一種與乳腺癌相關(guān)的血清微小核糖核酸標(biāo)志物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程及腫瘤學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種與乳腺癌相關(guān)的血清微小核糖核酸標(biāo)志物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]乳腺癌是一種世界范圍內(nèi)的普通癌癥，在東亞地區(qū)屬于高發(fā)癌癥。常年以來(lái)，醫(yī)療工作者在乳腺癌的發(fā)病機(jī)理和新的診斷標(biāo)志物和治療目標(biāo)方面做了大量研究，然而在乳腺癌的發(fā)病機(jī)理方面仍沒(méi)有突破進(jìn)展。近年來(lái)，在傳統(tǒng)的癌癥基因和腫瘤抑制基因的研究已經(jīng)拓展到一個(gè)新的種類(lèi)-微小核糖核酸(microRNAs),微小核糖核酸(以下稱(chēng)miRNA)的發(fā)現(xiàn)提供的一種研究治療癌癥的新的契機(jī)。miRNA作為新發(fā)現(xiàn)的基因表達(dá)調(diào)控因子，是一類(lèi)分布廣泛的小的非編碼蛋白質(zhì)的RNA，可抑制靶基因轉(zhuǎn)錄或蛋白翻譯從而沉默靶基因的表達(dá)。近年來(lái)眾多研究表明miRNA在腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用，其主要以干預(yù)miRNA翻譯的方式負(fù)向調(diào)控基因的表達(dá)，參與腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展。研究表明，某些miRNA在不同腫瘤表達(dá)具有特異性，可作為某些腫瘤診斷的標(biāo)志物，從而提高腫瘤的診斷和治療，為人類(lèi)腫瘤治療提供了新的方向和手段。
[0003]目前應(yīng)用于臨床的乳腺疾病診斷方法有10余種,但真正較為成熟或有較好應(yīng)用前景的診斷乳腺癌的手段尚不多，尤其是對(duì)早期臨床癥狀、體征不明顯的患者。而血清miRNA檢測(cè)是一種損傷小、穩(wěn)定性好、靈敏度和特異性更高的方法，為腫瘤的診斷及miRNA在腫瘤中的機(jī)制研究開(kāi)辟了新的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了更好地診斷乳腺癌，本發(fā)明提出了一種新的與乳腺癌相關(guān)的血清微小核糖核酸標(biāo)志物，本發(fā)明還提供了上述血清微小核糖核酸標(biāo)志物在乳腺癌的輔助早期診斷中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明通過(guò)分離和研究乳腺癌患者和與其匹配的健康女性的對(duì)照血清miRNA，尋找一種與乳腺癌高度相關(guān)的高特異性和敏感性的miRNA，并為乳腺癌的篩查和診斷提供數(shù)據(jù)支持。
[0006]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]—種與乳腺癌相關(guān)的血清微小核糖核酸標(biāo)志物，該標(biāo)志物為miR-21。
[0008]上述與乳腺癌相關(guān)的血清微小核糖核酸標(biāo)志物miR-21在乳腺癌的輔助早期診斷中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的臨床資料，并采用Real-timePCR等方法對(duì)血清miRNA:miR-214, miR-21和miR-195進(jìn)行分析。
[0010]具體的實(shí)驗(yàn)方法主要包括以下幾個(gè)部分:
[0011]1、標(biāo)本的準(zhǔn)備:選取乳腺外科的女性乳腺癌病人血清以及同期年齡匹配的正常女性體檢的血清，標(biāo)本離體后，保存于-80°C冰箱備用。所有病例均確診為乳腺癌，臨床資料完整，均未接受放化療。
[0012]2、總 RNA 的提取:用 mirVana?PARIS?Kit (Life Tech)提取細(xì)胞總 RNA，具體步驟參照說(shuō)明書(shū)操作，分別提取乳腺癌病例及正常女性血清中的總RNA。
[0013]3、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈:逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程按照所購(gòu)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
[0014]4、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR):熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)體系使用了目的miRNA和內(nèi)參miRNA以及qPCR試劑盒。PCR程序?yàn)?5°C，1min ;95°C，15s ;60°C退火延生，共40個(gè)循環(huán)。
[0015]5、采用SPSS21.0分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示。血清miRNA的表達(dá)量在乳腺癌組和對(duì)照組中的比較，miRNA的表達(dá)量和乳腺癌患者的臨床病理特征的關(guān)系均用兩個(gè)獨(dú)立樣本的Mann-Whitney U檢驗(yàn)。利用ROC曲線來(lái)確認(rèn)miR-21鑒別乳腺癌患者及健康者的診斷價(jià)值。P〈0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0016]優(yōu)選的:所述熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)體系中的內(nèi)參miRNA為miR_16。
[0017]優(yōu)選的:所述熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)在ABI PRISM7500Real-time系統(tǒng)上完成。
[0018]優(yōu)選的:用2_act的方法來(lái)分析中乳腺癌患者和健康人血清中miRNA的表達(dá)量。
[0019]通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)及分析篩選出在乳腺癌病例和健康女性對(duì)照中表達(dá)量差異程度大的一種血清miRNA，作為輔助乳腺癌診斷的指標(biāo)。最后篩選出的與乳腺癌發(fā)病有關(guān)的血清miRNA為miR-21，其可以為乳腺癌的篩查和診斷提供數(shù)據(jù)支持。
【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1是本發(fā)明提出的一種與乳腺癌相關(guān)的血清微小核糖核酸標(biāo)志物miR-21和血清微小核糖核酸標(biāo)志物miR-214、miR-195在乳腺癌患者及健康人血清中的表達(dá)。
[0021]圖2是本發(fā)明提出的一種與乳腺癌相關(guān)的血清微小核糖核酸標(biāo)志物miR-21的ROC曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面，通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0023]采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的臨床資料，并采用Real-time PCR等方法對(duì)血清微小核糖核酸miR-214，miR-21和miR-195進(jìn)行分析。
[0024]具體的實(shí)驗(yàn)方法主要包括以下幾個(gè)部分:
[0025]1、標(biāo)本的準(zhǔn)備:選取乳腺外科的女性乳腺癌病人血清40例以及同期年齡匹配的正常女性體檢的血清10例，標(biāo)本離體后，保存于-80°C冰箱備用。所有病例均確診為乳腺癌，臨床資料完整，均未接受放化療。
[0026]2、總RNA的提取:-80 °C保存的血清室溫中充分溶解，抽吸混勻。用mirVana?PARIS?Kit (Life Tech)提取細(xì)胞總RNA。取625 μ I體積的血漿到無(wú)RNase EP 管加等體積的 2Χ Denaturing Solut1n 混勻，冰浴 5min ;再加 1.25mlAcid-Phenol:Chloroform潤(rùn)旋60s,室溫1000g離心5min,使混合液分層；吸取上層水相300 μ I加入375 μ I的無(wú)水乙醇,混勻J^Filter Cartridges柱子放到收集管中，將混合液加到柱子中，室溫1000g離心30s，棄液，將柱子放回收集管中；加700 μ ImiR WashSolut1nl到柱子中，室溫1000g離心30s，棄液，將柱子放回收集管中；加500 μ I WashSolut1n2/3到柱子中，室溫1000g離心30s，棄液，重復(fù)一次，室溫1000g空甩Imin棄去廢液，將柱子放回一新的收集管中；加100μ 195°C預(yù)熱的Elut1n Solut1n到柱子中；室溫1000g離心30s，所獲溶液即為RNA溶液。
[0027]3、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈:往EP管里面加入以下試劑:100mM dNTPs (with dTTP) 0.15 μ I, MultiScribe?Reverse Transcriptase, 50U/ μ L1.00 μ I, 10X ReverseTranscript1n Buffer1.50 μ I, RNase Inhibitor, 20U/μ L0.19 μ I, Nuclease-freewaterl.16 μ I, 5X RT primer has—miR—161.5 μ I, 5X RT primer has—miR—2141.5 μ I, 5X RTprimer has-miR-211.5 μ I, 5X RT primer has—miR—1951.5 μ 1，RM samp I e5.00 μ I昆勾，冰浴 5min，接著 16°C干浴 30min，42°C干浴 30min，85°C干浴 5min，_80°C保存 cDNA。
[0028]4、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR):用 TAQMAN UNIVERSAL MMIXII，NO UNG(LifeTech)進(jìn)行 PCR 反應(yīng)(20 μ I 體系):10μ I TaqMan2 X Universal PCR Master Mix,8 μ I Nuclease-freewater,I μ I cDNA,I μ I TaqManMicro-RNA Assay (X 20)；反應(yīng)條件:95 V 1min預(yù)變性，95 V 15s和60°C退火延伸，40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)在ABIPRISM7500Real-time 系統(tǒng)上完成。
[0029]5、采用SPSS21.0分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示。血清miRNA的表達(dá)量在乳腺癌組和對(duì)照組中的比較，miRNA的表達(dá)量和乳腺癌患者的臨床病理特征的關(guān)系均用兩個(gè)獨(dú)立樣本的Mann-Whitney U檢驗(yàn)。利用ROC曲線來(lái)確認(rèn)miR-21鑒別乳腺癌患者及健康者的診斷價(jià)值。P〈0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0030]統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果:
[0031]運(yùn)用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)方法分別檢測(cè)乳腺癌患者血清和正常人血清中的miR-214，miR-21和miR-195的表達(dá)量。這三個(gè)miRNA在血清中的表達(dá)量公式為:2_ACT，其中Λ CT = CTmiRNA-CTmiR-16，通過(guò)log2的正態(tài)性轉(zhuǎn)換得到-Λ CT, miR-214在乳腺癌患者血清及正常對(duì)照組血清中的表達(dá)量分別為-9.09±1.77，-9.45±1.24，miR-21在乳腺癌患者血清及正常對(duì)照組血清中的表達(dá)量分別為-3.40±1.92，-6.23±2.15，miR-195在乳腺癌患者血清及正常對(duì)照組血清中的表達(dá)量分別為-7.43±0.81，-7.49±2.06。
[0032]如圖1:miR-214,miR-21和miR-195在乳腺癌患者及健康人血清中的表達(dá)所示,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR-21在乳腺癌患者血清及正常對(duì)照組血清中的表達(dá)量有差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.01);而miR-214和miR195在乳腺癌患者和正常對(duì)照組血清中的表達(dá)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ρ>0.05)
[0033]如圖2:miR-21的ROC曲線所示，ROC曲線分析提示miR-21是一個(gè)用來(lái)區(qū)別健康人和乳腺癌患者較好的診斷指標(biāo)。ROC曲線下面積為0.828(95%的置信區(qū)間:0.697?0.958)，敏感性和特異性分別為80%和70%，相應(yīng)的診斷界值是0.0343 (2-ACT)。
[0034]通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)及分析篩選出在乳腺癌病例和健康女性對(duì)照中表達(dá)量差異程度大的一種血清miRNA，作為輔助乳腺癌診斷的指標(biāo)。最后篩選出與乳腺癌發(fā)病有關(guān)的血清miRNA為miR-21，其可以為乳腺癌的篩查和診斷提供數(shù)據(jù)支持。
[0035]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種與乳腺癌相關(guān)的血清微小核糖核酸標(biāo)志物，其特征在于，該標(biāo)志物為:miR-21。2.如權(quán)利要求1所述的與乳腺癌相關(guān)的血清微小核糖核酸標(biāo)志物在乳腺癌的輔助早期診斷中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種與乳腺癌相關(guān)的血清微小核糖核酸標(biāo)志物及其應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)血清標(biāo)本的準(zhǔn)備，總RNA的提取，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR），用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析等5個(gè)步驟，確定了一種新的與乳腺癌相關(guān)的血清微小核糖核酸標(biāo)志物，該標(biāo)志物可應(yīng)用于乳腺癌的輔助早期診斷。
【IPC分類(lèi)】C12Q1/68, C12N15/113
【公開(kāi)號(hào)】CN105200055
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410275342
【發(fā)明人】周偉民, 鐘婧, 戴利成
【申請(qǐng)人】湖州市中心醫(yī)院
【公開(kāi)日】2015年12月30日
【申請(qǐng)日】2014年6月19日