一種蔗糖異構(gòu)酶的高效制備方法及其基因工程菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體設(shè)及一種高產(chǎn)薦糖異構(gòu)酶的基因工程 菌及其高效生產(chǎn)薦糖異構(gòu)酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 異麥芽酬糖化-0-α-D-化喃葡糖基-D-果糖，Isomaltulose)，又名帕拉金糖 任alatinose)，在自然界中W微量水平存在于蜂蜜和薦汁中。它與薦糖互為同分異構(gòu)體，不 僅具備薦糖的物理性質(zhì)和口感，還具有低甜味、耐酸解、防離齒和吸濕性低等特點(diǎn)，因此受 到了食品屆制取無(wú)糖甜食品的歡迎，已逐漸被用作薦糖的替代品。
[0003] 薦糖異構(gòu)酶（Sucroseisomerase,SIA,E.C. 5. 4. 99. 11)廣泛應(yīng)用于異麥芽酬 糖的工業(yè)生產(chǎn)。該酶催化薦糖異構(gòu)化產(chǎn)生異麥芽酬糖和海藻酬糖，同時(shí)生成少量的葡 萄糖、果糖和異麥芽糖等。目前來(lái)源于大黃歐文氏菌巧rwiniarhapontici)、腸桿菌屬 巧nterobactersp.)、精蛋白桿菌（Protaminobacterrubrum)、肺炎克雷伯菌化lebsiella pneumonia)、分散泛菌（Pantoeadispersa)、植生克雷伯菌化lebsiellaplanticola)、 沙雷氏桿菌（Serratiaplymuthica)、嗜中酸假單胞菌（Pseudomonasmesoacidophila) W及克雷伯氏桿菌屬化lebsiellasp.)細(xì)胞都具有產(chǎn)生薦糖異構(gòu)酶的能力（Wanmeng Mu,etal.ApplMicrobiolBiotechnol, 2014,98:6569-6582)。目前，對(duì)于薦糖異構(gòu)酶 的異源表達(dá)主要是在大腸桿菌等非食品級(jí)的宿主中進(jìn)行的（WanmengMu,etal.Appl MicrobiolBiotechnol, 2014, 98:6569-6582)。1995 年，Ralf等第一次報(bào)道了 將深紅 紅螺菌煙lodospirillumrubrumCBS574. 77)來(lái)源的薦糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中進(jìn)行了 表達(dá)。接著，來(lái)源于7種不同的微生物的薦糖異構(gòu)酶也在大腸桿菌中得到了表達(dá)。但 是，有一些大腸桿菌表達(dá)的重組薦糖異構(gòu)酶很容易失活。此外，韓國(guó)慶熙大學(xué)的研究者 們也將薦糖異構(gòu)酶在乳酸乳球菌和釀酒酵母中進(jìn)行了表達(dá)（ParkJY，etal，Bioresour Technol, 2010, 101:8828-8833;LeeGY,BioresourTechnol,2011, 102:9179-9184)。
[0004] 異麥芽酬糖的高效制備方法也得到了廣泛的研究，主要是對(duì)產(chǎn)薦糖異構(gòu)酶的游離 細(xì)胞和固定化細(xì)胞生產(chǎn)異麥芽酬糖的條件進(jìn)行優(yōu)化。與游離細(xì)胞相比，固定細(xì)胞在異麥芽 酬糖的工業(yè)化生產(chǎn)中具有可連續(xù)操作、操作穩(wěn)定性較高W及生物催化劑可循環(huán)利用等優(yōu) 勢(shì)。但目前已報(bào)道的大部分野生菌株均存在細(xì)胞得率低、細(xì)胞酶活低、高濃度底物下的耐受 性差等問(wèn)題，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率低，轉(zhuǎn)化時(shí)間長(zhǎng)。因此，構(gòu)建高效、底物耐受性好的產(chǎn)酶菌株將有利 于異麥芽酬糖的生產(chǎn)。
[0005] 地衣芽抱桿菌作為一個(gè)通常被認(rèn)為是安全（generallyregardedassafe,GRA巧 的菌種，由于其低廉的發(fā)酵成本與優(yōu)良的蛋白分泌水平（可高達(dá)20~25mg/mL)，作為 重組蛋白的表達(dá)宿主細(xì)胞具有很多優(yōu)勢(shì)，是重組蛋白，特別是工業(yè)酶制劑的重要生產(chǎn)宿 主細(xì)胞。目前，60%的商業(yè)用酶的宿主均來(lái)自于芽胞桿菌屬。發(fā)明人在前期研究中獲 得了一種地衣芽抱桿菌宿主細(xì)胞CBB3008及其用于重組蛋白高效分泌表達(dá)的方法狂L 200810235368. 0)，還獲得了地衣芽抱桿菌的表達(dá)質(zhì)粒地L-WZX、pHY-Wa(和PCHA03狂L 200510081648.7 ；ZL2010110252742.5；DandanNiuandZhengxiangWang.JInd MicrobiolBiotechnol, 2007, 34:357-362)。而且，已經(jīng)將該表達(dá)系統(tǒng)成功應(yīng)用于高溫 曰-淀粉酶及其突變體的高效制備狂L200810235367.6;DandanNiu,etal.Microbial CellFactories, 2009, 8:58)〇
[0006] 由于不同的信號(hào)膚對(duì)不同蛋白的分泌表達(dá)具有不同的效果，通過(guò)改變信號(hào)膚實(shí) 現(xiàn)異源蛋白的分泌優(yōu)化是一項(xiàng)常見(jiàn)的技術(shù)。隨著人們對(duì)芽胞桿菌分泌蛋白種類(lèi)認(rèn)識(shí)的 加深，人們開(kāi)始嘗試大規(guī)模篩選針對(duì)特定蛋白具有分泌優(yōu)化性質(zhì)的信號(hào)膚。2006年，Ulf 化ockmeier等對(duì)枯草芽胞桿菌的信號(hào)膚進(jìn)行優(yōu)化，用170多個(gè)信號(hào)膚替換原來(lái)的信號(hào)膚， 使得角質(zhì)酶的胞外酶活從0提高到4. 67U/mL。化ristianDegering等在2010年通過(guò)建立 來(lái)源于枯草芽胞桿菌W及地衣芽抱桿菌的信號(hào)膚庫(kù)，篩選獲得地衣芽抱桿菌的化i〇〇38信 號(hào)膚，使蛋白酶BPN的分泌效果比原來(lái)提高了 6倍。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是獲得一種薦糖異構(gòu)酶的高效、低成本制備方法，用于薦糖異構(gòu)酶 的工業(yè)化制備及異麥芽酬糖的高效生產(chǎn)，由此可降低其發(fā)酵制造成本、簡(jiǎn)化發(fā)酵制造工藝 及降低發(fā)酵工業(yè)的環(huán)境壓力。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0009] 首先，本發(fā)明提供一種薦糖異構(gòu)酶基因，其核巧酸序列如SEQIDN0:3所示，所述 基因的編碼產(chǎn)物為薦糖異構(gòu)酶，其氨基酸序列如SEQIDN0:2所示。
[0010] 上述薦糖異構(gòu)酶基因是通過(guò)對(duì)來(lái)源自±壤發(fā)散菌（Pantoeadispersa)的薦糖異 構(gòu)酶基因Sim進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并通過(guò)全基因合成技術(shù)獲得，原始薦糖異構(gòu)酶基因Sim的核 巧酸序列如SEQIDNO: 1所示，其編碼產(chǎn)物薦糖異構(gòu)酶的氨基酸序列如SEQIDNO: 2所示。
[0011] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種含有序列如SEQIDN0:3所示的薦糖異構(gòu)酶基因的表 達(dá)載體或基因工程重組菌。
[0012] 更進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種重組地衣芽抱桿菌CB抓302-2,其特征在于，所述重 組菌包含序列如SEQIDN0:3所示的薦糖異構(gòu)酶基因的。
[0013] 更進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種重組地衣芽抱桿菌CB抓302-S孔dN，其特征在于，所 述重組菌在薦糖異構(gòu)酶基因的上游還包含核巧酸序列如SEQIDN0:5所示的信號(hào)膚基因。
[0014] 更進(jìn)一步地，上述重組地衣芽抱桿菌的構(gòu)建方法包括利用基因工程的手段提高薦 糖異構(gòu)酶的酶活，特別是密碼子和信號(hào)膚的優(yōu)化。
[0015] 更進(jìn)一步地，上述重組地衣芽抱桿菌菌株可合成并分泌薦糖異構(gòu)酶，重組菌 CB抓302-S孔dN酶活比原始菌提高了 3倍W上，比重組菌CB抓302-2提高了約83%。
[0016] 更進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供一種薦糖異構(gòu)酶的高效制備方法，包括利用上述重組 菌發(fā)酵進(jìn)行薦糖異構(gòu)酶合成與分泌，W及重組酶產(chǎn)品的回收。
[0017] 更進(jìn)一步地，利用上述重組菌發(fā)酵生產(chǎn)的薦糖異構(gòu)酶，可催化薦糖高效制備異麥 芽酬糖，所制備的產(chǎn)品中異麥芽酬糖的含量可達(dá)100%。
[0018] 本發(fā)明通過(guò)在含有編碼薦糖異構(gòu)酶基因的重組地衣芽抱桿菌中基因密碼子優(yōu)化 和信號(hào)膚優(yōu)化，從而提高薦糖異構(gòu)酶的表達(dá)量。并對(duì)薦糖異構(gòu)酶分泌效果最好的重組地衣 芽抱桿菌進(jìn)行生長(zhǎng)培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝的優(yōu)化。與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有W下有益效果：
[0019] 1、本發(fā)明篩選獲得的信號(hào)膚，實(shí)現(xiàn)了薦糖異構(gòu)酶的高效分泌表達(dá)，與原信號(hào)膚相 比，薦糖異構(gòu)酶的分泌量提高了 3倍多，對(duì)于降低薦糖異構(gòu)酶的生產(chǎn)成本及其進(jìn)一步大規(guī) 模應(yīng)用具有重要意義；
[0020] 2、本發(fā)明篩選獲得薦糖異構(gòu)酶的分泌信號(hào)膚的方法，相當(dāng)于轉(zhuǎn)錄效率的優(yōu)化，不 會(huì)引起分泌通道的阻塞，進(jìn)而影響下游的發(fā)酵；
[0021] 3、本發(fā)明的適合含有薦糖異構(gòu)酶編碼基因的重組菌進(jìn)行薦糖異構(gòu)酶合成與分泌， W及重組酶的回收與產(chǎn)品制備的生長(zhǎng)培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝，可W用于低成本、簡(jiǎn)約化制造薦 糖異構(gòu)酶。
[0022] 4、本發(fā)明的重組菌的選育方法，經(jīng)過(guò)適當(dāng)修飾后，可W用于其它類(lèi)型的工業(yè)酶制 劑，特別是W地衣芽抱桿菌、巨大芽胞桿菌和解淀粉芽胞桿菌等為宿主細(xì)胞的工業(yè)酶制劑 生產(chǎn)菌株的選育。
[0023] 5、本發(fā)明中異麥芽酬糖的高效制備工藝，可W使產(chǎn)物中異麥芽酬糖的含量達(dá)到 100%
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1:重組表達(dá)質(zhì)粒抑Y-sim和抑Y-sim2的物理圖譜；其中，圖1 (a)為重組質(zhì)粒 pHY-sim，圖 1 (b)為重組質(zhì)粒pHY-sim2;
[002引圖2 :sim與sim2的核巧酸序列比對(duì)；其中，表示核巧酸轉(zhuǎn)換，"#"表示核巧酸 顛換；
[0026]圖3:信號(hào)膚優(yōu)化策略提高薦糖異構(gòu)酶在地衣芽抱桿菌中的分泌表達(dá)；
[0027] 圖4:制備的薦糖異構(gòu)酶對(duì)薦糖的水解作用；
[002引圖5 :反應(yīng)1化后薦糖水解產(chǎn)物中異麥芽酬糖含量的測(cè)定。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面通過(guò)具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段 均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說(shuō)明性的，而非限制本發(fā)明的 范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書(shū)所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本 發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)運(yùn)些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0030] 實(shí)施例1薦糖異構(gòu)酶編碼基因的密碼子優(yōu)化
[003UWPantoeadispersaUQ68J的基因組DM為模板，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中P.dispersaUQ68J的薦糖異構(gòu)酶基因sim(GenBank登錄號(hào)：AY223549. 1)的序列設(shè)計(jì)引物， 用PrimeSTAR服DNA聚合酶W擴(kuò)增包含信號(hào)膚的Sim基因（核巧酸序列SEQIDN0:1。 PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件參考PrinwSTAR1'服DMPolymerase說(shuō)明書(shū)燈aKaRa)。將 PCR產(chǎn)物克隆入表達(dá)載體pHY-WZX值andan化UandZhengxiangWang.JIndMicrobiol Biotechnol, 2007, 34:357-362)的甜aI、KpnI位點(diǎn)中，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pHY-sim(圖 la)。WpHY-sim為基礎(chǔ)，通過(guò)網(wǎng)站ht1:p://genomes.urv.es/OPTIMIZER/，優(yōu)化薦糖異構(gòu)酶 編碼基因的密碼子組成，并通過(guò)全基因合成技術(shù)（牛丹丹等。應(yīng)用與環(huán)境生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2007, 13 (4) :515-518)，獲得密碼子優(yōu)化的編碼薦糖異構(gòu)酶的新基因sim2 (核巧酸序列如 SEQIDNO: 3所示），其