Top2a基因檢測探針及其制備方法和試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術，特別是涉及T0P2A基因檢測探針及其制備方法和試劑盒。
【背景技術】
[0002] T0P2A基因是DNA拓撲異構(gòu)酶IIa(Topoisomerase II alpha，TOPIIc〇的編碼基因， DNA拓撲異構(gòu)酶的生物學作用，一是調(diào)節(jié)控制DNA的超螺旋狀態(tài)及打結(jié)或解結(jié)DNA的環(huán)連體 狀態(tài)，從而間接地影響細胞內(nèi)核酸代謝過程;二是直接參與那些需打斷并重新連接DNA分子 鏈的細胞過程，DNA的重組、修復、轉(zhuǎn)錄及復制過程。存在T0P2A基因異常的患者預后差，無復 發(fā)生存期縮短，尤其是T0P2A基因缺失的患者預后更差?；驍U增提示腫瘤有復發(fā)的可能， 或者遠期的療效下降。
[0003] 蒽環(huán)類藥物是乳腺癌術后輔助化療的基石，研究證實T0P2A基因與蒽環(huán)類療效相 關【Brase，JC，Schmidt，M，F(xiàn)ischbach，T，Sul tmann，H，Bojar，H，Koelbl，H(2010)ERBB2 and T0P2A in breast cancer:a comprehensive analysis of gene amplification，RNA levels，and protein expression and their influence on prognosis and predict ion.Clin Cancer Res 16:pp·2391-2401，F(xiàn)ountzilas，G，Christodoulou，C，Bobos，M， Kotoula，V，Elef theraki，AG，Xanthakis，I (2012)Topoisomerase II alpha gene amplification is a favorable prognostic factor in patients wi th HER2-positive metastatic breast cancer treated with trastuzumab.J Transl Med 10: pp·212，Bartlett J M S，McConkey C C，Munro A F，et al.Predicting Anthracycline Benefit:T0P2A and CEP17一Not Only but Also[J].Journal of Clinical Oncology, 2015:兀0.2013.54.7869.】，1'0?2八基因狀態(tài)改變與腫瘤復發(fā)風險、患者生存相關。
[0004] 因此正確檢測和評定乳腺癌的T0P2A狀態(tài)至關重要J0P2A基因定位于17號染色體 17q21區(qū)域，T0P2A的異常情況分為擴增和缺失兩種情況，F(xiàn)ISH檢測可對于這兩種情況作出 明確判斷。
[0005] 焚光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization FISH)是20世紀80年代末 期在原有的放射性原位雜交技術的基礎上發(fā)展起來的一種非放射性原位雜交技術。目前這 項技術已經(jīng)廣泛應用于動植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、 人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學和基因組進化研究待許多領域。FISH的基本原理是用已知的標 記核酸為探針，按照堿基互補的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行異性結(jié)合，形成可 被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以 探針直接與染色體進行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。與傳統(tǒng)的放射性標記原位 雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測信號強、雜交特異性高和可以多重染色等特點，因 此在分子細胞遺傳學領域受到普遍關注。
[0006] 雜交所用的探針大致可以分類三類：1)染色體特異重復序列探針，例如α衛(wèi)星、衛(wèi) 星III類的探針，其雜交靶位常大于1Mb，不含散在重復序列，與靶位結(jié)合緊密，雜交信號強， 易于檢測；2)全染色體或染色體區(qū)域特異性探針，其由一條染色體或染色體上某一區(qū)段上 極端不同的核苷酸片段所組成，可由克隆到噬菌體和質(zhì)粒中的染色體特異大片段獲得;3) 特異性位置探針，由一個或幾個克隆序列組成。
[0007] 探針的熒光素標記可以采用直接和間接標記的方法。間接標記是采用生物素標記 DNA探針，雜交之后用藕聯(lián)有熒光素親和素或者鏈霉親和素進行檢測，同時還可以利用親和 素-生物素-熒光素復合物，將熒光信號進行放大，從而可以檢測500bp左右的片段。而直接 標記法是將熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價結(jié)合，或在缺口平移法標記探針 時將熒光素核苷三磷酸摻入。直接標記法在檢測時步驟簡單，臨床使用方便。
[0008] 而目前對于T0P2A基因 FISH方法檢測，還缺少特異性高的檢測試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的之一是提供一種T0P2A基因檢測探針及其制備方法，所制備的探針 可用于檢測T0P2A基因狀態(tài)，即檢測T0P2A基因的指拷貝數(shù)變化，具有很好的特異性。
[0010] 實現(xiàn)上述目的的技術方案如下。
[0011] -種T0P2A基因檢測探針的制備方法，包括以下步驟：
[0012] (1)選取BAC克隆為1^11-1152六10、(^0-321705中至少一種，或選取從(：克隆為 1^11-73706、01)-3087022、1^11-48010、01)-21341(5中的至少一種 ；
[0013] (2)對克隆分別提取質(zhì)粒，得到質(zhì)粒DNA，定量；
[0014] (3)用熒光素標記質(zhì)粒DNA，不同來源的質(zhì)粒DNA所標記的熒光素相同，即得。
[0015] 在其中一個實施例中，所述BAC克隆為RP11-1152A10和CTD-3217C5。
[0016] 在其中一個實施例中，所述BAC克隆為RPll-737D6、CTD-3087022、RPll-48010jP CTD-2134K5。
[0017] 在其中一個實施例中，標記熒光素選擇本領域已知的熒光染料，優(yōu)選地，熒光素為 ΛI exa FI uor?488、F I T C、Λ1 exa FI uor?555、Rh〇damine、Texas Red、 pacific blue?、DEAC。
[0018] 在其中一個實施例中，基因探針的標記可以采用現(xiàn)有技術中的方法將相應熒光素 標記至雙鏈核酸上，所述方法包括但不限于：隨機引物法、切口平移等，標記基因探針可以 使用市售的缺口平移標記試劑盒和/或隨機引物標記試劑盒，優(yōu)選abbott和/或Roche公司 的Nick Translation Kit。本發(fā)明步驟(3)優(yōu)選采用隨機引物法、切口平移法對質(zhì)粒DNA進 行熒光素標記。
[0019] 在其中一個實施例中，所述標記的溫度為24°C_26°C，標記的時間為4-6小時。
[0020] 本發(fā)明的另一目的是提供一種T0P2A基因檢測試劑盒。
[0021] 實現(xiàn)該目的技術方案如下。
[0022] 一種T0P2A基因檢測試劑盒，包括有上述T0P2A基因檢測探針。
[0023] 在其中一個實施例中，包括有用于內(nèi)控的17號染色體鑒別探針(CSP17)探針，該鑒 別探針與T0P2A基因檢測探針標記的熒光素的顏色不相同。
[0024] 在其中一個實施例中，還包括有用于封閉重復序列的COT Human DNA，和DAPI復染 劑。
[0025]本發(fā)明具有以下有益效果：
[0026] 1 .本發(fā)明通過篩選到最優(yōu)的T0P2A基因檢測探針及其組合，采用FISH (Fluorescence In-Situ Hybridization)方法對T0P2A基因拷貝數(shù)檢測，
[0027] 2.本發(fā)明優(yōu)選克隆檢測特異性好，靈敏度高。并通過調(diào)整標記溫度和時間，限制長 度探針為500bp左右，提高雜交效率和降低雜交背景。
[0028] 3.信號計數(shù)行準確、快速，且結(jié)果的重復性好;補充了臨床中T0P2A突變檢測的不 足，有利于篩選更多受益于靶向藥物的患者，提高乳腺癌患者生存率和總生存期。
[0029] 4.通過本發(fā)明所述的T0P2A試劑盒，從基因水平了解T0P2A狀態(tài)改變，多種信號類 型表現(xiàn)出實體組織的腫瘤細胞遺傳多樣性，可以實現(xiàn)在腫瘤生物學、細胞遺傳學等領域的 應用，有助綜合評價各分子標志物，輔助乳腺癌臨床靶向治療用藥及治療方案選擇。
【附圖說明】
[0030]圖1為是實施例1中檢測探針序列的示意圖。
[0031 ]圖2為實施例1中人外周血培養(yǎng)細胞片F(xiàn)ISH檢測結(jié)果圖。
[0032]圖3為實施例4中乳腺癌