一種靶分子濃度的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測方法，特別是涉及一種靶分子濃度的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 高靈敏的生物檢測在疾病的診斷和治療（尤其是疾病發(fā)展的早期）、細(xì)菌病毒檢 測以及臨床基礎(chǔ)研究中具有重要意義。目前，基于熒光標(biāo)記的探測方法是實現(xiàn)較高靈敏檢 測的主要手段。在典型的商業(yè)化的標(biāo)記探測技術(shù)如生物芯片（chip array)、液相生物芯片 (suspension array)、酶聯(lián)免疫放大（ELISA)中，革E1分子首先被固定在探針分子功能化的基 質(zhì)表面，其后，具有強光學(xué)信號的熒光類分子或酶等對固定上的靶分子進(jìn)行標(biāo)記，測得的光 學(xué)信號強度與樣品中靶分子的濃度具有正相關(guān)性，從而實現(xiàn)其濃度測定。在這種標(biāo)記檢測 方法中，其中所用的熒光類標(biāo)志物光學(xué)亮度普遍偏低，光穩(wěn)定性差使其極易產(chǎn)生光致漂白 和淬滅，其探測極限一般都不低于10 13mol/L，雖然這些標(biāo)記檢測方法對于許多疾病檢測診 斷等具有一定的價值，但還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足以滿足一些高死亡率疾病的早期檢測需求。近年來，基 于單分子探測的高靈敏探測技術(shù)得到了人們極大的關(guān)注，并有望在檢測靈敏度上，大大超 越傳統(tǒng)的基于熒光強度信號的檢測模式。普通的單分子探測技術(shù)往往需要昂貴的儀器支 持，如配置有單光子探測能力的共聚焦熒光顯微鏡、全內(nèi)反熒光顯微鏡等，在成本上往往過 于昂貴，很難應(yīng)用于實際的高靈敏檢測中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了彌補上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提出一種靶分子濃度的檢測方法。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)問題通過以下的技術(shù)方案予以解決：
[0005] -種靶分子濃度的檢測方法，包括如下步驟：
[0006] (1)將第一探針分子偶聯(lián)到磁珠表面形成磁珠探針，將第二探針分子偶聯(lián)到標(biāo)記 粒子表面形成標(biāo)記探針；
[0007] (2)在反應(yīng)容器中，將所述磁珠探針和靶分子的溶液混合，所述靶分子與所述第一 探針分子反應(yīng)，所述靶分子被捕獲至所述磁珠探針的表面形成靶分子-磁珠探針復(fù)合物；
[0008] (3)將所述標(biāo)記探針加入所述反應(yīng)容器，所述靶分子與所述第二探針分子結(jié)合，形 成磁珠探針-靶分子-標(biāo)記探針復(fù)合物；
[0009] 或者分別將所述步驟（2)和（3)替換為如下步驟（2'）和（3'），
[0010] (2'）在反應(yīng)容器中，將所述標(biāo)記探針和靶分子的溶液混合，所述靶分子與所述第 二探針分子反應(yīng)，所述靶分子被捕獲至所述標(biāo)記探針的表面；
[0011] (3'）將所述磁珠探針加入所述反應(yīng)容器，所述靶分子與所述第一探針分子結(jié)合， 形成磁珠探針-靶分子-標(biāo)記探針復(fù)合物；
[0012] (4)將未參與反應(yīng)的所述標(biāo)記探針除去；
[0013] (5)在經(jīng)過步驟（4)后的反應(yīng)容器中加入洗脫液，使得所述磁珠探針-靶分子-標(biāo) 記探針復(fù)合物發(fā)生結(jié)構(gòu)解離，解離成所述磁珠探針、所述靶分子和所述標(biāo)記探針；
[0014] (6)吸取經(jīng)過步驟（5)后的溶液在載玻片上制成樣本，在顯微鏡下對所述標(biāo)記探 針進(jìn)行計數(shù)并計算所述溶液中總的標(biāo)記探針的數(shù)量，通過所述總的標(biāo)記探針的數(shù)量計算所 述革分子的濃度。
[0015] 優(yōu)選地，所述步驟（2)或者所述步驟（3'）中的所述磁珠探針的加入個數(shù)為105-10 7 個。
[0016] 優(yōu)選地，所述步驟（3)或者所述步驟（2'）中的所述標(biāo)記探針的加入個數(shù)為 1010-10 12 個。
[0017] 優(yōu)選地，所述步驟（5)中，所述洗脫液的加入量為10-100 iiL。
[0018] 優(yōu)選地，當(dāng)所述檢測方法按所述步驟（2)和步驟與（3)的順序進(jìn)行時，在所述步驟 (2)的反應(yīng)結(jié)束后，還包括如下步驟，然后再進(jìn)行所述步驟（3):
[0019] (A)在所述反應(yīng)容器外側(cè)引入磁鐵，使所述靶分子-磁珠探針復(fù)合物在所述磁鐵 一側(cè)聚集，吸取所述反應(yīng)容器中的液體而不帶走所述靶分子-磁珠探針復(fù)合物。
[0020] 經(jīng)過步驟（A)之后可以減小反應(yīng)體系的總體積，然后再進(jìn)行步驟（3)，能進(jìn)一步提 升后續(xù)反應(yīng)的效率。
[0021] 優(yōu)選地，所述步驟（4)具體為：在經(jīng)過步驟（3)或者（3'）反應(yīng)后的反應(yīng)容器中加 入PBS緩沖液，然后，在所述反應(yīng)容器外引入磁鐵，使所述磁珠探針-靶分子-標(biāo)記探針復(fù) 合物在所述磁鐵一側(cè)聚集，吸取所述反應(yīng)容器中的液體將所述未反應(yīng)的標(biāo)記探針除去，重 復(fù)操作直到所述未反應(yīng)的標(biāo)記探針完全除去。
[0022] 優(yōu)選地，在所述步驟（6)的吸取之前，還包括如下步驟：在經(jīng)過步驟（5)后的反應(yīng) 容器外引入磁鐵，將所述磁珠探針在所述磁鐵一側(cè)聚集。
[0023] 經(jīng)過以上技術(shù)方案，先將磁珠探針聚集后，溶液中磁珠探針的量減少后，再吸取溶 液，再進(jìn)行顯微鏡下計數(shù)，會更容易對標(biāo)記探針進(jìn)行計數(shù)，可以提高工作效率。
[0024] 優(yōu)選地，所述標(biāo)記粒子為貴金屬納米粒子、焚光微球或者上轉(zhuǎn)換納米晶。
[0025] 貴金屬納米粒子（如金納米球、金納米棒、金/銀復(fù)合納米粒子等），其吸收截面和 散射截面比普通的有機熒光分子高出3-5個量級，具有極高的信噪比，使其可用于諸多標(biāo) 記相關(guān)的高靈敏檢測，尤為重要的是，貴金屬納米粒子甚至可以在普通的暗場顯微鏡下輕 易實現(xiàn)單個顆粒的辨識；類似的可計數(shù)的單粒子標(biāo)志物還有熒光微球（其是將量子點、熒 光染料包覆進(jìn)入基質(zhì)微球形成的）和上轉(zhuǎn)換納米晶，其也能輕易的在熒光顯微鏡下實現(xiàn)單 個識別，這類可單個計數(shù)的粒子由于極高的信噪比，其探測成本相對于普通的單分子探測 器件要低得多。
[0026] 優(yōu)選地，所述靶分子為DNA分子或者蛋白質(zhì)。
[0027] 優(yōu)選地，所述貴金屬納米粒子為金納米球、金納米棒或金/銀復(fù)合納米粒子。
[0028] 本發(fā)明的有益效果還有：本發(fā)明中的標(biāo)記粒子與革E1分子具有 對應(yīng)關(guān)系，且標(biāo) 記粒子可以在顯微鏡下單個計數(shù)，對標(biāo)記粒子的計數(shù)即可實現(xiàn)靶分子的濃度測定，單個靶 分子也能產(chǎn)生可以識別的信號，相比于基于強度的探測方法中需要多個標(biāo)志物（對應(yīng)于靶 分子）才能產(chǎn)生可識別的信號具有明顯的靈敏度優(yōu)勢，此外，本發(fā)明的液相的反應(yīng)環(huán)境大 大優(yōu)化了靶分子的捕獲動力學(xué)過程，從而能使得更多的靶分子被捕獲到磁珠探針，有利于 靈敏度的進(jìn)一步提升。本發(fā)明是一種超靈敏的生物檢測方法，在本發(fā)明的一個實施例中， 以金納米棒為標(biāo)記探針對艾滋病毒的某種基因序列進(jìn)行檢測，其檢測濃度下限可以低至 1. 3X10 18mol/L〇【附圖說明】
[0029] 圖1是本發(fā)明的優(yōu)選實施例的反應(yīng)原理流程示意圖。
[0030] 圖2是本發(fā)明的優(yōu)選實施例中所用的金納米棒的SEM圖。
[0031] 圖3是本發(fā)明的優(yōu)選實施例中當(dāng)靶分子濃度為100nM時的磁珠探針-靶分子-標(biāo) 記探針復(fù)合物的SEM圖。
[0032] 圖4是本發(fā)明的優(yōu)選實施例中的金納米棒在暗場中的圖像的局部放大圖。
[0033] 圖5是本發(fā)明的優(yōu)選實施例中的靶分子濃度與金納米棒平均數(shù)目關(guān)系的定標(biāo)曲 線圖。
【具體實施方式】
[0034] 下面對照附圖并結(jié)合優(yōu)選的實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0035] 本發(fā)明提供一種靶分子濃度的檢測方法，包括如下步驟：
[0036] (1)將第一探針分子偶聯(lián)到磁珠表面形成磁珠探針，將第二探針分子偶聯(lián)到標(biāo)記 粒子表面形成標(biāo)記探針；
[0037] (2)在反應(yīng)容器中，將所述磁珠探針和靶分子的溶液混合，所述靶分子與所述第一 探針分子反應(yīng)，所述靶分子被捕獲至所述磁珠探針的表面形成靶分子-磁珠探針復(fù)合物；
[0038] (3)將所述標(biāo)記探針加入所述反應(yīng)容器，所述靶分子與所述第二探針分子結(jié)合，形 成磁珠探針-靶分子-標(biāo)記探針復(fù)合物；
[0039] 或者分別將所述步驟（2)和（3)替換為如下步驟（2'）和（3'），
[0040] (2'）在反應(yīng)容器中，將所述標(biāo)記探針和靶分子的溶液混合，所述靶分子與所述第 二探針分子反應(yīng)，所述靶分子被捕獲至所述標(biāo)記探針的表面；
[0041] (3'）將所述磁珠探針加入所述反應(yīng)容器，所述靶分子與所述第一探針分子結(jié)合， 形成磁珠探針-靶分子-標(biāo)記探針復(fù)合物；
[0042] (4)將未參與反應(yīng)的所述標(biāo)記探針除去；
[0043] (5)在經(jīng)過步驟（4)后的反應(yīng)容器中加入洗脫液，使得所述磁珠探針-靶分子-標(biāo) 記探針復(fù)合物發(fā)生結(jié)構(gòu)解離，解離成所述磁珠探針、所述靶分子和所述標(biāo)記探針；
[0044] (6)吸取經(jīng)過步驟（5)后的溶液在載玻片上制成樣本，在顯微鏡下對所述標(biāo)記探 針進(jìn)行計數(shù)并計算所述溶液中總的標(biāo)記探針的數(shù)量，通過所述總的標(biāo)記探針的數(shù)量計算所 述革分子的濃度。
[0045] 其中，標(biāo)記粒子是指在顯微鏡下可以單個計數(shù)的粒子。本發(fā)明的檢測原理流