一種血管生成抑制劑多肽hs-1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種血管生成抑制劑多肽HS-1及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，癌癥已經(jīng)成為除心血管疾病之外的另一殺手，癌癥的治療方式主要以手術(shù)、 化療和放療為主、但是化療藥物作用大多是不具有選擇性的，廣泛分布在體內(nèi)各個器官，治 療劑量下對正常組織器官損害很大，雖然患者病情能得到暫時緩解，但是對于患者的生存 質(zhì)量有著嚴(yán)重的危害，并且療效都不是很理想。因而開發(fā)具有腫瘤特異選擇性的化療藥物 成為了研究熱點。
[0003] 整合素受體（Integrin)為細(xì)胞黏附分子家族的重要成員之一，主要介導(dǎo)細(xì)胞與 細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM)之間的相互作用，并介導(dǎo)細(xì)胞與ECM之間的雙向信號傳導(dǎo)。 整合素受體是由α和β亞基以非共價鍵結(jié)合而形成的跨膜異二聚體糖蛋白，屬于I型膜 蛋白，迄今已發(fā)現(xiàn)由18種不同的α亞基和8種β亞基組成的24種整合素。
[0004]內(nèi)皮抑素是能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的一類血管生成抑制劑。內(nèi)皮抑素是膠原 XVIII的C-端片段，分子量為20kDa，能夠特異性抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和迀移，減少膠質(zhì)細(xì) 胞瘤血管和血流，有效抑制小鼠各種原發(fā)腫瘤。內(nèi)皮抑素能夠與整合素α5β1相互作用， 預(yù)示著α5β1可能是endostatin的功能革巴點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種血管生成抑制劑多肽HS-1，多肽HS-1對腫瘤細(xì)胞整合 素受體具有特異選擇性，有良好的應(yīng)用前景，多肽HS-1由19個氨基酸組成，其序列為Ser -Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Asp，本發(fā) 明的19肽是在內(nèi)皮抑素序列中的12肽序列Ser-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala -Val-Pro基礎(chǔ)上進行的改造，Gly-Arg-Asp(GRD)是與整合素受體配體R⑶功能相似的肽序 列，同樣對腫瘤細(xì)胞有著特異選擇功能，所以將12肽與靶向GRD結(jié)合起來，使HS-1具有了 靶向性同時增強了抗腫瘤活性。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0007] -種血管生成抑制劑多肽HS-1，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO. 1所示。
[0008] 本發(fā)明的另一方面，血管生成抑制劑多肽HS-1在診斷、預(yù)防和治療腫瘤中的應(yīng) 用。
[0009] 本發(fā)明的另一方面，血管生成抑制劑多肽HS-1的合成方法，包括以下步驟：
[0010] 1)偶聯(lián)：先將芴甲氧羰?；?天冬氨酸-rink氨基樹脂溶脹于DMF中，接 著用piperdine/DMF溶液脫去Fmoc保護基，用DMF洗滌脫帽子后的樹脂，加入原料Fmoc-Arg(tBU)-〇H，縮合劑用HBTU;kaiser法檢偶聯(lián)反應(yīng)是否完成；重復(fù)上述操作，依次偶 聯(lián)Fmoc-Gly(OtBU) -0H，· · ·FmocGly-OH；Fmoc-Pro(Boc) -〇H；Fmoc-Val(Boc) -〇H.........· · Fmoc-Ser(Pbf)-OH，完成所有直鏈肽合成后，用甲醇洗滌所得到的peptidylresin，真空干 燥箱里充分干燥；
[0011] 2)樹脂與肽的分離裂解：
[0012] ①裂解液的配制：裂解液的配比如下：
[0013]
[0014] ②裂解液配好后，混合均勻，放在冰箱里冷藏，然后將裂解液加入樹脂中磁力攪 拌，然后，將裂解液與樹脂分離，棄去樹脂，保留濾液，將濾液緩慢滴加到冰無水乙醚中，滴 加完畢后，自然沉降，然后在高速離心機里離心，棄去上清液，保留沉淀，將所得沉淀在干燥 箱中干燥，得到干粉粗品；
[0015] 3)純化：
[0016] 取上述干粉粗品，用0. 1 %TFA/H20溶解。經(jīng)過濾后，上樣到C18制備柱，用HPLC 進行梯度洗脫，收集目標(biāo)肽的洗脫液體。
[0017] 本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果是：
[0018] 1.本發(fā)明利用對整合素受體有特異親和力的GRD肽片段與血管生成抑制蛋白內(nèi) 皮抑素的有效序列進行連接，形成了一組全新的多肽藥物。
[0019] 2.本發(fā)明通過多肽的固相合成得到HS-1。
[0020] 3.產(chǎn)物在體內(nèi)外的腫瘤攝取實驗中體現(xiàn)了高效的腫瘤靶向能力，能夠被整合素高 表達細(xì)胞系特異吸收，起到靶向治療的目的。
[0021] 4.在體內(nèi)藥效實驗中，本產(chǎn)品對比血管生成抑制劑內(nèi)皮抑素在抑制腫瘤生長過程 中有顯著的提高，能夠作為實體腫瘤的特效藥物。
【附圖說明】
[0022] 圖1是激光共聚焦實驗觀察RhB-HS-Ι與單獨RhB對不同腫瘤細(xì)胞的攝?。ˋ為 U87MG細(xì)胞，B為MDA-MB-231 細(xì)胞）
[0023] 圖2是HS-1肽近紅外熒光探針對不同腫瘤荷瘤小鼠（A為US7MG荷瘤小鼠，B為 MDA-MB-231荷瘤小鼠）的靶向特異性。
【具體實施方式】
[0024] (一）HS-1肽的合成，包括以下步驟：
[0025] 1)偶聯(lián)：先將Fmoc-ASP-RinkamideMBHAresin(荷甲氧羰?；?天冬氨 酸-rink氨基樹脂）0. 33/2mmol6. 06g溶脹于DMF中，10ml/g樹脂，接著用 20%piperdine/ DMF溶液脫去Fmoc保護基（以下稱之為脫帽），用DMF洗滌脫帽子后的樹脂，加入原料 Fmoc-Arg(tBU)-〇H2. 3g，縮合劑用HBTU1. 44g反應(yīng)時間30分鐘，kaiser法檢測，如檢測結(jié) 果為陰性，說明偶聯(lián)反應(yīng)完成，則接下去進行脫帽，時間30分鐘，如檢測結(jié)果仍為陽性，則 說明偶聯(lián)反應(yīng)未完成或反應(yīng)不完全，需要延長偶聯(lián)時間或重新投料偶聯(lián)，直至偶聯(lián)反應(yīng)完 成。
[0026]重復(fù)上述操作，依次偶聯(lián)Fmoc-Gly(OtBU) -0H，· · ·FmocGly-OH；Fmoc-Pro (Boc)-OH； Fmoc-Val(Boc)-〇H...........Fmoc-Ser(Pbf) -〇H，完成所有直鏈肽合成后，用甲醇洗滌所得到的 peptidylresin，真空干燥箱里充分干燥。
[0027] 2)樹脂與肽的分離裂解：
[0028]①裂解液的配制：裂解液的用量：120ml裂解液（10ml/gpeptidylresin)，裂解 液的配比如下：
[0029]
[0030] ②裂解液配好后，混合均勻，放在〇°C冰箱里，冷藏30min，然后將裂解液加入樹脂 中，25°C條件下，磁力攪拌2. 5h，然后，用砂芯漏斗將裂解液與樹脂分離，棄去樹脂，保留濾 液。將濾液緩慢滴加到l〇eq體積的冰無水乙醚中，滴加完畢后，自然沉降30min。然后再 高速離心機里離心10min(4000rpm)，棄去上清液，保留沉淀，將所得沉淀在干燥箱中干燥 8_10h，得到3. 4g干粉粗品。
[0031] 3)純化：
[0032] 取上述干粉粗品lg，用0. 1 %TFA/H20溶解。經(jīng)過濾后，上樣到C18制備柱，用HPLC 進行梯度洗脫，收集目標(biāo)肽的洗脫液體，檢測液體純度。把合格的樣品混合后旋蒸，最后凍 干機里凍干，得到200毫克的HS-1肽，純度大于98%。
[0033](二）細(xì)胞特異性攝取實驗：
[0034] 本發(fā)明應(yīng)用于體外細(xì)胞實驗的熒光染料為羅丹明B(RhodamineB)，與HS-1 肽通過酰胺鍵連接，簡稱RhB-HS-Ι，連接方法具體為取lmg羅丹明B(詳見參考文獻： JieCao，ShunanWan,JunmeiTian,SiwenLi,DaweiDeng.FastclearingRGD-based near-infraredfluorescentprobesforinvivotumordiagnosis，ContrastMedia Mol.Imaging2012,7390-402)溶于lmlPBS(pH為7. 4)中，加入 1-乙基-(3-二甲基氨基丙 基）碳酰二亞胺鹽酸鹽N-羥基琥珀酰亞胺（EDC/NHS)(摩爾比RhodamineB:EDC:NHS =1 : 1.5 : 1.5)，避光反應(yīng)4h，活化。稱取lmmolHS-1肽溶入含有熒光染料Rhodamine B的lmlPBS緩沖液（Ph7. 4)中，室溫避光攪拌過夜。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液濃縮后通過葡聚 糖凝膠G-25柱，PBS緩沖液（Ph7. 4)作洗脫液，得到純化的RhB-HS-1，-20°C儲存?zhèn)溆谩?br>[0035]