用于生物樣本核酸檢測的質控方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生化檢測技術，尤其涉及一種用于生物樣本核酸檢測的質控方法 及試劑盒。
【背景技術】
[0002] SNP，全稱SingleNucleotidePolymorphism，是指在基因組上單個核苷酸的變 異，包括轉換、顛換、缺失和插入，形成的遺傳標記，其數(shù)量很多，多態(tài)性豐富。一般而言， SNPs是指變異頻率大于1 %的單核苷酸變異。在人類基因組中大概每1000個堿基就有一 個SNP，人類基因組上的SNP總量大概是3X106個。因此，SNP成為繼RFLP、STR多態(tài)標記 后的第三代遺傳標志，人體許多表型差異、對藥物或疾病的易感性等等都可能與SNP有關。
[0003] SNP研究是人類基因組計劃走向應用的重要步驟。這主要是因為SNP將提供一個 強有力的工具，用于高危群體的發(fā)現(xiàn)、疾病相關基因的鑒定、藥物的設計和測試以及生物學 的基礎研究等。SNP在基因組中分布相當廣泛，研究表明在人類基因組中每1000堿基對就 出現(xiàn)一次。大量存在的SNP位點，使人們有機會發(fā)現(xiàn)與各種疾病，包括腫瘤相關的基因組變 異；從實驗操作來看，通過SNP發(fā)現(xiàn)疾病相關基因突變要比通過家系來得容易；有些SNP并 不直接導致疾病基因的表達，但由于它與某些疾病基因相鄰，而成為重要的標記SNP在基 礎研究中也發(fā)揮了巨大的作用，通過對Y染色體SNPs的分析，使得在人類進化、人類種群的 演化和迀徙領域取得了一系列重要成果。
[0004] 核酸相關的檢測在醫(yī)療領域中以疾病的臨床分子診斷最具代表性，其檢測快速尚 效、結果準確率高等優(yōu)點顯而易見，但由于樣本量大導致操作步驟易出錯、對檢測本身的質 控手段單一等缺點也逐漸突顯出來。
[0005]目前，國內(nèi)生物相關科研機構及醫(yī)院的臨床診斷都具有樣本量大、檢測程序繁瑣， 如果沒有購買程控模塊化自動檢測儀器，則可能在核酸檢測實驗過程中存在較多影響結果 準確率的因素，例如較為常見的影響因素有樣本混淆或樣本相互污染等問題。為了排除整 個檢測過程中的人為因素干擾等情況，現(xiàn)在較大型的臨床診斷檢測機構都已經(jīng)參照美國臨 床和實驗室標準化研究院（CLSI)MM1-A2文件中所述的步驟將質控以檢測過程劃分，即分 析前質控、分析中質控、分析后質控，根據(jù)不同階段的要求建立起從樣本采集、分配、檢測、 結果分析等較完整的質控體系；例如分析前質控步驟中對樣本采集識別和驗收，國內(nèi)醫(yī)院 普遍采用的識別質控方法是條形碼標識區(qū)別，即在收集樣本時，針對每個個體樣本分配一 個條形碼并做好對應記錄，在檢測過程中樣本始終保證對應此條形碼。然而，此種質控是宏 觀的外部質控方法，面對如今越來越多的分子層級的檢測項目，仍然可能在檢測過程中發(fā) 生混淆污染等情況，針對樣本相互區(qū)分的問題缺乏微觀分子化手段，大大降低了分析前質 量控制的效力，影響了整個檢測過程的準確性。由此可見，新的質量控制方法對于新興的核 酸檢測應用及分子診斷技術重要性顯而易見。
[0006] 有鑒于上述的缺陷，本設計人，積極加以研究創(chuàng)新，以期創(chuàng)設一種用于生物樣本核 酸檢測的質控方法及試劑盒，使其更具有產(chǎn)業(yè)上的利用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為解決上述技術問題，本發(fā)明的目的是提供一種有效實現(xiàn)分析中質控、以及分析 后質控、即使檢測過程中發(fā)生混淆污染等情況，也不會影響整個檢測過程準確性的用于生 物樣本核酸檢測的質控方法及試劑盒。
[0008] 本發(fā)明提供一種用于生物樣本核酸檢測的質控方法，包括以下步驟：
[0009] 1)采集待測生物樣本并提取樣本DNA備用；
[0010] 2)設計基因分型探針以備用：所述基因分型探針包括質控探針和檢測探針，其 中，所述質控探針用于樣本DNA的質控SNPs位點的檢測以區(qū)分不同的生物樣本，所述檢測 探針用于樣本DNA的目標SNPs位點的檢測；
[0011] 3)生物樣本的基因分型檢測。
[0012] 質控探針的目的在于，通過質控SNPs位點的檢測，為生物樣本賦予一組唯一的 SNPs編號，以便從根本上防止在檢測過程中發(fā)生混淆污染，例如采用5個質控探針，樣本1 的質控探針的檢測結果為AA-CC-TT-GG-AA，樣本2為AA-CC-TT-GG-CC，那么樣本1和樣本2 的SNPs編號即分別為AA-CC-TT-GG-AA和AA-CC-TT-GG-CC。為了提高樣本間的區(qū)分效果， 所述質控SNPs位點的篩選標準為：最小等位基因頻率（MinorAlleleFrequency，MAF)的 取值范圍為〇. 3-0. 5,并且所述質控SNPs位點間的連鎖不平衡參數(shù)r2〈0. 5,較小的MAF值 不利于實現(xiàn)生物樣本的基因分型、編號，而較大的連鎖不平衡參數(shù)，存在浪費質控探針的問 題。
[0013] 最小等位基因頻率（MinorAlleleFrequency，MAF)通常是指在給定人群中的不 常見的等位基因發(fā)生頻率，例如TT，TC，CC三個基因型，在人群中C的頻率=0. 36,T的頻 率=0. 64,則等位基因C就為最小等位基因，MAF= 0. 36。從理論上來看每一個SNP位點 都可以有4種不同的變異形式，但實際上發(fā)生的只有兩種，即轉換和顛換，二者之比為2 :1。 SNPs在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁，而且多是C轉換為T，原因是CG中的胞嘧啶常被甲基化， 而后自發(fā)地脫氨成為胸腺嘧啶。
[0014] 生物樣本核酸檢測過程中，目標SNPs位點為與待檢疾病、健康、亞健康狀況、藥物 反應相關的SNPs位點。
[0015] 其中，待檢疾病包括多種，例如糖尿病、乳腺癌、心血管疾病、耳聾、直腸癌等，以耳 聾線粒體基因mt. 1555G>A突變?yōu)槔袛y帶這一基因突變的人群在單次使用任意劑量 氨基糖苷類藥物后均會導致耳聾，實驗表明，有過氨基糖苷類藥物接觸史的突變?nèi)巳旱陌l(fā) 病年齡為5歲，無氨基糖苷類藥物接觸史的為20歲，通過目標SNPs位點的檢測，可以有效 推遲發(fā)病年齡，并有利于針對突變?nèi)巳禾岢龊侠淼纳詈椭委熃ㄗh。
[0016] 與健康相關的目標SNPs檢測，包括多種情況，如營養(yǎng)、鍛煉等，部分人群由于存在 某些SNPs，不論如何鍛煉也不會瘦或減肥效果不佳，不同人群的食物的吸收程度也存在差 異，根據(jù)基因分型結果判斷基因功能，從而為個體、飲食運動及醫(yī)療保健提供指導。例如與 飲食健康（飲食類型、脂肪攝入類型）相關的45個基因，如PPARG、FADS1、ΑΡ0Β等，與飲食 習慣（愛吃零食、空腹感、飲食失控、愛吃甜食）相關的6個基因，如FTO、TAS2R38、SLC2A2 等，還有食物反應（乳糖不耐、酒精代謝）、營養(yǎng)需求（維生素、葉酸水平）、運動反應（跟腱 受傷、耐力訓練效果）、代謝因子（血脂、血糖）等其它方面的健康相關的目標SNPs檢測。
[0017] 與亞健康相關的目標SNPs檢測，是由于部分人群或多或少存在一些亞健康問題， 卻又未達到疾病的程度，例如部分人群天生體質較弱，大病不得，小病不斷，還有部分人群 天生存在自卑、好動等問題。
[0018] 藥物反應相關的SNPs位點，有助于根據(jù)藥物反應位點檢測結果，提供個性化用藥 指導，如確定藥物的敏感性及耐藥性（選擇適合的藥物），制定合適的用藥劑量（提高藥物 治療的有效性），降低不良反應的發(fā)生（增加藥物的安全性），避免試、錯用藥（縮短尋找適 合治療藥物的時間、減輕經(jīng)濟負擔）。
[0019] 通過目標SNPs位點的挑選、組合與檢測，可以實現(xiàn)對目標個體的待檢疾病、健康、 亞健康、藥物反應的檢測和評價。檢測過程中，可以單個待檢目標相關SNPs形成一個單一 檢測體系，也可多種待檢目標相關SNPs形成一個復合檢測體系。
[0020] 在檢測過程中可能出現(xiàn)但不局限于以下情況：1)兩個樣本間的SNPs編號相同，但 是性別不同；2)樣本的性別與待檢疾病具有相關性；3)分析前質控步驟中，樣本的性別信 息丟失。因此，所述基因分型探針還包括用于檢測Y染色體上特有SNPs位點的性別質控探 針，由于性別質控探針偶爾會出現(xiàn)檢測失效的問題，為了保證檢測結果的準確性，所述性別 質控探針為至少3個，這樣，只要有其中2個探針檢測為某種性別時，即可相應地實現(xiàn)性別 的判定。
[0021] 由于檢測過程中容易受到檢測儀器和配件的限制，基因分型探針的數(shù)量通常較為 固定，例如基因分型檢測過程通常采用96孔板，為了有效區(qū)分樣本，同時不會影響檢測探 針的檢測效果，所述質控探針的種類數(shù)為至少5個;MAF的取值越接近于0. 5,則單個質控探 針對于質控SNPs位點的區(qū)分度越接近于3,即有效區(qū)分基因型AA、Aa和aa，那么5個質控 探針即可最大有效區(qū)分35= 243個生物樣本。應用在常見的96孔板上，因其對應96個生 物樣本的檢測，足以有效實現(xiàn)區(qū)分樣本，實現(xiàn)質控，當MAF值小于0. 3時，質控探針因基因型 的區(qū)分度不夠，難以實現(xiàn)有效樣本區(qū)分。
[0022] 為了實現(xiàn)高通量檢測，所述生物樣本的基因分型檢測采用TaqMan探針法，除了 TaqMan探針法，還可使用SNPtype的方法，或者自己定制設計的檢測方法。
[0023