專利名稱：一種從he染色片提取殘微核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸的提取方法，具體涉及一種從HE染色片提取殘微核酸的方法。
背景技術(shù)：
HE染色是常用的病理制片方法，廣泛用于病理診斷和研究。HE染色片是采用兩種生物染料即堿性染料蘇木素和酸性染料伊紅分別于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)發(fā)生作用，使細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)通過顏色而改變它的折光率，從而在光鏡下能清晰地呈現(xiàn)出細(xì)胞圖像，組織細(xì)胞內(nèi)含有酸性物質(zhì)和堿性物質(zhì)，細(xì)胞的酸性物質(zhì)與堿性染料的陽離子結(jié)合，而細(xì)胞核的堿性物質(zhì)與酸性染料的陰離子結(jié)合，使其中酸性細(xì)胞核被堿性的蘇木素染成藍(lán)色，而堿性的胞漿被酸性染料伊紅染成紅色，其結(jié)果胞核呈藍(lán)色，胞漿呈紅色。一方面，經(jīng)過HE染色的穿刺組織、細(xì)胞涂片(包括痰和尿)、胃腸鏡等常規(guī)病理染色片的腫瘤細(xì)胞中含有堿性染料蘇木素和酸性染料伊紅，造成偏酸或偏堿的外界條件，從而對核酸鏈中的磷酸二酯鍵有破壞作 用，同時生物染料酸根基團與核酸分子結(jié)合，阻抑了磁珠和柱子吸附核酸分子的過程，此外HE染色前細(xì)胞經(jīng)過福爾馬林一段時間的固定，使細(xì)胞DNA/RNA鏈被破壞氧化損耗斷裂，這些因素直接影響從染色片提取的核酸的質(zhì)量。另一方面，染色片在制作過程由于堿性水漂洗和弱酸染料的中和，及時中斷了福爾馬林的氧化破壞后，又被優(yōu)質(zhì)的核酸固定劑乙醇固定保護，之后組織細(xì)胞中的核酸被生物染料弱酸堿根長期均質(zhì)化結(jié)合，在樹脂和封片密閉環(huán)境中保護了殘存的核酸物質(zhì)，所以HE染色片細(xì)胞中殘留尚未損耗斷裂的微量核酸，在核酸序列完整性上優(yōu)于保存在蠟塊內(nèi)的組織細(xì)胞。相反，蠟塊組織保存的細(xì)胞持續(xù)的在殘留的福爾馬林環(huán)境中氧化破壞，福爾馬林氣體很難在密封的石蠟固體環(huán)境逸出，數(shù)月后就產(chǎn)生大量的核酸碎片，很難得到正常長度的核酸片段，使PCR產(chǎn)物出現(xiàn)二聚體導(dǎo)致特異性擴增失敗。對后續(xù)滿足核酸檢測量的需要和檢測準(zhǔn)確性造成的重大不利影響；不能保證穩(wěn)定性要求極高的臨床檢測順利成功進(jìn)行下去。目前，常用的核酸提取方法包括磁珠法、溶胞法、自動提取法、硅藻玻璃粉吸附法和低溫酶解法等。在中國專利申請97125650. 0中，公開了一種從石蠟包埋組織中提取核酸進(jìn)行基因擴增的方法，采用二甲苯脫蠟法或水浴脫蠟法，再提取核酸DNA進(jìn)行基因PCR擴增。在中國專利申請03113637. 0中，公開了一種核酸自動提取機，可以完成血液、精液和其它體液樣品定量吸取、轉(zhuǎn)移，試劑自動定量添加、振蕩，一次性吸液器的裝卸，樣品控溫加熱，離心試管合蓋，按需自動分離等一系列提取核酸工序的自動化操作。在中國專利申請89104591. 0中，公開了一種核酸提取新工藝，是用低溫酶解法的高效率提取核酸的新方法。在中國專利申請94110993. 3中，公開了一種脫氧核糖核酸(DNA)提取工藝，提出了一種從魚的性腺體如魚的精巢中提取DNA的生產(chǎn)工藝。在中國專利申請94106094. 2中，公開了一種核糖核酸(RNA)的提取方法，從新鮮海產(chǎn)品中摘取內(nèi)臟，低溫保存后置入堿性緩沖液中，再向上清中加入聚乙二醇沉淀、溶解后加入有機酸，析出變性蛋白，上清再沉淀、洗滌、干燥，即可得到RNA。在中國專利申請98110654. 4中，公開了一種核酸快速抽提方法，采用乙醇、焦碳酸二乙酯混合溶液，與一定比例的待測標(biāo)本混合，經(jīng)反應(yīng)、濃縮、離心后，即可得到用于PCR或RT — PCR的核酸溶液。在中國專利申請200810200588. X中，公開了一種應(yīng)用納米磁珠純化核酸的試劑盒，可以從人血漿或血清或尿液中純化出病毒及革蘭氏陰性菌的核酸，可以快速、靈敏的大規(guī)模純化核酸。上述這些技術(shù)和工藝均是針對新鮮組織細(xì)胞，血液或石蠟組織等檢材，沒有涉及這些檢材后續(xù)的HE染色片上的靶細(xì)胞殘微核酸提取和純化，因此針對以HE染色片為原材料進(jìn)行殘微核酸的提取還處于空白階段。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種從HE染色片提取殘微核酸的方法，通過利用化學(xué)上同離子競爭效應(yīng)解除核酸分子的弱酸根染料基團的結(jié)合，可以針對HE切片中殘存的長片段核酸進(jìn)行有效提取和純化，獲得高質(zhì)量的核酸。技術(shù)方案為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
一種染色細(xì)胞核酸提純技術(shù)，簡稱染色核酸提純(tained nucleus-TN),是從HE染色片提取殘微核酸的方法先用低濃度鹽酸乙醇作脫色劑對染色片進(jìn)行脫色，然后用草酸 水溶液漂白，再富集靶細(xì)胞，最后對富集的靶細(xì)胞進(jìn)行核酸提取即可。具體步驟包括
(1)將HE染色片浸入二甲苯30min及以上，輕滑掉蓋玻片并取出，繼續(xù)浸泡HE染色片8 12h，更換入新二甲苯，充分祛除中性樹膠，得細(xì)胞片；更換入新二甲苯，浸泡15 20min ；
(2)取出細(xì)胞片用無水乙醇浸泡l(T20min，充分祛除二甲苯；更換入新無水乙醇，浸泡15min,然后依次進(jìn)行95%乙醇浸泡IOmin ；80%乙醇浸泡5min ；70%乙醇浸泡2min ；自來水洗 2min ；
(3)用1%鹽酸酒精蘇木素脫色細(xì)胞片30min以上；
(4)2%草酸水溶液浸泡細(xì)胞片3 IOmin；自來水稍洗，蒸餾水洗30min，富集細(xì)胞片上的靶細(xì)胞，并立即轉(zhuǎn)到離心管內(nèi)；
(5)提取靶細(xì)胞核酸即可。操作全過程中，禁止細(xì)胞片裸露在空氣中。所述的HE染色片為從手術(shù)病理石蠟包埋組織、穿刺組織、胃腸鏡活檢以及細(xì)胞涂片中通過正常病理步驟切片、染色得到的HE染色片。所述的核酸包括DNA、RNA和miRNA。步驟(5)中，采用常規(guī)方法或采用常規(guī)試劑盒進(jìn)行核酸提取。近年來，隨著核酸提取技術(shù)方法及試劑盒質(zhì)量的進(jìn)步，對殘微核酸的提取純化有了極大地進(jìn)步，但還不能滿足HE染色片提取核酸的需求。本發(fā)明通過創(chuàng)造，僅以微量的I張HE染色片上的靶細(xì)胞為材料，先從HE染色片上祛除堿性染料蘇木素和酸性染料伊紅染料，富集靶細(xì)胞，然后再從富集的靶細(xì)胞中提取核酸，能夠獲得臨床迫切需要的，難于在病人身上再次撿取的核酸等，成為解決提取病人腫瘤細(xì)胞中的DNA/RNA這一困難的新途徑。有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明染色核酸提純技術(shù)的從HE染色片提取殘微核酸的方法，先對穿刺組織、細(xì)胞涂片(包括痰和尿)、胃腸鏡的常規(guī)HE染色片進(jìn)行脫色，然后再進(jìn)行核酸的提取，能夠有效祛除堿性染料蘇木素和酸性染料伊紅，有效的減少了核酸在提取和保存過程中的降解，從而可以利用各種病理切片穿刺組織、細(xì)胞涂片(包括痰和尿)、胃腸鏡等常規(guī)染色片進(jìn)行殘微的核酸的提取及其后續(xù)的分子病理檢測，為保存優(yōu)質(zhì)核酸，利用核酸找到經(jīng)濟環(huán)保的新材料和新資源，具有很好的實用性，能夠產(chǎn)生很好的經(jīng)濟效益和社會效應(yīng)。


圖I是胃鏡HE標(biāo)本提取的DNA電泳 圖2是PCR擴增產(chǎn)物電泳 圖3是RNA的Q-PCR的擴增曲線 圖4是miRNA的Q-PCR的擴增曲線圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。以下實施例所使用的材料為從各種手術(shù)病理石蠟包埋組織(FFPE)、穿刺組織、胃腸鏡活檢以及各種細(xì)胞涂片(包括宮頸，胸腹水，痰和尿等各種手工或儀器離心制片或印片后獲取的細(xì)胞涂片)中通過正常病理步驟切片、染色得到的HE染色片。實施例I HE染色片的脫色方法
將染色片浸入二甲苯30min，輕滑掉蓋玻片，如蓋玻片不能自動滑落可適當(dāng)延長時間；取出蓋玻片，繼續(xù)浸泡染色片8 12h，充分祛除中性樹膠；更換入新二甲苯，浸泡15min ;取出細(xì)胞片用無水乙醇浸泡l(T20min,充分祛除二甲苯；更換入新無水乙醇,浸泡15min,然后依次進(jìn)行95%乙醇浸泡10 min ；80%乙醇浸泡5 min ；70%乙醇浸泡2 min ；自來水稍洗2min ;1%鹽酸酒精蘇木素脫色，鏡下控制至細(xì)胞片幾近無色，約需lOmin，如仍有顏色或原片染色較深可適當(dāng)延長脫色時間；2%草酸水溶液浸泡細(xì)胞片3min 5min，如仍有顏色或原片染色較深可適當(dāng)延長時間；自來水稍洗，蒸餾水洗30min，將靶細(xì)胞(含有腫瘤組織的細(xì)胞)刮下立即轉(zhuǎn)到離心管內(nèi)，全過程組織細(xì)胞禁止裸露在空氣中。HE染色片的脫色方法有很多種試劑可供選擇，酸性高錳酸鉀氧化加草酸漂白是一種被廣泛采用較優(yōu)良的脫色方法。但因為高錳酸鉀的強氧化作用，與細(xì)胞之間的作用比較劇烈，在其作用下，非常容易導(dǎo)致細(xì)胞的部分或完全脫落，從而使載玻片上的腫瘤細(xì)胞的數(shù)量減少，影響后續(xù)DNA/RNA的提取的得率。選用低濃度鹽酸乙醇作脫色劑，作用比較溫和，涂片可以褪色干凈并保持細(xì)胞完整，從而保證了核酸提取的量。采用1%鹽酸酒精作為脫色齊U，其原理類似于常規(guī)染色中的分化作用。鹽酸可使留在細(xì)胞上的金屬根(即蘇木精染液中的媒染劑通常是鉀明礬)與細(xì)胞分離，并阻止蘇木精染料色素根與媒染劑中的鋁化合形成藍(lán)紫色沉淀色素。草酸具有漂白作用，而且酸能破壞蘇木精的醌型結(jié)構(gòu)，使色素與組織解離。從而達(dá)到脫色漂白作用。實施例2
選擇2008 2011年20例HE染色片(胃鏡標(biāo)本，江蘇省中醫(yī)院病理科提供)，每例一張，20片試驗樣用實施例I的脫色工藝進(jìn)行脫色，富集獲得靶細(xì)胞，然后利用OMEGA bio-tek公司的E. Z. N. A. Tissue DNA Kit試劑盒從富集的靶細(xì)胞中提取DNA，利用QIAGEN RNeasy FFPE Kit試劑盒從富集的腫瘤組織中提取RNA，另20片對照樣為未經(jīng)實施例I的脫色步驟而直接用對應(yīng)的提取試劑盒進(jìn)行DNA/RNA提取，結(jié)果如圖I和表I所示，經(jīng)脫色后提取的DNA電泳條帶比未經(jīng)脫色的組織提取的DNA電泳條帶的完整程度較好，圖中，上排為對照樣(未經(jīng)過脫色步驟)的DNA，下排為試驗樣(經(jīng)過脫色步驟)的DNA，從左到右各泳道分別為DNA、Ladder、空白對照、DNA。具體數(shù)值如表I所示，對試驗樣和對照樣提出的DNA濃度進(jìn)行T值檢驗，t=4. 900，t>t0. 05(39)，P < 0. 05，說明兩組濃度存在統(tǒng)計學(xué)差異，試驗樣提出的DNA的質(zhì)量好于對照樣。表I核酸質(zhì)量測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種從HE染色片提取殘微核酸的方法，其特征在于先用低濃度鹽酸乙醇作脫色劑對染色片進(jìn)行脫色，然后用草酸水溶液漂白，再富集靶細(xì)胞，最后對富集的靶細(xì)胞進(jìn)行核酸提取即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從HE染色片提取殘微核酸的方法，其特征在于，具體步驟包括 (1)將HE染色片浸入二甲苯30min及以上，輕滑掉蓋玻片并取出，繼續(xù)浸泡HE染色片8 12h，更換入新二甲苯，充分祛除中性樹膠，得細(xì)胞片；更換入新二甲苯，浸泡15 20min ； (2)取出細(xì)胞片用無水乙醇浸泡l(T20min，充分祛除二甲苯；更換入新無水乙醇，浸泡15min,然后依次進(jìn)行95%乙醇浸泡IOmin ；80%乙醇浸泡5min ；70%乙醇浸泡2min ；自來水洗 2min ； (3)用1%鹽酸酒精蘇木素脫色細(xì)胞片30min以上； (4)2%草酸水溶液浸泡細(xì)胞片3 IOmin；自來水稍洗，蒸餾水洗30min，富集細(xì)胞片上的靶細(xì)胞，并立即轉(zhuǎn)到離心管內(nèi)； (5)提取靶細(xì)胞核酸即可。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的從HE染色片提取殘微核酸的方法，其特征在于操作全過程中，禁止細(xì)胞片裸露在空氣中。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從HE染色片提取殘微核酸的方法，其特征在于所述的HE染色片為從手術(shù)病理石蠟包埋組織、穿刺組織、胃腸鏡活檢以及細(xì)胞涂片中通過正常病理步驟切片、染色得到的染色片。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從HE染色片提取殘微核酸的方法，其特征在于所述的核酸包括 DNA、RNA 和 miRNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從HE染色片提取殘微核酸的方法，其特征在于步驟(5)中，采用常規(guī)方法或采用常規(guī)試劑盒進(jìn)行核酸提取。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從HE染色片提取殘微核酸的方法，先用低濃度鹽酸乙醇作脫色劑對HE染色片進(jìn)行脫色，再用草酸溶液進(jìn)行漂白，然后再富集靶細(xì)胞進(jìn)行核酸提取。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法，能夠有效祛除堿性染料蘇木素和酸性染料伊紅，有效的減少了核酸在提取和保存過程中的降解，并富集檢測所需的靶細(xì)胞，從而可以利用穿刺組織、細(xì)胞涂片(包括痰和尿)、胃腸鏡等全部常規(guī)HE染色片進(jìn)行殘微的核酸提取及其后續(xù)的分子病理檢測，具有很好的實用性，能夠產(chǎn)生很好的經(jīng)濟效益和社會效應(yīng)。
文檔編號G01N1/28GK102680295SQ20121015796
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月21日
發(fā)明者吳曉斌, 孫怡, 徐慧, 李惠, 謝玲, 賴仁勝, 趙明, 趙蘇蘇, 鄭燕影, 陳劼 申請人:南京紫霄科技有限公司, 江蘇省中醫(yī)院, 賴仁勝