專利名稱：一種檢測禽流感病毒的試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測禽流感病毒的試紙條以及該試紙條的制備方法、本發(fā)明還涉
及一種感染禽流感病毒動物的排泄物和分泌物的樣品處理溶液，屬于免疫診斷領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
禽流感是一種家禽和鳥類的烈性傳染病，在偶然的情況下也可感染人而致病，甚 至死亡。2004年禽流感席巻亞洲以來，波及歐美各國，引起家禽大批死亡，并感染人類，造成 近200多人死亡，流行的余波至今未平息。此次流行波及范圍之廣，感染人數(shù)之多為歷史之 最。不僅如此，其病毒的變異可能引起人類流感的大流行。禽流感對人類的威脅已經(jīng)引起 世界關(guān)注。如何有效預(yù)防和控制該病的流行，已經(jīng)成為各國科學(xué)家的重要研究課題。很多 國家都開始進行這方面的研究，包括在疫苗、診斷技術(shù)和藥物等方面。 免疫層析膠體金技術(shù)是近些年發(fā)展起來的一項新的診斷技術(shù)，它結(jié)合了免疫反應(yīng) 和色譜層析的原理，是一種獨特的免疫層析方法。該技術(shù)以條狀纖維層析材料為固相，通過 毛細作用使樣品溶液在層析條上運動，樣品中的抗原與纖維材料上相應(yīng)的抗體相結(jié)合發(fā)生 高特異和高親和的免疫反應(yīng)，并滯留或富集在檢測區(qū)域，通過反應(yīng)底物而出現(xiàn)呈色現(xiàn)象。這 是一種目前發(fā)展最快的復(fù)合型免疫層析技術(shù)?，F(xiàn)在臨床廣泛使用的人絨毛膜促性腺(HCG)、 乙型肝炎表面抗原(HbsAg)、可卡因等檢測均是基于這種方法，其優(yōu)點是快捷、簡便、準(zhǔn)確， 具有高度特異性及高敏感性，問世以來便成為檢驗學(xué)和診斷學(xué)的研究熱點。免疫金銀染色 (IGSS)的原理是金免疫技術(shù)測定的產(chǎn)物上的金顆?？蓪y離子還原成銀顆粒，在金顆粒的 表面形成色澤更深的黑色層，因而增強了金免疫技術(shù)的敏感性。具體方法是在免疫金染色 的基礎(chǔ)上，在對苯二酚存在的情況下，通過含銀離子的顯影液中的還原反應(yīng)，使在抗原抗體 反應(yīng)部位的金粒子周圍形成很多沉淀層，光鏡下就可看到陽性反應(yīng)部位呈清晰的藍黑色， 從而顯示不易被光鏡定位的金粒，顯示出組織中抗原的部位。這種方法不僅提高靈敏度，
同時金標(biāo)記抗體可以稀釋io倍以上后應(yīng)用，此外還可避免使用具有致癌危險的有機色素。
IGSS法的主要優(yōu)點是(l)敏感性高。與其他的免疫膠體金技術(shù)相比，IGSS法被認(rèn)為是最 敏感的方法，尤其適合于只含微量抗原的標(biāo)本檢測。(2)定位準(zhǔn)確。IGSS法的銀顆粒沉積 在抗原抗體反應(yīng)部位，一般無擴散，定位較為準(zhǔn)確。(3)方法簡便、安全、成本低、經(jīng)濟、同時 也可以長期保存。(4)用醋酸銀代替硝酸銀和乳酸銀，不僅保持了原有方法的敏感性、特異 性、低背景、對比度好的特點，而且整個顯影過程可以在常光下進行。 目前，在人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用該技術(shù)進行診斷，但在動物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究還 處于初級階段。禽流感是一種嚴(yán)重的人與動物共患的傳染病，2004年禽流感在亞洲的流行， 造成養(yǎng)殖業(yè)嚴(yán)重的經(jīng)濟損失和人的死亡。世界衛(wèi)生組織(WHO)的專家預(yù)測這種威脅還將 持續(xù)、快速診斷是預(yù)防和控制本病的有效方法。目前所采用的方法主要還是瓊脂擴散試驗、 HA/HI試驗ELISA和RT-PCR試驗。這些方法要么敏感性差，要么操作繁瑣，檢測成本高。目 前研究的最新方法是熒光RT-PCR技術(shù)，雖然準(zhǔn)確特異，但需要昂貴的設(shè)備和檢測費用，需 要專門的實驗室，很難普及。
本發(fā)明之前申請?zhí)枮?00410088716. 8專利申請公開了一種檢測H5N1亞型禽 流感病毒的方法及其專用試劑盒；申請?zhí)枮?00510042631.0的專利申請公開了禽流 感病毒抗原檢測方法及其金標(biāo)快速診斷試劑盒和制備方法；申請?zhí)枮?00510042527. 1 的專利申請公開了復(fù)合定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測禽流感和新城疫病毒的方法；申請?zhí)枮?200510057023.7的專利申請公開了禽流感免疫膠體金診斷試紙條和測試卡；申請?zhí)枮?br> 03126894. 3的專利申請公開了膠體金層析法檢測SARS冠狀病毒抗原的試劑；申請?zhí)枮?br> 03126895. 1的專利申請公開了膠體金層析法檢測SARS冠狀病毒抗體的試劑；申請?zhí)枮?03142652. 2的專利申請公開了免疫紙層析條及用其快速檢測食品中致病菌和毒素的方法； 申請?zhí)枮?2131321. 0的專利申請公開了一種免疫層析一步法檢測13 -腎上腺素激動劑類 藥物的方法及試紙的制備；申請?zhí)枮?2139704.X的專利申請公開了半定量快速檢測鹽酸 克倫特羅的膠體金試紙條及生產(chǎn)和使用方法。 本發(fā)明旨在提供一種簡單、快速、敏感、特異的診斷糞便中禽流感病毒的方法，目 前雖有應(yīng)用于禽流感研究方面的報道和相關(guān)專利，但多在檢測動物血清、組織、分泌物等， 未見到能夠同時檢測糞便中禽流感病毒的報道。本發(fā)明建立一種免疫膠體金層析法快速診 斷糞便中禽流感病毒的方法，能夠在野生動物禽流感野外快速診斷和檢測中應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一 目的提供了一種檢測禽流感病毒的試紙條。 本發(fā)明的另一 目的提供了一種處理禽流感病毒感染動物的糞便和分泌物的溶液。
本發(fā)明的再一 目的提供了一種制備檢測禽流感病毒試紙條的方法。
本發(fā)明一方面提供了一種檢測禽流感病毒的試紙條，該試紙條包括以下部分
墊板l，所述的墊板為塑料墊板； 位于墊板1上的硝酸纖維素膜3，其小于墊板(1)并與墊板l的長度差為墊板長度 的13/30-1/2，并與墊板1部分重疊，所述的硝酸纖維素膜與墊板在長度方向上一致，所述 的硝酸纖維素膜含有金標(biāo)記的AIV單克隆抗體、AIV血清和羊抗鼠IgG ;
緊貼在墊板1和硝酸纖維素膜3之間的結(jié)合墊2，結(jié)合墊2貼在硝酸纖維素膜3和 墊板1之間部分的長度為墊板長度的1/5-1/4，并且所述的結(jié)合墊2為含有脫脂酪蛋白、金 標(biāo)記的AIV單克隆抗體、AIV血清和羊抗鼠IgG的玻璃纖維膜，優(yōu)選地，所述的結(jié)合墊2為 一個結(jié)合墊； 緊貼在硝酸纖維素膜3上表面的結(jié)合墊2"，結(jié)合墊2"與硝酸纖維素膜3部分重 疊，該重疊部分的正投影與上述結(jié)合墊2貼在硝酸纖維素膜3和墊板1之間的部分至少部 分重疊，所述的結(jié)合墊2"與硝酸纖維素膜重疊部分的長度為墊板長度的1/30-1/20，所述 的結(jié)合墊2"為含有脫脂酪蛋白、金標(biāo)記的AIV單克隆抗體、AIV血清和羊抗鼠IgG的玻璃 纖維膜； 兩片吸水濾紙4， 一片緊貼在結(jié)合墊2"的上表面，并且該吸水濾紙、結(jié)合墊2"、硝 酸纖維素膜3、結(jié)合墊2和墊板1的正投影有共同的重疊部分，另一片緊貼在硝酸纖維素膜 上表面與結(jié)合墊2"相距最遠的位置，該吸水濾紙與另一吸水濾紙、結(jié)合墊2"或結(jié)合墊2之 間最近的距離為墊板長度9/20-7/15，并且該最近的距離內(nèi)是相互重疊的墊板和硝酸纖維 素膜。
發(fā)明制備的檢測禽流感病毒的試紙條不同于現(xiàn)有的試紙條，這是因為在本發(fā)明試 紙條的結(jié)合墊上含有脫脂酪蛋白，所以相對于不含有脫脂酪蛋白的試紙條來說，本發(fā)明的 試紙條具有檢測靈敏度高的優(yōu)點。此外，結(jié)合墊2貼在硝酸纖維素膜3和墊板1之間部分 的長度為墊板長度1/5-1/4，這是為了滿足待測樣品在試紙條上走樣所必需的；并且結(jié)合 墊2"與硝酸纖維素膜重疊部分的長度為墊板1長度的1/30-1/20，該吸水濾紙與另一吸水 濾紙、結(jié)合墊2"或結(jié)合墊2之間最近的距離為墊板長度9/20-7/15，并且該最近的距離內(nèi)是 相互重疊的墊板和硝酸纖維素膜，這都是為了滿足待測樣品在試紙條上走樣所必需的，本 試紙條的結(jié)構(gòu)見圖1。在結(jié)合墊2，結(jié)合墊2"上脫脂酪蛋白是通過結(jié)合墊在處理液中浸泡， 之后再干燥結(jié)合墊得到的，所述的處理液含有脫脂酪蛋白和磷酸鹽緩沖液。并且結(jié)合墊2、 結(jié)合墊2"和硝酸纖維素膜上的金標(biāo)記的AIV單克隆抗體、AIV血清和羊抗鼠IgG是通過在 這兩個結(jié)合墊和硝酸纖維素膜上噴涂金標(biāo)記的AIV單克隆抗體、AIV血清和羊抗鼠IgG，之 后干燥結(jié)合墊和硝酸纖維素膜得到的。 優(yōu)選地，其中緊貼在墊板1和硝酸纖維素膜3之間的結(jié)合墊2是兩個結(jié)合墊，這兩 個結(jié)合墊之間長度方向上的空隙為墊板長度的9/20-7/15，結(jié)合墊2"與硝酸纖維素膜部分 重疊，該重疊部分的正投影與一個所述的結(jié)合墊2貼在硝酸纖維素膜3和墊板1之間的部 分至少部分重疊，另一個結(jié)合墊2的正投影至少部分重疊于距離結(jié)合墊2"最遠位置的吸水 濾紙4。該結(jié)構(gòu)的試紙條相對于前述試紙條的結(jié)構(gòu)在墊板1和硝酸纖維素膜3之間多了結(jié) 合墊2，因此更有利于兩邊平衡。 優(yōu)選地，所述試紙條的結(jié)合墊2和結(jié)合墊2"還含有1)阿拉伯膠、2)對苯二酚和 3)醋酸銀或硝酸銀。 優(yōu)選地，所述的硝酸纖維素膜還含有l(wèi))阿拉伯膠、2)對苯二酚和3)醋酸銀或硝酸 銀。 本發(fā)明試紙條的結(jié)合墊和硝酸纖維素膜含有阿拉伯膠、檸檬酸鹽、對苯二酚和醋
酸銀或硝酸銀。這些成分不存在于現(xiàn)有的試紙條，并且含有這些成分的試紙條的顯色好于
現(xiàn)有的試紙條。當(dāng)待測物中含有禽流感病毒時，在本發(fā)明的試紙條上呈藍黑色，而在現(xiàn)有的
試紙條上呈紅色，同時現(xiàn)有試紙條顯色的清晰度也不如本發(fā)明的試紙條。 本發(fā)明的另一方面提供了處理感染禽流感病毒動物的糞便和分泌物的溶液，該溶
液包含pH值為7. 0-7. 4的磷酸鹽緩沖液、聚乙二醇和正丁醇。本發(fā)明中的感染禽流感病毒
的動物不僅是禽類動物，也可以是感染該病毒的家畜或者人。 現(xiàn)有技術(shù)中，沒有專門用于處理感染禽流感病毒動物的糞便和分泌物的溶液，本 發(fā)明則提供了這種樣品處理液，使用該處理液的目的是為了將感染禽流感動物的糞便和分 泌物中的病毒釋放于所提供的處理液中。此外，釋放的病毒更容易與試紙條上的抗病毒抗 體相結(jié)合，使得試紙條的顯色更為靈敏。 優(yōu)選地，所述溶液包含O. 5% -1. 5%質(zhì)量濃度的聚乙二醇20000、8% _12%質(zhì)量濃 度的正丁醇、pH值為7. 2的磷酸緩沖液。 更優(yōu)選地，所述溶液包含1%質(zhì)量濃度的聚乙二醇20000、 10%質(zhì)量濃度的正丁醇 和0. 05mol/L pH值為7. 2的磷酸鹽緩沖液。 本發(fā)明的另一方面還提供了一種制備所述試紙條的方法，該方法包括以下步驟
a.將玻璃纖維膜充分浸泡于處理液中，再將處理后的玻璃纖維膜干燥，得到所述的結(jié)合墊，所述的處理液含有脫脂酪蛋白和磷酸鹽緩沖液； b.將金標(biāo)記的AIV單克隆抗體、AIV血清和羊抗鼠IgG噴涂于所述的步驟a得到 的結(jié)合墊和空白的硝酸纖維素膜并進行干燥； c.將吸水濾紙、步驟b得到的硝酸纖維素膜和結(jié)合墊按照前述的位置關(guān)系固定于 所述的墊板上，得到所述的試紙條。 優(yōu)選地，在所述的步驟b和步驟c之間，還將干燥后的涂覆有金標(biāo)記的AIV單克隆 抗體、AIV血清和羊抗鼠IgG的結(jié)合墊和硝酸纖維素膜用EDC(購自上海延長生化科技發(fā)展 有限公司，商品號4108，商品名稱1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)溶液浸 泡、干燥之后再置于銀離子處理液浸泡并干燥。 優(yōu)選地，所述的金標(biāo)記的AIV單克隆抗體的濃度為3. 75-4. 25mg/ml，AIV血清的濃 度為4. 75-5. 25mg/ml，羊抗鼠IgG的濃度為4. 75-5. 25mg/ml。 優(yōu)選地，所述銀離子處理液含有阿拉伯膠、pH值為3. 5的檸檬酸鹽緩沖液、對苯二 酚和醋酸銀溶液，并且阿拉伯膠的體積PH值為3.5的檸檬酸鹽緩沖液的體積對苯二酚
的體積醋酸銀溶液的體積為6 :i:2:i。 優(yōu)選地，其中所述的阿拉伯膠的質(zhì)量濃度為14-16 %、對苯二酚的質(zhì)量濃度為 80% _90%、醋酸銀的濃度為9. 5-10. 5%。 更優(yōu)選地，所述的阿拉伯膠的質(zhì)量濃度為15%、對苯二酚的質(zhì)量濃度為85%、醋 酸銀溶液的濃度為10%。 優(yōu)選地，所述的步驟a中處理液中含有0.75_1.25%質(zhì)量濃度的脫脂酪蛋白和 0. 025-0. 075mol/L磷酸鹽緩沖液。 更優(yōu)選地，所述步驟a中處理液中含有1.0X質(zhì)量濃度的脫脂酪蛋白和pH值為 7. 2的0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液。 優(yōu)選地，本發(fā)明中的AIV血清為羊抗AIV血清或鼠抗AIV血清。 本發(fā)明的試紙條用于檢測禽類動物糞便中的禽流感病毒，當(dāng)AIV抗原與結(jié)合墊中
金標(biāo)抗體結(jié)合后，通過層析運動到硝酸纖維素膜再與羊抗AIV抗體結(jié)合，出現(xiàn)沉淀線，該線
簡稱檢測線或T線，未結(jié)合完的抗原與金標(biāo)抗體結(jié)合物繼續(xù)運動與NC膜上的羊抗鼠抗體結(jié)
合，形成第2條沉淀線，該線簡稱質(zhì)控線或C線。若在測試條上方僅出現(xiàn)一條帶，則表示為
陰性；若在測試條上方出現(xiàn)2條藍黑色帶，則表示為陽性；若在測試條上方不出現(xiàn)色帶，則
表示測試條失效。 本發(fā)明的試紙條具有以下的有益效果①靈敏度好在進行靈敏度檢驗的時候， 將AIV抗原按0、0. 25、0. 5、1. 0、5. 0、7. 5、 10、20、40、80ng/ml稀釋濃度進行檢測，檢測線出 現(xiàn)藍黑色的最低可測定量，即為此試劑條的靈敏度。結(jié)果表明，當(dāng)AIV抗原的濃度為7. 5ng/ ml時，檢驗線為藍黑色。②特異性試驗用本試紙條檢測帶有相同濃度的雞新城疫病毒(英 文簡稱NDV)、雞傳染性支氣管炎病毒(英文簡稱IBV)、傳染性法氏囊病病毒(英文簡稱 IBDV)的禽類動物的糞便和正常的尿囊液，觀察測試結(jié)果，看有無假陽性反應(yīng)、交叉反應(yīng)。結(jié) 果表明，本發(fā)明研制的試紙條對AIV反應(yīng)為陽性，對含有NDV、 IBV、 IBDV的禽類動物糞便及 正常尿囊液的檢測為陰性。這說明本試紙條無交叉反應(yīng)和假陽性反應(yīng)。


圖1為本發(fā)明試紙條的結(jié)構(gòu)的示意圖，圖中1-墊板，2-結(jié)合墊(玻璃纖維素膜)， 3_硝酸纖維素膜，2"-結(jié)合墊，4-吸水濾紙。 圖2為本發(fā)明試紙條的另一種結(jié)構(gòu)的示意圖，圖中1-墊板，2_結(jié)合墊(玻璃纖維 素膜)，3-硝酸纖維素膜，2"-結(jié)合墊，4-吸水濾紙。 圖3為本發(fā)明試紙條的外觀示意圖，圖中1' _裝試紙條外殼，2'-加樣孔， 3'-觀察孔。
具體實施例方式
實施例1 膠體金溶液的制備 向4ml質(zhì)量濃度為1 %的檸檬酸三鈉(Na3C6H507 2H20)中加入0. 5ml質(zhì)量濃度為 1 %的鞣酸和0. 5ml 25mmo/L的K2C03溶液(K2C03溶液與鞣酸加入的體積量相等)，用雙蒸 餾水補至檸檬酸三鈉_鞣酸_K2C03的混合溶液最終體積為20ml，加熱至60°C 。取1ml濃度 為1X的HAuCl4加入79ml的雙蒸餾水中，水浴加熱至60°C，然后迅速加入檸檬酸三鈉-鞣 酸_K2C03的混合溶液，于6(TC溫度下保持一定時間，待溶液顏色變成深紅色，大約30-60min 后，再將含有HAuCh的混合溶液加熱至沸騰，保持沸騰5min即可。冷卻至室溫，得到膠體 金溶液，經(jīng)過濾除菌，裝入潔凈的玻璃瓶中，在fC下保存?zhèn)溆?。本實施例中的溶液均用超?水或雙蒸水配置，并用微孔濾膜過濾，去掉水中的雜質(zhì)。
實施例2
AIV單克隆抗體的制備 用H9N2亞型AIV作為抗原免疫接種SPF雞制備高血清。用飽和硫酸銨法從該血 清中提取免疫球蛋白G(IgG)，以該IgG制備弗氏佐劑疫苗免疫SPF BALB/c小鼠，取其脾細 胞和小鼠骨髓瘤細胞SP2/0在聚乙二醇作用下融合，采用間接ELISA檢測法篩選獲得3株 (2H1D1、2H1G4、3H2D7)分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞，這三株雜交瘤細胞分泌AIV 單克隆抗體。 AIV高免疫血清的制備 將禽流感病毒抗原純化后制成弗氏佐劑抗原免疫山羊和小鼠，制備羊抗AIV高免 血清和鼠抗AIV高免血清。 羊抗鼠IgG購自于北京博邁世紀(jì)生物技術(shù)有限公司，抗體貨號A8129，商品名稱 羊抗鼠IgG。
實施例3 膠體金標(biāo)記的AIV單克隆抗體的制備 取18nm的膠體金20mL，用K2C03溶液(pHll， 0. 05mol/L)調(diào)其pH為7. 5-8. 5 ;分別 加入200ml濃度為3. 75mg/mL和4. 25mg/mL實施例2獲得的AIV單克隆抗體溶液，室溫反 應(yīng)4-5min ;加入含10% BSA、 10%蔗糖的PBS 200 y L， 4°C 30000g離心力下離心30min，棄上 清液；用O. 05mol/L pH 7. 2PBS 20mL溶解沉淀，4°C 30000g離心力下離心30min，棄上清液； 用含3%甘油、5% PEG、0. 05mol/L pH7. 2的PBS 20mL溶解沉淀，分別制的濃度為3. 75mg/ mL和4. 25mg/mL金標(biāo)記的AIV單克隆抗體，4t:貯存?zhèn)溆?br> 實施例4 結(jié)合墊和硝酸纖維素膜的制備 首先將玻璃纖維膜置于0. 75%脫脂酪蛋白和0. 05mol/L pH值為7. 2的磷酸緩沖 液組成的混合溶液中進行浸泡處理，1小時后取出并干燥15分鐘，得到結(jié)合墊，該結(jié)合墊可 以作為附圖中的結(jié)合墊2，也可以作為結(jié)合墊2"。 將實施例3得到的3. 75mg/mL的金標(biāo)記的AIV單克隆抗體和實施例2制備得到AIV 血清的工作濃度調(diào)整到4. 75mg/ml和4. 75mg/ml的羊抗鼠IgG噴涂于所述的結(jié)合墊和空白 的硝酸纖維素膜，并在35-4(TC的烘箱內(nèi)烘干20-30min。再將處理后的結(jié)合墊和硝酸纖維 素膜置于EDC溶液中浸泡15min，風(fēng)干5min后，再將結(jié)合墊置于銀離子處理液浸泡2小時， 風(fēng)干15min。所述的銀離子處理液的配方為體積比為6 :1:2: 1的質(zhì)量濃度為15% 的阿拉伯膠、pH值為3. 5的檸檬酸緩沖液、質(zhì)量濃度為85%的對苯二酚和質(zhì)量濃度為10% 的醋酸銀溶液混合后得到銀離子處理液。本實施例的結(jié)合墊含有脫脂酪蛋白、金標(biāo)記的AIV 單克隆抗體、AIV血清和羊抗鼠IgG的玻璃纖維；本實施例的硝酸纖維素膜上含有金標(biāo)記的 AIV單克隆抗體、AIV血清和羊抗鼠IgG。
實施例5 結(jié)合墊和硝酸纖維素膜的制備 首先將玻璃纖維膜置于1. 25%脫脂酪蛋白和0. 075mol/L pH值為7. 2的磷酸緩沖 液組成的混合溶液中進行浸泡處理，1小時后取出并干燥15分鐘，得到結(jié)合墊，該結(jié)合墊可 以作為結(jié)合墊2，也可以作為結(jié)合墊2"。 將實施例3得到的4. 25mg/ml的金標(biāo)記的AIV單克隆抗體和實施例2制備得到的 AIV血清的工作濃度調(diào)整到5. 25mg/ml和5. 25mg/ml的羊抗鼠IgG噴涂于所述的結(jié)合墊和 空白的硝酸纖維素膜，并在35-4(TC的烘箱內(nèi)烘干20-30min。再將處理后的結(jié)合墊和硝酸 纖維素膜置于EDC溶液中浸泡15min，風(fēng)干5min后，再將結(jié)合墊置于銀離子處理液浸泡2 小時，風(fēng)干15min。所述的銀離子處理液的配方為體積比為6 :1:2: l的質(zhì)量濃度為 16%的阿拉伯膠、pH值為3. 5的檸檬酸緩沖液、質(zhì)量濃度為90%的對苯二酚和質(zhì)量濃度為 10. 5%的醋酸銀溶液混合后得到銀離子處理液。本實施例的結(jié)合墊含有脫脂酪蛋白、金標(biāo) 記的AIV單克隆抗體、AIV血清和羊抗鼠IgG的玻璃纖維；本實施例的硝酸纖維素膜上含有 金標(biāo)記的AIV單克隆抗體、AIV血清和羊抗鼠IgG。
實施例6
試紙條的制備 在墊板1上表面的一側(cè)上固定實施例4制備得到的結(jié)合墊，該結(jié)合墊作為結(jié)合墊 2，其長度為墊板長度的1/4，與墊板1的一端對齊，再將實施例4得到的硝酸纖維素膜固定 在結(jié)合墊2的上表面和墊板另一側(cè)的上表面，硝酸纖維素膜為墊板長度的1/2，再在與結(jié)合 墊2相同的一側(cè)的硝酸纖維素膜的上表面固定實施例4得到的結(jié)合墊，該結(jié)合墊作為結(jié)合 墊2"，結(jié)合墊2"與硝酸纖維素膜3重疊部分的正投影與結(jié)合墊2在硝酸纖維素膜3和墊板 1之間的部分部分重疊，結(jié)合墊2"與硝酸纖維素膜重疊部分的長度為墊板1長度的1/30， 最后在結(jié)合墊2"的上表面和與結(jié)合墊2"相對的硝酸纖維素膜另一側(cè)的上表面分別固定兩 片吸水濾紙，得到用于檢測禽流感病毒的試紙條。與結(jié)合墊2"相對一端的吸水濾紙、結(jié)合 墊2"或結(jié)合墊2之間最近的距離是墊板長度的7/15，制備好的試紙條見圖1。在本實施例中采用不干膠固定硝酸纖維素膜、結(jié)合墊和吸水濾紙。該墊板是白色的塑料墊板(購自上 海金標(biāo)生物科技有限公司，商品名稱塑料診斷膠板)。
實施例7
試紙條的制備 在墊板上表面的兩側(cè)分別固定實施例5制備得到的兩個結(jié)合墊，該結(jié)合墊作為結(jié) 合墊2，兩個結(jié)合墊的一樣長，均為墊板長度的1/4，所以在兩個結(jié)合墊之間存在空隙，再將 實施例5得到的硝酸纖維素膜固定在這兩個結(jié)合墊2的上表面，硝酸纖維素膜為墊板長度 的17/30，再將實施例5得到的一個硝酸纖維素膜固定在這兩個結(jié)合墊的上表面上，再在硝 酸纖維素膜上表面的一側(cè)固定結(jié)合墊2"，結(jié)合墊2"與硝酸纖維素膜3重疊部分的正投影 與結(jié)合墊2在硝酸纖維素膜3和墊板1之間的部分部分重疊，結(jié)合墊2"與硝酸纖維素膜重 疊部分的長度為墊板1長度的1/30，在結(jié)合墊2"上表面固定一片吸水濾紙，與結(jié)合墊2" 相對的硝酸纖維素膜上表面的另一側(cè)固定另一片吸水濾紙，與結(jié)合墊2"相對一端的吸水濾 紙、結(jié)合墊2"或結(jié)合墊2之間最近的距離是墊板長度的7/15，得到用于檢測禽流感病毒的試 紙條，制備好的試紙條見圖2。在本實施例中采用不干膠固定硝酸纖維素膜、結(jié)合墊和吸水濾 紙。該墊板是白色的塑料墊板(購自上海金標(biāo)生物科技有限公司，商品名稱塑料診斷膠板)。
實施例8
處理動物糞便溶液的制備 該溶液中含有1%質(zhì)量濃度的聚乙二醇20000、 10X的質(zhì)量濃度的正丁醇，pH值為 7. 2的磷酸緩沖液，該緩沖液中含有8. 5g/L的NaC1、2. 2g/L的Na2HPO^P 0. 3g/L的NaH2P04，
所述的其他成分的溶液均用磷酸緩沖液。 實施例9 處理動物糞便溶液的制備 該溶液中含有0. 5%質(zhì)量濃度的聚乙二醇20000、8%的質(zhì)量濃度的正丁醇和其余
量的PH值為7. 2的磷酸緩沖液。 實施例10 處理動物糞便溶液的制備 該溶液中含有1. 5%質(zhì)量濃度的聚乙二醇20000、12%的質(zhì)量濃度的正丁醇和其 余量的PH值為7. 2的磷酸緩沖液。
實施例11 本發(fā)明的試紙條檢測動物糞便中是否含有禽流感病毒的方法 將野外采集的動物糞便首先用以下溶液進行處理，該溶液含有1%質(zhì)量濃度的聚 乙二醇20000、 10%質(zhì)量濃度的正丁醇和pH值為7. 2、的磷酸鹽緩沖液。以12ml溶液溶解 lg動物糞便的比例溶解采集的動物糞便，充分?jǐn)嚢柚钡絼游锛S便充分溶解分散于溶液中， 取05-lml的上清液滴加到試紙條上的加樣孔中，從觀察孔中觀察到2條藍黑色帶，表明采 集的動物糞便中含有禽流感病毒，這證明被檢驗動物感染了禽流感病毒。采用不同濃度測 的病毒抗原檢測試紙條的靈敏度，本發(fā)明試紙條的檢測病毒的靈敏度可達到7. 5ng/ml。
實施例12 本發(fā)明的試紙條檢測動物唾液中是否含有禽流感病毒的方法 采集可能感染禽流感病毒的動物唾液首先用以下溶液進行處理，該溶液含有1 %質(zhì)量濃度的聚乙二醇20000、 10%質(zhì)量濃度的正丁醇和pH值為7. 2、0. 05mol/L的磷酸鹽緩 沖液。以1ml溶液溶解lg唾液的比例溶解采集的動物唾液，混勻后，取05-lml的溶液滴加 到試紙條上的加樣孔中，從觀察孔中觀察到2條藍黑色帶，這表明被檢測動物感染了禽流 感病毒。采用不同濃度測的病毒抗原檢測試紙條的靈敏度，本發(fā)明試紙條的檢測病毒的靈 敏度可達到7. 5ng/ml。
權(quán)利要求
一種檢測禽流感病毒的試紙條，該試紙條包括以下部分墊板(1)，所述的墊板為塑料墊板；位于墊板(1)上的硝酸纖維素膜(3)，其小于墊板(1)并與墊板(1)的長度差為墊板長度的13/30-1/2并與墊板(1)部分重疊，所述的硝酸纖維素膜與墊板在長度方向上一致，所述的硝酸纖維素膜含有金標(biāo)記的AIV單克隆抗體、AIV血清和羊抗鼠IgG；緊貼在墊板(1)和硝酸纖維素膜(3)之間的結(jié)合墊(2)，結(jié)合墊(2)貼在硝酸纖維素膜(3)和墊板(1)之間部分的長度為墊板長度1/5-1/4，并且所述的結(jié)合墊為含有脫脂酪蛋白、金標(biāo)記的AIV單克隆抗體、AIV血清和羊抗鼠IgG的玻璃纖維膜，優(yōu)選地，所述的結(jié)合墊(2)為一個結(jié)合墊；緊貼在硝酸纖維素膜(3)上表面的結(jié)合墊(2”)，結(jié)合墊(2”)與硝酸纖維素膜(3)部分重疊，該重疊部分的正投影與上述結(jié)合墊(2)貼在硝酸纖維素膜(3)和墊板(1)之間的部分至少部分重疊，結(jié)合墊(2”)與硝酸纖維素膜重疊部分的長度為墊板(1)長度的1/30-1/20，所述的結(jié)合墊(2”)為含有脫脂酪蛋白、金標(biāo)記的AIV單克隆抗體、AIV血清和羊抗鼠IgG的玻璃纖維膜；兩片吸水濾紙(4)，一片緊貼在結(jié)合墊(2”)的上表面，并且該吸水濾紙、結(jié)合墊(2”)、硝酸纖維素膜(3)、結(jié)合墊(2)和墊板(1)的正投影有共同的重疊部分，另一片緊貼在硝酸纖維素膜上表面與結(jié)合墊(2”)相距最遠的位置，該吸水濾紙與另一吸水濾紙、結(jié)合墊(2”)或結(jié)合墊(2)之間最近的距離為墊板長度的9/20-7/15，并且該最近的距離內(nèi)是相互重疊的墊板和硝酸纖維素膜。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其中緊貼在墊板(1)和硝酸纖維素膜(3)之間的結(jié) 合墊(2)是兩個結(jié)合墊，這兩個結(jié)合墊之間長度方向上的空隙為墊板長度的9/20-7/15，結(jié) 合墊(2")與硝酸纖維素膜(3)部分重疊，該重疊部分的正投影與一個所述的結(jié)合墊(2)貼 在硝酸纖維素膜(3)和墊板(1)之間的部分至少部分重疊，另一個結(jié)合墊(2)的正投影至 少部分重疊于距離結(jié)合墊(2")最遠位置的吸水濾紙(4)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試紙條，其中所述的結(jié)合墊(2)和結(jié)合墊(2")還含有 1)阿拉伯膠、2)對苯二酚和3)醋酸銀或硝酸銀。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的試紙條，其中所述的硝酸纖維素膜還含有1)阿拉 伯膠、2)對苯二酚和3)醋酸銀或硝酸銀。
5. —種處理感染禽流感病毒動物的糞便和分泌物的溶液，該溶液包含pH值為7. 0-7. 4 的磷酸鹽緩沖液、聚乙二醇和正丁醇。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的溶液，其中所述溶液包含0. 5-1. 5%質(zhì)量濃度的聚乙二醇 20000、8% _12%質(zhì)量濃度的正丁醇^11值為7. 2的磷酸緩沖液，優(yōu)選地，所述溶液包含1% 質(zhì)量濃度的聚乙二醇20000、 10%質(zhì)量濃度的正丁醇和0. 05mol/L pH值為7. 2磷酸鹽緩沖 液。
7. —種制備權(quán)利要求1或2所述試紙條的方法，該方法包括以下步驟a. 將玻璃纖維膜充分浸泡于處理液中，再將處理后的玻璃纖維膜干燥，得到所述的結(jié) 合墊，所述的處理液含有脫脂酪蛋白和磷酸鹽緩沖液；b. 將金標(biāo)記的AIV單克隆抗體、AIV血清和羊抗鼠IgG噴涂于步驟a得到的結(jié)合墊和 空白的硝酸纖維素膜并進行干燥；c.將吸水濾紙、步驟b得到的硝酸纖維素膜和結(jié)合墊按照權(quán)利要求1或2所述的位置 關(guān)系固定于所述的墊板上，得到所述的試紙條。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中在所述的步驟b和步驟c之間，還將干燥后的噴涂 有金標(biāo)記的AIV單克隆抗體、AIV血清和羊抗鼠IgG的結(jié)合墊和硝酸纖維素膜用EDC溶液 浸泡、干燥之后再置于銀離子處理液浸泡并干燥。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中所述的金標(biāo)記的AIV單克隆抗體的濃度為 3. 75-4. 25mg/ml， AIV血清的濃度為4. 75-5. 25mg/ml，羊抗鼠IgG的濃度為4. 75-5. 25mg/ ml。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其中所述的銀離子處理液含有阿拉伯膠、pH值為 3. 5的檸檬酸鹽緩沖液、對苯二酚和醋酸銀溶液，并且阿拉伯膠的體積pH值為3. 5的檸檬酸鹽緩沖液的體積對苯二酚的體積醋酸銀溶液的體積為6 :i:2:i。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10中所述的方法，其中所述的阿拉伯膠的質(zhì)量濃度為14-16%、對苯 二酚的質(zhì)量濃度為80-90%、醋酸銀的質(zhì)量濃度為9. 5-10. 5%，優(yōu)選地，所述的阿拉伯膠的 質(zhì)量濃度為15%、對苯二酚的質(zhì)量濃度為85%、醋酸銀溶液的濃度為10%。
12. 根據(jù)權(quán)利要求7-11中任一項所述的方法，其中步驟a所述的處理液中含有 0. 75-1. 25%質(zhì)量濃度的脫脂酪蛋白和0. 025-0. 075mol/L磷酸鹽緩沖液，優(yōu)選地，所述的 處理液中含有1. 0%質(zhì)量濃度的脫脂酪蛋白和pH值為7. 2的0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測禽流感病毒的試紙條，該試紙條包括以下部分墊板1；硝酸纖維素膜3，所述的硝酸纖維素膜含有金標(biāo)記的AIV單克隆抗體、AIV血清和羊抗鼠IgG；結(jié)合墊2和結(jié)合墊2”，所述的結(jié)合墊2和結(jié)合墊2”分別為含有脫脂酪蛋白、金標(biāo)記的AIV單克隆抗體、AIV血清和羊抗鼠IgG的玻璃纖維膜；硝酸纖維素膜3，所述的硝酸纖維素膜含有金標(biāo)記的AIV單克隆抗體、AIV血清和羊抗鼠IgG；兩片吸水濾紙4；本發(fā)明還對這幾部分的長度和位置關(guān)系作了限定。本發(fā)明還提供了一種處理禽流感病毒感染動物的排泄物和分泌物的樣品處理溶液和制備試紙條的方法。本發(fā)明的試紙條具有靈敏度好，特異性強的優(yōu)點。
文檔編號G01N33/558GK101726597SQ20081022493
公開日2010年6月9日 申請日期2008年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月27日
發(fā)明者何宏軒, 吳艷云, 王承民 申請人:中國科學(xué)院動物研究所