與溶酶體貯積癥的測試相關(guān)的化合物和方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請的奪叉引用
[0002] 本申請取決于2013年3月15如提交的美國臨時申請第61/789, 985號且要求所 述申請的優(yōu)先權(quán)，所述申請的內(nèi)容以全文引用的方式并入本文中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本說明書涉及檢測酶活性以檢測溶酶體酶活性的分析型試劑。
【背景技術(shù)】
[0004] 溶酶體貯積癥為一組遺傳性病癥，其特征為身體中缺乏特定酶，導(dǎo)致身體不能分 解代謝物質(zhì)。舉例來說，法布立?。‵abrydisease)為每40, 000人中見于一人的溶酶體貝士 積癥。其由酶α-半乳糖苷酶的缺乏造成，所述缺乏導(dǎo)致身體不能分解稱作神經(jīng)酰胺三己 糖苷（globotriaosylceramide)的特定脂肪物質(zhì)。第二實例為戈謝病（Gaucherdisease)， 由不能分解稱作葡糖神經(jīng)酰胺（也被稱為葡糖腦苷脂）的脂肪物質(zhì)或脂質(zhì)造成的溶酶體貯 積癥?；加懈曛x病的個體不制造葡糖腦苷脂酶，分解這些脂肪物質(zhì)所需的酶。這些脂肪物 質(zhì)隨后積聚在肝、脾和骨髓細(xì)胞中。第三實例為蓬佩病（Pompedisease)，由缺乏分解某些 稱作肝糖的糖所需的酶酸性α-葡糖苷酶造成的溶酶體貯積癥。當(dāng)酶酸性α-葡糖苷酶缺 失時，肝糖積聚在身體中的各種組織和器官中。
[0005] 溶酶體貯積癥主要為兒童病癥，盡管一些顯現(xiàn)在成人期。在大部分所述病癥中，患 者在出生時正常且在一些時間以后開始具有進(jìn)展性神經(jīng)惡化。臨床表現(xiàn)型取決于生化缺陷 的類型和嚴(yán)重程度。這些溶酶體病癥中的一些，如蓬佩病和克拉培病主要顯現(xiàn)于嬰兒期。已 持續(xù)努力開發(fā)在臨床癥狀發(fā)作之前檢測此類病癥以使得可以起始治療性干預(yù)的方法。
[0006] 在過去的十年里，測試代謝病癥的實驗室已將串聯(lián)質(zhì)譜引入到其新生兒篩選程序 中。串聯(lián)質(zhì)譜持續(xù)在診所中受到歡迎，因為此技術(shù)允許在單一樣品中檢定多種代謝物。舉例 來說，此技術(shù)已實施為使用干燥血點樣品檢測新生兒中的遺傳代謝病癥的常規(guī)臨床實踐。 盡管溶酶體酶活性可以使用串聯(lián)質(zhì)譜定量，但由于可溶性問題和并入外標(biāo)的需要，公布的 檢定方法已略微難以適應(yīng)臨床配置。
[0007] 因此，仍需要用于檢測溶酶體病癥的改進(jìn)的方法和組合物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 提供以下發(fā)明概述以促進(jìn)對本發(fā)明特有的創(chuàng)新性特征中的一些的理解且不打算 為完整描述。本發(fā)明的各種方面的完整理解可以通過將整個說明書、權(quán)利要求書、附圖和摘 要作為整體來獲得。
[0009] 提供使用如質(zhì)譜的檢測系統(tǒng)檢測酶促反應(yīng)的改進(jìn)的組合物和方法。這些組合物 提供在水性溶劑系統(tǒng)中的提尚的可溶性和/或與目標(biāo)酶的提尚的反應(yīng)性，進(jìn)而提尚檢定效 率、再現(xiàn)性和精確性。
[0010] 本發(fā)明提供適用于評估樣品中的溶酶體酶活性水平的化合物。測試溶酶體酶活性 例如在新生兒中篩選代謝病癥時以及在評估具有影響酶活性的醫(yī)學(xué)病況的個體或經(jīng)歷如 替代療法、基因療法或骨髓移植的醫(yī)學(xué)治療的個體時適用。本文所述的化合物包括用于目 標(biāo)酶的底物和適用作酶檢定中的對照物或標(biāo)準(zhǔn)物的相關(guān)分子。
[0011] 本發(fā)明的一個目標(biāo)為提供適合于檢測酶，說明性地由于缺乏而導(dǎo)致溶酶體貯積癥 的酶的活性的底物。提供具有以下通式的底物：
[0012]
[0013] 其中A為單糖或二糖；B1為：C「C2。烷基；含雜原子的C「C2。烷基、C2-Cjf基；含 雜原子的C2-C2。烯基、經(jīng)取代或未經(jīng)取代C6-C2。芳基；B2為：C2-C7氨基甲酸酯；(：2-(：7酰胺 基、C2-C7酯、C2-C7脲基；C2-C7氨甲酰基；C2-C7羰基；C「C7烷基；含雜原子的C「C7烷基；具 有N、0或S的取代基的烷基；C2-C7烯基；含雜原子的C2-C7烯基；具有N、0或S的取 代基的C2-C7烯基；且B3為：C「C2。烷基、含雜原子的C「C2。烷基；具有N、0或S的取代基的 C「C2。烷基；C4-C2。醚；C「C2。酯；C「C2。烯基；含雜原子的C「C2。烯基；具有N、0或S的取代 基的C2-C2。烯基；C「(：2。炔基；含雜原子的CiC2。炔基；具有N、0或S的取代基的C2-C2。炔基 C6_C2。芳基；和含有N、0或S的雜原子的C6-C2。雜環(huán)。N、0或S的取代基獨立地、任選地為 羥基、氨基、硫醇、醚、硫醚或仲胺。在一些實施例中，A為醛己糖或酮己糖，任選地通過和α 或β糖苷鍵連接到分子的其余部分。任選地，Α為D-葡萄糖或D-半乳糖。Β1部分任選地 為亞甲基或C2烷基。B2部分任選地為C2-C7_胺基。B3部分任選地為具有N、0或S的取 代基的C2-C2。烯基。在一些實施例中，底物包括為D-葡萄糖或D-半乳糖的A、為亞甲基的 B1、SC2-C7_胺基的B1和為具有以羥基形式存在的0的取代基的C13-Cjf基的B3。
[0014] 還提供通式II的化合物
123 其類似地適用作檢測溶酶體貯積癥的底物。根據(jù)式II，A為醛己糖或酮己糖；R1為 C「C6烷基或C2-Cjt基；且R2為C「C2。烷基、具有N、0或S的取代基的C「C2。烷基、CiC2。 烯基或具有N、0或S的取代基的。烯基。應(yīng)了解，R1或R2可以是任選地含有N、0或S 的取代，或N、0或S的取代基的。炔基。在一些實施例中，式II的底物包括D-葡萄糖 或D-半乳糖形式的A、C4-C6烷基形式的R1和為C13-C2。烷基的R2、具有N、0或S的取代基的 C13_C2。烷基、C13-C2。烯基或具有N、0或S的取代基的C13-C2。烯基。任選地，R2為C13烷基。 2 還提供適合于檢測溶酶體貯積癥存在或不存在或僅檢測包括式III結(jié)構(gòu)的酶存 在或不存在的底物： 3
[0018] 其中A為單糖或二糖；B1為：CfC2。烷基；含雜原子的C「C2。烷基、C2_C2。烯基；含 雜原子的C2-C2。烯基；和經(jīng)取代或未經(jīng)取代C6-C2。芳基；R1'為經(jīng)取代或未經(jīng)取代C或N;R2'為經(jīng)取代或未經(jīng)取代C、經(jīng)取代或未經(jīng)取代N、0或S;R~為經(jīng)取代或未經(jīng)取代C、N或 0 ;R~不存在、為經(jīng)取代或未經(jīng)取代Q-CpO或S為：C 烷基；含雜原子的Ci-C7烷基； 具有N、0或S的取代基的烷基；C2-C7烯基；含雜原子的C2-C7烯基；具有N、0或S的 取代基的(：2-(：7烯基；R~不存在、為經(jīng)取代或未經(jīng)取代(^-(：2;0或S;且R~為。烷基、 含雜原子的。烷基；具有N、0或S的取代基的C「C2。烷基；C4-C2。醚；C「C2。酯；C「(：2。烯 基；含雜原子的。烯基；具有N、0或S的取代基的C2-C2。烯基；C6-C2。芳基；和含有N、0 或S的雜原子的C6-C2。雜環(huán)。A任選地為醛己糖或酮己糖，任選地通過和α或β糖苷鍵連 接到分子的其余部分。任選地，Α為D-葡萄糖或D-半乳糖。在一些實施例中，根據(jù)式III 的底物為：
[0019] f其中為經(jīng)取代或未經(jīng)取代C或經(jīng)取代或未經(jīng)取代N; 、?
[0020]
[0021]
中R2"為Η或甲基且R2"'為Η或甲基；或
[0022；
其中R3'為經(jīng)取代或未經(jīng)取代C;且
[0023] W不存在、為經(jīng)取代或未經(jīng)取代(^-(：2、0或S。
[0024] 應(yīng)了解，在以上或另外包括本發(fā)明的底物的各者中的任一個中，A任選地為醛己糖 或酮己糖，任選地通過和α或β糖苷鍵連接到分子的其余部分。任選地，A為D-葡萄糖 或D-半乳糖。
[0025] 在一些實施例中，根據(jù)式III的底物包括：
[0026]
?中^為經(jīng)取代或未經(jīng)取代C或經(jīng)取代或未經(jīng)取代N;且 為CfC2。烷基、含雜原子的C廠(：2。烷基；具有N、0或S的取代基的C廠(：2。烷基；C4-C2。醚； 。酯；Ci-C2。烯基；含雜原子的C「C2。烯基；具有N、0或S的取代基的C2-C2。烯基；C6-C2。 芳基；和含有N、0或S的雜原子的C6-C2。雜環(huán)；
[0027]其中為經(jīng)取代或未經(jīng)取代C或經(jīng)取代或未經(jīng)取代
? N;R2為C13-C2。烷基、含雜原子的C13-C2。烷基、具有N、0或S的取代基的C13-C2。烷基；C13-C2。 烯基、含雜原子的C13-C2。烯基；或具有N、0或S的取代基的C13-C2。烯基；或
[0028]
中R2為c13-c2。烷基、含雜原子的C13-c2。烷基、具有 N、0或S的取代基的C13-C2。烷基；C13-C2。烯基、含雜原子的C13-C2。烯基；或具有N、0或S的 取代基的C13-C2。烯基。在以上或另外包括本發(fā)明的底物的各者中的任一個中，A任選地為 醛己糖或酮己糖，任選地通過和0或β糖苷鍵連接到分子的其余部分。任選地，A為D-葡 萄糖或D-半乳糖。
[0029] 還提供包括以下的底物：
[0030]
其中η為0、1、2、3、4或5。A任選地為醛己 糖或酮己糖，任選地通過和α或β糖苷鍵連接到分子的其余部分。任選地，A為D-葡萄 糖或D-半乳糖。
[0031] 本發(fā)明的底物中的任一個任選地包括元素或其它標(biāo)簽的穩(wěn)定次普遍同位素。在一 些實施例中，穩(wěn)定次普遍同位素在每次出現(xiàn)時選自由以下組成的群組： 2h、13c、15n、17o、1so、 31P或 34S。
[0032] 本發(fā)明的另一目標(biāo)為提供可以具有酶功能的抑制劑、用于檢測酶活性的方法的內(nèi) 標(biāo)或治療劑形式使用的分子。此類分子任選地包括式V結(jié)構(gòu)：
[0033]
[0034] 其中B1選自由以下組成的群組。烷基；含雜原子的C「C2。烷基、C2_C2。烯基； 含雜原子的C2_C2。烯基、經(jīng)取代或未經(jīng)取代C6_C2。芳基；B2選自由以下組成的群組：(：2_(：7氨 基甲酸酯；c2-c7酰胺基、c2-c7酯、c2-c7脲基；c2-c7氨甲?；?；c2-c7羰基；CfC7烷基；含雜原 子的Ci-Q烷基；具有N、0或S的取代基的Ci-C7烷基；C2-C7烯基；含雜原子的C2-C7烯基； 具有N、0或S的取代基的c2-c7烯基；且B3選自由以下組成的群組：C「C2。烷基、含雜原子 的C「C2。烷基；具有N、0或S的取代基的C「C2。烷基；C4-C2。醚；C「C2。酯；C「C2。烯基；含雜 原子的。烯基；具有N、0或S的取代基的C2-C2。烯基；C「C2。炔基；含雜原子的C「(：2。炔 基；具有N、0或S的取代基的C2-C2。炔基C6-C2。芳基；和含有N、0或S的雜原子的C6-(：2。雜 環(huán)。在一些實施例中，B1為亞甲基。任選地，B2*C2-C7_胺基。任選地，B3為具有N、0或 S的取代基的C2-Cjf基。在一些實施例中，B1為亞甲基，B2為C2-C7酰胺基，且B3為具有 以羥基形式存在的〇的取代基的C13-C2。烯基。
[0035] 本發(fā)明的分子中的任一個任選地包括元素或其它標(biāo)簽的穩(wěn)定次普遍同位素。在一 些實施例中，穩(wěn)定次普遍同位素在每次出現(xiàn)時選自由以下組成的群組： 2H、13C、15N、170、1S0、 31P或 34S。
[0036] 還提供檢測酶的存在、不存在或含量以檢測受試者中存在或不存在酶缺乏的方 法。酶任選地為所述酶的缺乏導(dǎo)致溶酶體貯積癥的酶。在檢測酶的存在、不存在或含量的 方法中使用式I-VI的組合物允許來自水性溶劑系統(tǒng)中的酶的提高的可溶性的檢定結(jié)果的 提高的可信度。檢測酶活性的方法包括在其中目標(biāo)酶能夠作用于底物以產(chǎn)生酶促產(chǎn)物的條 件下接觸含有目標(biāo)酶的樣品與任一本文所述的底物或其等效物；和檢測酶促產(chǎn)物。任選地， 所述目標(biāo)酶為酸性β-葡糖腦苷脂酶且所述底物具有式I，其中所述B2為C2-C7酰胺基，且 B3為具有N、0或S的取代基的C2-C2。烯基。任選地，目標(biāo)酶為酸性半乳糖腦苷脂β-半乳 糖苷酶或酸性β-葡糖腦苷脂酶且所述其中Β2為C2-C7酰胺基，且Β3為具有以羥基形式存 在的〇的取代基的c13-c2。。
[0037] 任選地，用于檢測酶活性的方法中的底物為以下中的任何一個或多個的底物：化 合物1至80,任選地1或7,或其任何組合。任選地，方法包括在接觸步驟期間或之后添加 內(nèi)標(biāo)到反應(yīng)溶液中。此類內(nèi)標(biāo)任選地為任何組合物81-86的標(biāo)準(zhǔn)物。
[0038] 檢測步驟任選地通過質(zhì)譜，任選地通過多反應(yīng)監(jiān)測，如在MS/MS中。檢測步