利用miR397a提高植物中酚類化合物含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程技術(shù)領(lǐng)域和遺傳育種領(lǐng)域，具體地說，設(shè)及一種利用miR397a 提高植物中酪類化合物含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參（SalviamiItiorrhizaBunge)的干燥根及根 莖，具有活血調(diào)經(jīng)、桂疲止痛的功效，臨床上可用于屯、腦血管疾病、癌癥及慢性肝炎、尿毒癥 等疾病的治療。目前世界上W丹參為原料的藥品和保健品在市場(chǎng)上所占份額越來越大，如 復(fù)方丹參滴丸、復(fù)方丹參注射液等近百種產(chǎn)品，已達(dá)到數(shù)百億元，且1997年復(fù)方丹參滴丸 成為第一個(gè)向美國(guó)FDAW治療藥身份申報(bào)的品種，表明丹參首例用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)的傳 統(tǒng)中藥，應(yīng)用前景十分廣闊。
[0003] 根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和理化性質(zhì)，可W將丹參的化學(xué)成分為兩類：一類為脂溶 性的丹參酬類化合物，如丹參酬（Tanshinone)I和丹參酬IIA等；一類為水溶性的酪酸類 化合物，如迷迭香酸和丹酪酸B等。其中，W丹參水溶性物質(zhì)為主的復(fù)方丹參注射液、丹參 素注射液等制劑越來越受到人們的歡迎。其中，丹參水溶性藥用成分中W丹酪酸B的含量 最高，2005年版和2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》均將丹酪酸B作為丹參藥材質(zhì)量控制 的指標(biāo)性成分；迷迭香酸具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解痛的功效，在植物中的分布較為廣泛，主要存在 于唇形科、紫草科、葫蘆科等多種植物中，且已經(jīng)研發(fā)成藥物，于1990年在德國(guó)投放市場(chǎng)； 原兒茶醒和丹參素在丹參中的含量也較高，具有很強(qiáng)的抗脂質(zhì)氧化、抗肝纖維化、改善尿毒 癥等作用，二者常作為丹參原藥材W及丹參制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)成分，也是丹參治療冠屯、 病的主要有效成分。
[0004] 近年來，隨著丹參藥材需求量的迅速增加和野生資源的減少，人工栽培丹參的品 質(zhì)良莽不齊，因此，如何從分子水平上提高丹參中酪類化合物的含量，培育優(yōu)質(zhì)品種已成為 丹參資源開發(fā)中新的研究方向。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家采用組織培養(yǎng)和細(xì)胞工程、非生 物誘導(dǎo)子誘導(dǎo)、基因工程技術(shù)等方式對(duì)提高丹參酪類物質(zhì)的含量進(jìn)行研究。通過組織培養(yǎng) 和細(xì)胞工程、非生物誘導(dǎo)子誘導(dǎo)提高的酪類物質(zhì)含量升幅不大，且隨著繼代次數(shù)的增加，含 量逐漸降低，穩(wěn)定性不高。采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高丹參中迷迭香酸和丹酪酸B的含量，僅為野 生型丹參干燥根中迷迭香酸和丹酪酸B含量的1. 15和1. 79倍，因此，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行 丹參品種的穩(wěn)定改良還有很大的提升空間。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]本發(fā)明的目的是提供一種利用miR397a穩(wěn)定提高植物，特別是丹參中酪類化合物 含量的方法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供miR397a在提高植物中酪類化合物含量中 的應(yīng)用。
[0007] 所述應(yīng)用具體為：在植物中過表達(dá)miR397a，獲得酪類化合物含量提高的轉(zhuǎn)基因 株系。
[0008] 前述的應(yīng)用，所述植物包括丹參。
[0009] 本發(fā)明還提供一種miR397a過表達(dá)載體，所述過表達(dá)載體上含有由強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng) 的miR397a基因cDNA序列（SeqIDNo. 1，下劃線為miR397a成熟體序列）。
[0010] 其中，所述過表達(dá)載體的出發(fā)載體為植物雙元表達(dá)載體（優(yōu)選為地1121)，所述強(qiáng) 啟動(dòng)子優(yōu)選為CaMV35S。
[0011] 本發(fā)明構(gòu)建的miR397a過表達(dá)載體CaMV35Sp: :miR397a的結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0012] 本發(fā)明還提供含有所述過表達(dá)載體的工程菌和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
[0013] 本發(fā)明還提供所述過表達(dá)載體在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種利用miR397a提高植物中迷迭香酸和丹酪酸B等酪類化合 物含量的方法，將所述過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入植物中獲得酪類化合物含量提高的轉(zhuǎn)基因植株。其 中，所述植物包括丹參。
[0015] 優(yōu)選地，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將所述過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入植物中。采用凍融法將過 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，具體步驟如下：
[0016] 1)將GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，待其融化后向管中加入2-6 iiL質(zhì)粒 CaMV35Sp: :miR397a，使其充分混勻后置于冰上5min，然后再將管放于液氮中速凍5min，完 成后迅速將管放于37°C的金屬浴中熱擊5min;
[0017] 2)完成后將上述混合液加入1血LB液體培養(yǎng)基中，28 °C慢速振蕩2-4h;
[0018] 3)將振蕩后的離屯、管取出，常溫下3000巧m離屯、4min，棄掉一部分上清液，留約 200yL菌液用涂布棒均勻涂在含化f和Kan(濃度分別為200mg/L和50mg/L)的LB固體平 板上，然后倒置放于28°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2地；
[0019] 4)在超凈工作臺(tái)中用已滅菌的槍頭從平板上挑選3-6個(gè)農(nóng)桿菌單菌落，分別加入 含LB液體培養(yǎng)及（含Rif和Kan)的離屯、管中，28°C振蕩過夜培養(yǎng)；
[0020] 5)用移液器將農(nóng)桿菌菌液吸取ImL加入1. 5mL干凈的離屯、管中，然后再向其中加 入已滅菌的0. 5mL甘油（濃度為50% )，充分混勻后保存于-80°C冰箱，用于后續(xù)植物轉(zhuǎn)化 實(shí)驗(yàn)。
[0021] miR397a是microRNA的一種，為長(zhǎng)度21bp的內(nèi)源性非編碼RNA，在植物進(jìn)化中高 度保守，具有重要的調(diào)控功能。丹參具有基因組小，染色體少，生長(zhǎng)條件簡(jiǎn)單，且已經(jīng)初步完 成基因組測(cè)序等特點(diǎn)，正在發(fā)展成為潛在的模式藥用植物，因此miR397a在丹參中的作用 研究對(duì)其他植物有一定的指導(dǎo)借鑒意義。
[0022] 用質(zhì)粒CaMV35Sp: :miR397a對(duì)丹參進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，具體方法如下：根據(jù)對(duì)993品 系丹參轉(zhuǎn)化體系的摸索，將ODe。。值為0. 5的農(nóng)桿菌ImL稀釋20倍侵染生長(zhǎng)狀態(tài)良好的丹 參葉片，侵染時(shí)間為5min，在SmTl固體培養(yǎng)基中25°C暗培養(yǎng)2天后，轉(zhuǎn)入SmT2固體培養(yǎng)基 25°C下光培養(yǎng)1化暗培養(yǎng)化，每10天繼代一次，直到長(zhǎng)出小芽，將小芽剪下，轉(zhuǎn)入SmT3固體 培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，直至培養(yǎng)成植株。
[0023]其中，SmTl培養(yǎng)基：MS+BAP1.Omg/L+NAA0.Img/L
[0024] SmT2培養(yǎng)基：MS+BAP1. Omg/L+NAA0.Img/L+Cef200mg/L+Kan50mg/L 陽0巧]SmT3培養(yǎng)基：1/2MS+Cef2〇Omg/L
[00%] 前述的方法，用于PCR鑒定轉(zhuǎn)基因植株的引物組合為：
[0027]miR397a-5F:5' -CGCACAATCCCACTATCCTTCGCAA-3'
[0028] miR397a-5R:5< -CGCTGCACTCAATGATGGTTCTCCA-3'
[0029]miR397a-3F:5' -GCCCAATGGTACCAGACAAGTCAA-3'
[0030]miR397a-3R:5< -CAAGACCGGCAACAGGATTCAATCT-3'
[0031] 利用UFLC-QTrap-MS/MS技術(shù)分別測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株（例如，轉(zhuǎn)基因丹參株系）的 根、莖和葉中酪類化合物的含量，結(jié)果顯示，與野生型植株相比，酪類化合物在轉(zhuǎn)基因植株 中的含量較野生型對(duì)照植株有不同程度的提高，尤W丹酪酸B和迷迭香酸含量提高程度較 大。
[0032] 本發(fā)明通過構(gòu)建miR397a過表達(dá)載體并獲得丹酪酸B和迷迭香酸等酪類化合物含 量提高的轉(zhuǎn)基因植株（例如，轉(zhuǎn)基因丹參株系1-7)，為更好地探討miR397a在酪類化合物生 物合成中的功能提供依據(jù)，同時(shí)也為植物的分子育種及品質(zhì)成因奠定了理論基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0033] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中構(gòu)建的過表達(dá)載體CaMV35Sp: :miR397a的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0034] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中miR397a轉(zhuǎn)基因丹參的PCR檢測(cè)電泳結(jié)果；A圖中M:DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；P:表達(dá)載體目的基因5'端序列的陽性克隆；1-7 :轉(zhuǎn)基因丹參株系1-7目的基 因的5'端序列；wt:野生型丹參植株陰性對(duì)照；B圖中M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；P:表達(dá)載體目 的基因3'端序列的陽性克隆；1-7 :轉(zhuǎn)基因丹參株系1-7目的基因的3'端序列；wt:野生型 丹參植株陰性對(duì)照。 陽03引圖3為本發(fā)明實(shí)施例4中miR397a在轉(zhuǎn)基因丹參葉中的表達(dá)；其中，橫坐標(biāo)1-7為miR397a轉(zhuǎn)基因丹參的7個(gè)株系，wt為野生丹參；縱坐標(biāo)為相對(duì)表達(dá)量。
[0036] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例5中丹參素、迷迭香酸、原兒茶醒、丹酪酸A和丹酪酸B對(duì)照 品的總離子流圖；其中，橫坐標(biāo)為出峰時(shí)間，縱坐標(biāo)為峰高。
[0037] 圖5A-圖