F中的50mg/mL儲備溶液，儲存于-20°C下）。如通過TLC測量，反應(yīng)在2分鐘內(nèi)完成。反應(yīng) 產(chǎn)物在不加熱的情況下在真空離心蒸發(fā)濃縮器Speed-Vac中經(jīng)受離心過夜。殘余物溶解于 l-1.4mLDMF中且以 6-7份注射到HPLC柱（在 6mL/min下運(yùn)行的VydacC18柱（218TP1022， 22X250mm))上。所述柱使用含25%甲醇的水的溶劑A和含20%甲醇的乙腈的溶劑B，以 經(jīng)30分鐘的35% -100%B，隨后持續(xù)30分鐘保持在100%B處的梯度運(yùn)行。產(chǎn)物通過UV 在213nm處檢測。從所有HPLC運(yùn)行收集產(chǎn)物洗脫份，且在離心濃縮器（Speed-Vac，油栗真 空，室溫）中去除溶劑，得到接近定量產(chǎn)率的化合物1的所需產(chǎn)物
[0122]
[0123] 所得化合物1通過NMR分析以證實(shí)身份。結(jié)果展示于圖1A中。所得化合物的觀 測分子量為545. 3948。以上方法類似地用于通過以具有改變烷基鏈長度的戊?；?NHS酯 取代戊?；?NHS酯合成其它化合物。
[0124] 根據(jù)式II合成的其它化合物呈現(xiàn)于表1中：
[0125] 表1:錯誤！鏈接無效。
[0126] 通過將R2烷基鏈長度從14個到20個碳地改變來重復(fù)以上方法以合成以10組列 出的化合物11-80,每一R2烷基鏈長分別如表1中所列。通過NMR分析獲得由此制備的化 合物的身份和結(jié)構(gòu)的認(rèn)證。
[0127] 作為另一實(shí)例，實(shí)質(zhì)上如流程II中所描繪地合成化合物7 :
[0129] 化合物7
[0130] 簡單來說，100mg半乳糖基-神經(jīng)鞘胺醇（阿萬蒂極性脂質(zhì)公司，阿拉巴馬州阿拉 巴斯特）溶解于3. 3mLTHF+0. 56mL水中。向此溶液中添加1. 5當(dāng)量庚?；?NHS酯。用二 異丙基乙胺將混合物的pH調(diào)節(jié)到8. 5-9. 0 (在水浸濕的pH紙上點(diǎn)樣）。如通過TLC測量， 反應(yīng)幾乎在2小時內(nèi)完成。為了迫使反應(yīng)完成，再添加0. 75當(dāng)量的庚?；?NHS酯，如上地 調(diào)節(jié)pH，且在室溫下攪拌混合物總共3-4小時。反應(yīng)產(chǎn)物在不加熱的情況下在真空離心蒸 發(fā)濃縮器Speed-Vac中經(jīng)受離心過夜。干燥的滯留物溶解于1. 4mLDMF中且將0. 2mL部分 注射到如上的HPLC柱上。從所有HPLC運(yùn)行收集產(chǎn)物洗脫份，且在離心濃縮器（Speed-Vac， 油栗真空，室溫）中去除溶劑，得到81%產(chǎn)率的所需產(chǎn)物?；衔锖铣赏ㄟ^如圖1B中所示 的NMR確認(rèn)。
[0131] 實(shí)例2:制備內(nèi)標(biāo)
[0132]內(nèi)標(biāo)通過與實(shí)例1的方法類似的方法制得，但從不結(jié)合到糖部分的神經(jīng)鞘胺醇開 始，實(shí)質(zhì)上如流程III中所示。
[0134]流程III
[0135] 簡單來說，可商購的神經(jīng)鞘胺醇（阿萬蒂極性脂質(zhì)，阿拉巴馬州阿拉巴斯特）和適 當(dāng)?shù)闹舅岬腘HS酯如同實(shí)例1中地反應(yīng)。使用的示例性NHS酯為：戊酰基-NHS酯、庚酰 基-NHS酯、戊?；?NHS酯（各自具有或不具有Η到D取代）。內(nèi)標(biāo)通過HPLC如上地純化 且以20% -90 %的產(chǎn)率獲得。
[0136]
123456 所得示例性化合物81通過NMR進(jìn)行分析以證實(shí)所得分子量為424的合成。流程 II的方法類似地用于合成在神經(jīng)鞘胺醇或NHS酯前體中包括Η到D取代的其它標(biāo)記內(nèi)標(biāo)。 根據(jù)式V合成的其它示例性化合物呈現(xiàn)于表2中。 2 表2:錯誤！鏈接無效。 3 *表示NHS脂肪酸包括Η到D取代。 4 **表示神經(jīng)鞘胺醇包括末端Η到D取代。 5 實(shí)例3:檢測樣品中的酶活性. 6 化合物1和7的底物分別用于檢測酸性β-葡糖腦苷脂酶（ABG)和半乳糖腦苷 脂-β_半乳糖苷酶（GALC)的存在。通過從同意的成年人靜脈穿刺且在濾紙上涂抹獲得血 液。對于每一樣品，3mm直徑的盤從干血區(qū)域沖壓到96孔微量滴定板的孔中。血盤隨后直 接用含有500μmol/L的最終濃度的底物和10μmol/L的最終濃度的對應(yīng)內(nèi)標(biāo)的檢定溶液 培育。也向檢定溶液中添加具有?；悄懰徕c的0. 5mol/L的最終濃度的乙酸鈉緩沖液。含 有血盤的分析混合物在37°C下在回旋式震蕩（150rpm)的情況下在恒溫空氣震蕩器中培育 15到24小時。在培育期之后，純甲醇的等分試樣添加到每一試管或孔中以終止酶促反應(yīng)。 在進(jìn)入質(zhì)譜儀之前，培育的反應(yīng)混合物用純甲醇稀釋。對于質(zhì)譜分析，電噴霧源以正離子模 式操作，且離子以母離子掃描模式檢測。酶促產(chǎn)物的量計(jì)算自產(chǎn)物與內(nèi)標(biāo)的離子豐度比減 去空白的所述比。
[0143]圖6說明使用化合物1作為ABG底物相對于先前使用的底物出乎意料地提高的結(jié) 果，其說明相比于C5酰胺基取代C12酰胺基的類似化合物的產(chǎn)物檢測中的2倍提高。對GALC 呈陽性的樣品展示具有分子量264. 27的陽離子。對應(yīng)內(nèi)標(biāo)產(chǎn)生具有分子量271. 31的陽離 子。
[0144] 實(shí)例4 :同時檢測樣品中的多種酶活性.
[0145] 同時使用化合物1和7的底物以分別檢測酸性β-葡糖腦苷脂酶（ABG)和半乳糖 腦苷脂-β-半乳糖苷酶（GALC)的存在。通過從同意的成年人靜脈穿刺且在濾紙上涂抹獲 得血液。對于每一樣品，3mm直徑的盤從干血區(qū)域沖壓到96孔微量滴定板的孔中。血盤隨 后直接用含有100μmol/L的最終濃度的底物和1μmol/L的最終濃度的對應(yīng)內(nèi)標(biāo)的檢定 溶液培育。也向檢定溶液中添加具有?；悄懰徕c的〇. 5mol/L的最終濃度的乙酸鈉緩沖液 (30以1最終檢定體積）。含有血盤的分析混合物在37<€下在回旋式震蕩（150印111)的情況 下在恒溫空氣震蕩器中培育15到24小時。在培育期之后，100μ1等分試樣的50 : 50甲 醇/7酸乙酯添加到每一套管或孔以終止酶促反應(yīng)。反應(yīng)物隨后補(bǔ)充有400μ1HPLC級乙 酸乙酯和200μ1水。反應(yīng)物經(jīng)離心且所得液體頂層轉(zhuǎn)移到新檢定板且在氮?dú)庀抡舭l(fā)。具 有0. 1 %甲酸的83% 7腈/17%水的分析緩沖液添加到檢定板且樣品通過MS/MS經(jīng)受分析 以檢測酶促產(chǎn)物和內(nèi)標(biāo)。對于質(zhì)譜分析，電噴霧源以正離子模式操作，且離子以母離子掃描 模式檢測。酶促產(chǎn)物的量計(jì)算自產(chǎn)物與內(nèi)標(biāo)的離子豐度比減去空白的所述比。實(shí)現(xiàn)ABG和 GALC兩者的檢測。
[0146] 實(shí)例5 :在替代實(shí)施例中，與式I的底物的反應(yīng)產(chǎn)物通過免疫檢定定量。點(diǎn)樣于濾 紙上的血液在緩沖液中復(fù)水以釋放活性組分。一個或一陣列底物添加到反應(yīng)室且使反應(yīng)進(jìn) 行過夜（約14小時）。通過添加6 X體積甘氨酸/NaOH pH 10. 4使反應(yīng)淬滅。每一反應(yīng)的 樣品添加到高結(jié)合照射微量滴定板的孔中且培育過夜以允許反應(yīng)產(chǎn)物與板的孔的充分結(jié) 合。類似緩沖液/樣品中的產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線也添加到板以充當(dāng)定量基礎(chǔ)。在完全結(jié)合到板 表面之后，通過使用噴射瓶、板洗滌器或任何其它自動化或非自動化板洗滌系統(tǒng)用磷酸鹽 緩沖鹽水（PBS)洗滌孔兩次。蛋白質(zhì)結(jié)合的任何其它位點(diǎn)隨后通過添加阻斷劑阻斷，所述 阻斷劑說明性地包括含3%牛血清白蛋白的PBS或所屬領(lǐng)域中已知的任何其它合成或天然 阻斷劑。阻斷劑在室溫下培育兩小時?？子肞BS洗滌3X。一級抗體隨后添加到孔以識別 和結(jié)合剩余的底物，或產(chǎn)物?？贵w在孔中培育至少2小時。板洗滌四次以去除非結(jié)合抗體。 如果一級抗體經(jīng)標(biāo)記，那么板用于檢測。任選地，經(jīng)標(biāo)記的二級抗體置于板孔中且允許再培 育2小時，接著洗滌4次且通過適當(dāng)方法檢測，如通過熒光或光學(xué)讀板儀。
[0147]實(shí)例6:在替代實(shí)施例中，與式III的底物的反應(yīng)產(chǎn)物通過免疫檢定定量。點(diǎn)樣于 濾紙上的血液在緩沖液中復(fù)水以釋放活性組分。一種或一陣列固定到編碼粒子的底物添加 到反應(yīng)室，優(yōu)選地微量板孔，且使反應(yīng)進(jìn)行過夜（約14小時）。也添加類似緩沖液/樣品中 的酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線以分離編碼粒子組以充當(dāng)定量基礎(chǔ)。通過添加6X體積甘氨酸/NaOH pH 10. 4使反應(yīng)淬滅。一級抗體隨后添加到孔中以識別和結(jié)合剩余的底物，或產(chǎn)物?？贵w培育 至少30分鐘。如果一級抗體經(jīng)標(biāo)記，那么檢定準(zhǔn)備好用于檢測。任選地，經(jīng)標(biāo)記的二級抗 體置于板孔中且允許再培育30分鐘。檢測通過流式細(xì)胞儀實(shí)現(xiàn)。
[0148] 實(shí)例7 :式I的示例性實(shí)施例的B2或式II或III的R1或R2基團(tuán)上的活性末端氨基 能夠經(jīng)受許多標(biāo)記程序。在代表性實(shí)例中，末端胺特定地標(biāo)記有氟異硫氰酸酯（FITC)。底 物的衍生化通過添加FITC分子到B2基團(tuán)的末端胺進(jìn)行。類似修飾可以在不在末端碳（如 果存在）上的胺基上進(jìn)行。純化/凍干的底物以5mg/mL的濃度再懸浮于0. 1M碳酸氫鈉緩 沖液，pH9. 0中。緊鄰著與底物的反應(yīng)之前，在暗處在0. 5mlDMS0中溶解5mgFITC染料。 在平緩渦旋的情況下，添加〇.lml底物溶液的染料溶液且在室溫下在暗處培育1小時。游 離未反應(yīng)的染料通過在磷酸鹽緩沖鹽水中預(yù)平衡的10X300mmSephadexG管柱上的凝膠 過濾去除。最終產(chǎn)物的濃度通過質(zhì)譜或所屬領(lǐng)域中已知的其它方法測定。標(biāo)記的底物任選 地經(jīng)濃縮和等分以儲存在-20 °C下直到進(jìn)一步使用。
[0149] 標(biāo)記的底物用于反應(yīng)中以檢測葡糖腦苷脂酶活性和檢測戈謝病。對于每一患者 或?qū)φ諛悠罚?mm直徑的盤從濾紙上的干血區(qū)域沖壓到微量離心管或96孔微量滴定板的孔 中。血盤隨后直接用含有5ymol/L的最終濃度的標(biāo)記底物和0· 1ymol/L的最終濃度的 對應(yīng)內(nèi)標(biāo)的檢定溶液培育。含有血盤的分析混合物在37°C下在回旋式震蕩（150rpm)的情 況下在恒溫空氣震蕩器中培育15到24小時。在培育期之后，純甲醇的等分試樣添加到每 一試管或孔中以終止酶促反應(yīng)。反應(yīng)的樣品添加到含有HPLC移動相（甲醇：水：乙酸， 82 : 18 : 0.lvol/vol/vol)的第二試管。淬滅反應(yīng)溶液的20μ1等分試樣使用甲醇：水： 乙酸，82 : 18 :O.lvol/vol/vol作為移動相以1.3ml/min的速率等度分離于4·6Χ250_ 對稱性C1S反相HPLC柱（馬薩諸塞州米爾福德的沃特斯（Waters，Milford，ΜΑ))上。熒光 強(qiáng)度使用熒光檢測器（型號L-7480 ;伊利諾伊州內(nèi)珀維爾的日立（Hitachi，Naperville， IL))在中等增益靈敏度下連續(xù)監(jiān)測。樣品中標(biāo)記產(chǎn)物的量通過比較由已知濃度下的標(biāo)記產(chǎn) 物組成的峰面積與外標(biāo)面積確定。反應(yīng)中的產(chǎn)物濃度易于確定且葡糖腦苷脂酶的活性通過 除以每單位反應(yīng)時間的摩爾產(chǎn)物確定。
[0150] 本說明書中提及的任何專利或公開案表明本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的水準(zhǔn)。這 些專利和公開案以引用方式并入，其程度如同每一個別公開案專門且單獨(dú)指定為以引用方 式完全并入。
[0151] 所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將易于理解本發(fā)明非常適合于實(shí)施所述目標(biāo)和獲得提到的 目的和優(yōu)勢，以及其中固有的那些。本文所述的本發(fā)明實(shí)例連同方法、程序、處理、分子和特 定化合物當(dāng)前代表特定實(shí)施例、為示例性的且不打算作為對本發(fā)明的范圍的限制。將顯而 易見的是存在其它實(shí)施例且其包含在如由權(quán)利要求書的范圍界定的本發(fā)明的精神內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于酶的分析的底物，其具有下式：其中A為通過糖巧鍵連接到0的單糖或二糖； B1選自由W下組成的群組：Ci-C2。烷基；含雜原子的C1-C2。烷基、C2-C2。締基；含雜原子 的C2-C2。締基、經(jīng)取代或未經(jīng)取代Ce-Cw芳基； B2選自由W下組成的群組：C2-C7酷胺基；C2-C7氨基甲酸醋；C2-C7醋、C2-C7脈基；C2-C7氨甲酯基；C2-C7幾基；C1-C,烷基；含雜原子的C1-C,烷基；具有N、0或S的取代基的C1-C, 烷基；C2-C7締基；含雜原子的C2-C,締基；具有N、0或S的取代基的C2-C,締基；且 B3選自由W下組成的群組：具有N、0或S的取代基的Ci-Cw烷基；C1-C2。烷基、含雜原 子的C1-C2。烷基；C4-C2。酸；C1-C2。醋；C1-C2。締基洽雜原子的C1-C2。締基；具有N、0或S的 取代基的C2-C2。締基；C1-C2。烘基；含雜原子的C1-C2。烘基；具有N、0或S的取代基的C2-C20 烘基Ce-Cz。芳基訊含有N、0或S的雜原子的C6-C2。雜環(huán)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的底物，其中A為醒己糖或酬己糖。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的底物，其中A為D-葡萄糖或D-半乳糖。4. 根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)所述的底物，其中B1為