本發(fā)明屬于喜樹堿的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用磁性固相萃取吸附材料富集檢測(cè)喜樹堿的方法。

背景技術(shù)：

喜樹堿(camptothecin)是在珙桐科落葉植物(nyssaceae)喜樹的根皮，或者種子中提取出來的，它是一個(gè)具有顯著的抵御腫瘤活體特性的堿性物質(zhì)。目前，這是獨(dú)一被檢測(cè)到的通過遏制拓?fù)洚悩?gòu)酶施展細(xì)胞毒性的一種自然植物活性因素。盡管喜樹堿存在著毒性和副作用，專業(yè)人士對(duì)于它及其衍生物的探尋的腳步從未停下，基于喜樹堿的構(gòu)造和抗癌活性的關(guān)系很貼近。喜樹堿為淡黃色的針狀結(jié)構(gòu)結(jié)晶體，能溶解在甲醇、naoh溶液和乙醇溶液中，但在水中卻不能溶解。其熔點(diǎn)為264～267℃，光照易變質(zhì)，有輕微的吸濕性，遇到濃硫酸會(huì)顯黃綠色，用無菌水稀釋生成黃綠色熒光且溶液顯堿性。喜樹堿是五個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，a環(huán)是哇琳環(huán)，b環(huán)為哇琳環(huán)，c、d環(huán)分別為為毗咯環(huán)和毗咤酮結(jié)構(gòu)構(gòu)造，e環(huán)則是一個(gè)α—羥基內(nèi)脂(包含有s型手性碳結(jié)構(gòu))。喜樹堿：c20h16n2o4；分子量348.3，分子結(jié)構(gòu)如式1-1所示。

由于喜樹堿在自然界中有很多的衍生物，其中的一種名稱為cpt—11(1c)的藥物，其抑制癌癥有特別的機(jī)制而且在抑制或行進(jìn)的途中不用依靠煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和三磷酸腺苷酶等能量協(xié)助因素，所以很多研究此類物質(zhì)的人員對(duì)其探索充滿了預(yù)期和愿景。喜樹堿抗癌的機(jī)理如式1-2所示，是拓?fù)洚悩?gòu)酶與cpt的相互作用的過程。

喜樹堿常用的檢測(cè)方法有薄層色譜法、高效液相色譜法和紫外分光光度法等，其中，薄層色譜法的檢測(cè)結(jié)果較為單一，只能夠檢測(cè)出樣品的存在與否，不能直接或間接的測(cè)定樣品的含量；高效液相色譜法能夠準(zhǔn)確并直接測(cè)得樣品中喜樹堿的含量，并且色譜圖清晰易懂，體現(xiàn)了高效液相色譜儀的靈敏度高、分析速度快、分辨率高、樣品用量少、易回收等特點(diǎn)。但是此方法測(cè)量時(shí)間較長(zhǎng)、儀器較為昂貴、所用流動(dòng)相通常為有機(jī)溶劑，對(duì)操作者健康及環(huán)境都將產(chǎn)生一定的危害。而紫外分光光度法具有準(zhǔn)確度高、分析速度快、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，為喜樹堿的檢測(cè)提供了快速、精確、便捷的目的。但由于實(shí)際樣品中，喜樹堿含量很低，儀器靈敏度受限等，直接測(cè)定并不能達(dá)到分析要求，因此在測(cè)定前有必要采用樣品分離和富集方法，提高分析檢測(cè)的靈敏度。

磁性固相萃取(mspe)是目前應(yīng)用較多的一種樣品的分離和富集方法。該方法是根據(jù)固相萃取理論，憑借材料本身特性而實(shí)現(xiàn)樣品分離和富集的一種方法。mspe可以直接將磁性吸附劑添加到樣品的溶液中，待測(cè)物可以被磁性吸附劑吸附在其分散的表面，隨后用洗脫液將待測(cè)物質(zhì)從吸附劑上解吸下來，達(dá)到了樣品與吸附劑分離的目的。該方法具有樣品用量少、萃取時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、干擾小等特點(diǎn)。相對(duì)于傳統(tǒng)固相萃取吸附劑，磁性固相萃取吸附劑在實(shí)驗(yàn)過程中會(huì)避免消耗大量吸附解吸時(shí)間而進(jìn)入了我們的視線當(dāng)中。由此，開發(fā)出適合分離和富集喜樹堿的新型吸附材料是目前亟待解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種利用磁性固相萃取吸附材料富集檢測(cè)喜樹堿的方法，所述磁性固相萃取吸附材料為β-環(huán)糊精改性的fe3o4磁性納米材料，通過β-環(huán)糊精的疏水性空腔與檢測(cè)物喜樹堿的疏水性之間的主客體包結(jié)作用來實(shí)現(xiàn)喜樹堿的富集。

本發(fā)明提供的利用磁性固相萃取吸附材料富集檢測(cè)喜樹堿的方法，所述磁性固相萃取吸附材料為β-環(huán)糊精改性的fe3o4磁性納米材料，具體富集檢測(cè)過程如下：

將含有喜樹堿的樣品溶液的ph值調(diào)節(jié)至10，之后倒入裝有β-環(huán)糊精改性的fe3o4磁性納米材料的容器中，所述樣品溶液和β-環(huán)糊精改性的fe3o4磁性納米材料按照1ml：0.6～1mg的比例投加，恒溫水浴振蕩15～20min，振蕩完畢后用磁鐵分離吸附材料；

向分離的吸附材料中加入堿性洗脫液，振蕩8～15min，完畢后取出，用磁鐵分離吸附材料，采用紫外分光光度法在366nm下檢測(cè)解吸液的吸光強(qiáng)度。

優(yōu)選地，所述方法的線性范圍在0.05～10μg/ml；檢出限為0.041μg/ml，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.7％。

優(yōu)選地，所述β-環(huán)糊精改性的fe3o4磁性納米材料通過水熱合成法制備，具體過程如下：將β-cd、fe²⁺和fe³⁺溶于一定量的naoh溶液中，在氮?dú)鈿夥障?，混合液攪拌至完全溶解，然后將混合液轉(zhuǎn)移到水熱反應(yīng)釜中，于160～165℃下反應(yīng)16～24h，反應(yīng)完畢后，用磁鐵將固液分離，用水和乙醇反復(fù)洗滌，將產(chǎn)物于75～80℃下真空干燥，即得β-環(huán)糊精改性的fe3o4磁性納米材料，記為β-cd@fe3o4納米材料；所述β-cd、fe²⁺和fe³⁺摩爾比為0.01～0.015：1：2。

更優(yōu)選地，所述naoh溶液的濃度為4.0mol/l。

更優(yōu)選地，所述fe²⁺通過feso4·7h2o提供，所述fe³⁺通過fe2(so4)3或fecl3·6h2o提供。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)喜樹堿獨(dú)特的藥用價(jià)值以及臨床作用，已成為一種熱門的研究物質(zhì)，其檢測(cè)尤為重要，本發(fā)明利用β-環(huán)糊精的疏水性空腔與檢測(cè)物喜樹堿的疏水性之間的主客體包結(jié)作用來實(shí)現(xiàn)喜樹堿的富集，有效避免了毒害作用的有機(jī)溶劑的使用，樣品洗脫的過程變得簡(jiǎn)單易操作，大倍數(shù)地富集作用可以使一些痕量化合物得以被檢測(cè)出。

(2)本發(fā)明采用水熱法制備β-環(huán)糊精改性的fe3o4納米材料，制備的納米粒子大小比較均勻，且在制備過程中可以有效避免n2保護(hù)不徹底而導(dǎo)致fe被氧化的問題，也除去了用β-cd二次改性fe3o4的繁瑣步驟。

(3)環(huán)糊精與fe3o4均是無污染、生物相容性好的材料，有利于抗癌藥物喜樹堿在復(fù)雜樣品基質(zhì)中的檢測(cè)。

(4)磁性固相萃取分離方法較為簡(jiǎn)便，可以利用磁鐵對(duì)fe3o4納米材料的吸附即可實(shí)現(xiàn)固液分離，方便收集洗脫液用于樣品檢測(cè)，有效避免了繁瑣的離心或過濾步驟。

附圖說明

圖1是喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外光譜圖；

圖2是喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例中提供的β-cd@fe3o4磁性納米材料的紅外光譜圖；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例中提供的fe3o4磁性納米材料的紅外光譜圖；

圖5是本發(fā)明實(shí)施例1、對(duì)比例1、對(duì)比例2對(duì)喜樹堿的檢測(cè)結(jié)果；

圖6是本發(fā)明實(shí)施例1、以及對(duì)比例3-5對(duì)喜樹堿的檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案能予以實(shí)施，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本發(fā)明的限定。

一、喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)定

我們配制了20μg/ml的喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，并過該標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行標(biāo)定，具體過程如下：稱取0.002g喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品于燒杯中，加入適量濃度的naoh水溶液，攪拌至其完全溶解，轉(zhuǎn)移到容量瓶中，得到20μg/ml的喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，其紫外譜圖如圖1所示，由圖1可以看出其最大吸收波長(zhǎng)為366nm。

然后我們將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋可得一系列濃度(0.05μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)的喜樹堿溶液，分別利用紫外可見分光光度法在366nm下依次測(cè)定每個(gè)濃度的對(duì)應(yīng)的吸光度，其吸光度的值見下表1所示。

表1喜樹堿不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度

我們以濃度為橫坐標(biāo)，吸光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，用origin軟件繪制出濃度與吸光度的關(guān)系圖，即可得到喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體如圖1所示。經(jīng)線性擬合得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝0.05283x－0.00432r²＝0.99958，說明其線性關(guān)系良好。

二、β-cd@fe3o4磁性納米材料的制備

采用水熱合成法制備β-cd@fe3o4磁性納米材料，具體過程如下：取12.8gβ-cd，溶于4mol/lnaoh溶液中至完全溶解，再加入2.78gfeso4·7h2o和4gfe2(so4)3，將此混合溶液n2保護(hù)下攪拌至完全溶解。然后轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，在160℃下反應(yīng)24h。反應(yīng)完畢后，用磁鐵將固液分離，用水和乙醇反復(fù)洗滌，將產(chǎn)物放在80℃下真空干燥。

我們對(duì)上述過程制備得到的β-cd@fe3o4磁性納米材料進(jìn)行表征，具體稱取約2mg的β-cd@fe3o4樣品進(jìn)行研磨，以kbr為背景，通過紅外光譜儀對(duì)該化合物進(jìn)行紅外光譜的掃描，得到的紅外光譜圖具體圖圖1所示。

通過圖3可以看出fe3o4的fe-o的特征吸收峰呈現(xiàn)在580cm^-1處，此處較為平坦可能是因?yàn)橹苽溥^程中微量fe氧化導(dǎo)致；1630cm^-1處是β-cd分子中面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰，且3400cm^-1出現(xiàn)了一個(gè)明顯的特征吸收峰，可能是β-cd@fe3o4納米材料表面的-oh氫氧鍵伸縮振動(dòng)吸收峰，因此可以推斷出本實(shí)施例成功制備了β-cd@fe3o4納米材料。

三、fe3o4磁性納米材料的制備

具體過程如下：50ml三口燒瓶中加入20ml蒸餾水，機(jī)械攪拌，通n2除氧約20-30min，然后加入1.08gfecl3·6h2o，0.556gfeso4·7h2o，繼續(xù)攪拌10min(攪拌速度為500r/min)，溶液呈橙紅色，水浴加熱到60℃，緩慢滴加2.5ml濃氨水到上述溶液中，滴加時(shí)間大概為1min，溶液的ph在9-10之間，溶液迅速由橙紅色變?yōu)楹谏?，繼續(xù)攪拌反應(yīng)20min后升高到80℃并停止攪拌，放置20min，將8ml上述溶液移至10ml水熱釜中，將水熱釜置于140℃的烘箱中，水熱反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后，將水熱釜冷卻至室溫，得到亮黑色沉淀。烘干即可得到fe3o4納米粒子。

我們對(duì)上述過程制備得到的fe3o4磁性納米材料進(jìn)行表征，具體稱取約2mg的fe3o4樣品進(jìn)行研磨，以kbr為背景，通過紅外光譜儀對(duì)該化合物進(jìn)行紅外光譜的掃描，得到的紅外光譜圖具體圖圖4所示。

通過圖4可以看出fe3o4的fe-o的特征吸收峰呈現(xiàn)在580cm^-1處，可以看出fe3o4的fe-o的特征峰在580cm^-1處；在700cm^-1也可以判斷出不存在亞鐵氧鍵的特征吸收峰，所以不存在氧化鐵物質(zhì)；-oh氫氧鍵伸縮振動(dòng)吸收峰在3320cm^-1處，表明了fe3o4納米粒子的表面羥基。

實(shí)施例1

本實(shí)施例一種利用磁性固相萃取吸附材料富集檢測(cè)喜樹堿的方法，所述磁性固相萃取吸附材料為上述水熱合成法制備的β-cd@fe3o4磁性納米材料；具體富集檢測(cè)過程如下：將20ml的1μg/ml喜樹堿樣品的ph值調(diào)節(jié)至10，倒入裝有20mgfe3o4@β-cd吸附材料的錐形瓶中，恒溫水浴振蕩20min。振蕩完畢后取出錐形瓶，用磁鐵分離吸附劑后將上清液除去，加入5ml洗脫液1mol/lnh3·h2o振蕩10min，完畢后取出，用磁鐵分離吸附劑，收集上清液，采用紫外分光光度法在366nm下檢測(cè)解吸液的吸光強(qiáng)度，重復(fù)3次，取平均值。

對(duì)比例1

本對(duì)比例一種利用磁性固相萃取吸附材料富集檢測(cè)喜樹堿的方法，所述磁性固相萃取吸附材料為上述制備的fe3o4磁性納米材料；具體富集檢測(cè)過程和實(shí)施例1相同。

對(duì)比例2

本對(duì)比例一種檢測(cè)喜樹堿的方法，直接對(duì)20ml的1μg/ml喜樹堿樣品采用紫外分光光度法在366nm下測(cè)定其吸光強(qiáng)度。

對(duì)比例3

本對(duì)比例一種利用磁性固相萃取吸附材料富集檢測(cè)喜樹堿的方法，具體富集檢測(cè)過程和實(shí)施例1相同，不同之處僅在于，洗脫劑選擇5ml的2mol/lnah2po4。

對(duì)比例4

本對(duì)比例一種利用磁性固相萃取吸附材料富集檢測(cè)喜樹堿的方法，具體富集檢測(cè)過程和實(shí)施例1相同，不同之處僅在于，洗脫劑選擇5ml的甲醇：水＝6：4(v/v)。

對(duì)比例5

本對(duì)比例一種利用磁性固相萃取吸附材料富集檢測(cè)喜樹堿的方法，具體富集檢測(cè)過程和實(shí)施例1相同，不同之處僅在于，洗脫劑選擇5ml的乙腈：水＝6：4(v/v)。

對(duì)比例6

本對(duì)比例一種利用磁性固相萃取吸附材料富集檢測(cè)喜樹堿的方法，具體富集檢測(cè)過程和實(shí)施例1相同，不同之處僅在于，將20ml的1μg/ml喜樹堿樣品的ph值調(diào)節(jié)至11。

對(duì)比例7

本對(duì)比例一種利用磁性固相萃取吸附材料富集檢測(cè)喜樹堿的方法，具體富集檢測(cè)過程和實(shí)施例1相同，不同之處僅在于，將20ml的1μg/ml喜樹堿樣品的ph值調(diào)節(jié)至7。

對(duì)比例8

本對(duì)比例一種利用磁性固相萃取吸附材料富集檢測(cè)喜樹堿的方法，具體富集檢測(cè)過程和實(shí)施例1相同，不同之處僅在于，將20ml的1μg/ml喜樹堿樣品的ph值調(diào)節(jié)至6。

實(shí)施例1使用β-cd@fe3o4磁性納米材料的富集性能與對(duì)比例1的fe3o4磁性納米材料fe3o4磁性納米材料和對(duì)比例2直接紫外測(cè)試喜樹堿樣品的檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，由圖5可以看出，經(jīng)β-cd@fe3o4磁性納米材料富集后的吸光度明顯高于其他兩種分析方法，這是由于β-cd@fe3o4納米材料與喜樹堿之間存在弱的主客體相互作用，一定程度上提高了喜樹堿的富集能力，富集更為完全，檢測(cè)結(jié)果更為精確。表明β-cd@fe3o4磁性納米材料對(duì)喜樹堿有更高的富集性能。

進(jìn)一步地，實(shí)施例1、以及對(duì)比例3-5分別選用了不同的洗脫劑，他們對(duì)喜樹堿樣品的檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，由圖6可以明顯看出，用1mol/lnh3·h2o作洗脫液時(shí)，吸光度值最大，說明nh3·h2o對(duì)喜樹堿的洗脫效果更好，可以最大限度地將吸附在吸附劑的喜樹堿洗脫到溶液中。其原因可能是因?yàn)閚h3·h2o是一種堿性物質(zhì)，可以破壞喜樹堿與β-cd的主客體分子間作用力，從而達(dá)到洗脫的目的。

進(jìn)一步地，實(shí)施例1中喜樹堿樣品的ph值是10，對(duì)比例6中喜樹堿樣品的ph值是11，對(duì)比例7中喜樹堿樣品的ph值是7，對(duì)比例8中喜樹堿樣品的ph值是6，其他條件均相同。他們對(duì)喜樹堿樣品的檢測(cè)結(jié)果可知，當(dāng)喜樹堿樣品溶液的ph為10時(shí)，喜樹堿對(duì)于富集和萃取的性能優(yōu)化效果最好，達(dá)99％左右；當(dāng)喜樹堿樣品溶液的ph為11時(shí)，為60.7％；當(dāng)喜樹堿樣品溶液的ph為7時(shí)，為68.2％；當(dāng)喜樹堿樣品溶液的ph為6時(shí)，為40％；可見堿性條件下其富集效果較佳，其中以ph為10為高，而酸性條件下富集效果差；這是由于喜樹堿在ph小于4.5時(shí)，分子結(jié)構(gòu)以內(nèi)酯環(huán)形式存在；ph大于7.4時(shí)，分子結(jié)構(gòu)以開環(huán)羧酸鹽形式存在；在堿性條件下，其開環(huán)結(jié)構(gòu)使得其更容易被吸附劑吸附，從而富集效果更佳。

進(jìn)一步地，我們對(duì)實(shí)施例1提供的方法進(jìn)行準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)，檢出限和定量限分別以信噪比s/n的3倍和10倍計(jì)算，測(cè)得結(jié)果分別為0.041μg/ml和0.137μg/ml，精密度8.7％。表明該方法準(zhǔn)確、可靠，適用于喜樹堿的檢測(cè)。

以上所述實(shí)施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實(shí)施例，其保護(hù)范圍不限于此。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。