)于0.2ml的血液(2到3滴)。上述試驗(yàn)表明口服施用4-半乳糖基-木糖，之后評(píng)估木糖在血液中的含量能夠用于評(píng)估體內(nèi)腸道乳糖酶活性，該方法是一種有效的非侵入性診斷個(gè)體是否缺乏該酶的試驗(yàn)方法。
權(quán)利要求
1. 4-半乳糖基-木糖用于評(píng)估尿液中木糖的存在從而作為腸道乳糖酶缺陷的診斷性試驗(yàn)用于體內(nèi)評(píng)估該酶的用途，該方法包括給禁食至少8小時(shí)的個(gè)體口服施用4-半乳糖基-木糖水溶液，然后評(píng)估尿液中木糖的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其特征在于尿液中木糖的含量是根據(jù)如下測定值之間的差異計(jì)算的，其中之一是攝入4-半乳糖基-木糖后收集到的總尿液的測定值，另一個(gè)是在個(gè)體攝入上述化合物前收集到的基礎(chǔ)尿液的測定值。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述個(gè)體是人。
4. 4-半乳糖基-木糖用于評(píng)估尿液中木糖的存在從而作為腸道乳糖酶缺陷的診斷性試驗(yàn)用于體內(nèi)評(píng)估該酶的用途，該方法包括給禁食至少8小時(shí)的個(gè)體口服施用4-半乳糖基-木糖水溶液，然后評(píng)估血液中木糖的含量。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的用途，其特征在于攝入4-半乳糖基-木糖后，血液中木糖的含量可以在血漿或血清中評(píng)估。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的用途，其特征在于血液中木糖的含量是根據(jù)如下測定值之間的差異計(jì)算出的，其中之一是攝入4-半乳糖基-木糖后從個(gè)體抽取到的血液樣品流體部分的測定值，另一個(gè)是在個(gè)體攝入上述化合物前抽取到的基礎(chǔ)血液的測定值。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的用途，其特征在于所述個(gè)體是人。
8.根據(jù)權(quán)利要求1和4的用途，其特征在于上述用途在用于人個(gè)體時(shí)，能夠?qū)⒛c道乳糖酶缺乏癥攜帶者與那些對(duì)牛奶中的某些成分過敏、而不是缺乏該酶的個(gè)體區(qū)分開來。
全文摘要
本發(fā)明涉及下述方法在人體中的用途，該方法中使用了4－半乳糖基－木糖，并且該方法涉及一種評(píng)估尿中木糖的替代技術(shù)。該方法包括在對(duì)患者口服施用4－半乳糖基－木糖后，檢測患者血液中木糖的濃度，該方法尤其適用于新生兒。該發(fā)明還涉及通過一種非侵入性試驗(yàn)，診斷所述酶是否缺乏的方法，來評(píng)估體內(nèi)腸乳糖活性的技術(shù)，該技術(shù)包括直接評(píng)估個(gè)體中的酶的總活性，而不需要評(píng)估由酶的缺乏所造成的影響。本發(fā)明所述方法并不需要專門的設(shè)備，其并不會(huì)導(dǎo)致乳糖酶缺陷患者任何明顯的不適并值得信賴，因此克服了現(xiàn)有診斷技術(shù)的不便利性。
文檔編號(hào)G01N33/487GK1705752SQ200380101420
公開日2005年12月7日 申請(qǐng)日期2003年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月16日
發(fā)明者J·J·阿拉岡雷耶斯, A·發(fā)蘭德茲馬沃落拉斯阿法雷茲 申請(qǐng)人:康斯喬最高科學(xué)研究公司, 馬德里奧托諾馬大學(xué)